朱 帆，李煥婷，王 弘，楊金易，徐振林，雷紅濤，肖治理，孫遠(yuǎn)明，沈玉棟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測番茄醬和果汁中異細(xì)交鏈孢菌酮酸

朱 帆，李煥婷，王 弘*，楊金易，徐振林，雷紅濤，肖治理，孫遠(yuǎn)明，沈玉棟*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

針對(duì)番茄醬和果汁中鏈格孢霉菌毒素污染問題，建立異細(xì)交鏈孢菌酮酸（iso-tenuazonic acid，ITeA）間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法。通過棋盤法和單因素試驗(yàn)確定最佳包被原質(zhì)量濃度為15.6 ng/mL、抗體質(zhì)量濃度為稀釋96 000 倍、緩沖體系pH 7.4、競爭反應(yīng)時(shí)間和二抗反應(yīng)時(shí)間分別為40 min和50 min。方法IC50為2.13 ng/mL，線性范圍為0.50～9.12 ng/mL，檢測限為0.10 ng/mL，與結(jié)構(gòu)功能類似物交叉反應(yīng)率均小于0.1%，樣品添加回收率在78.60%～110.83%之間，變異系數(shù)均小于15%。本方法適用于樣品中ITeA污染的特異性快速篩查。

毒素；異細(xì)交鏈孢菌酮酸；多克隆抗體；化學(xué)發(fā)光免疫分析；快速檢測

細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是鏈格孢霉、稻瘟病菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，具有急性、亞急性毒性，細(xì)胞毒性及潛在的致癌性[1-3]，其產(chǎn)毒能力極強(qiáng)，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局列入有毒化學(xué)物質(zhì)名冊(cè)[4]。異細(xì)交鏈孢菌酮酸（iso-tenuazonic acid，ITeA）是TeA的結(jié)構(gòu)類似物，均屬于鏈格孢霉四價(jià)酸類有毒代謝物，與TeA在毒理學(xué)上具有一定的相似性[5-7]，Qin Jianchun等[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體中ITeA和TeA的質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/mL時(shí)，咸水蝦的死亡率分別高達(dá)73.6%和68.9%。鏈格孢霉對(duì)生長環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，毒素對(duì)谷物、果蔬等農(nóng)產(chǎn)品污染情況呈現(xiàn)全球性頻發(fā)趨勢[9-13]。如，Asam等[14]研究發(fā)現(xiàn)ITeA在谷物食品、糖果中的含量達(dá)（75±8） μg/kg和（64±5） μg/kg。因此，開發(fā)靈敏準(zhǔn)確的ITeA檢測方法，對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品、食品的毒素污染監(jiān)測非常重要。

目前，ITeA的檢測方法主要是高效液相色譜-質(zhì)譜法[14-15]，該方法準(zhǔn)確可靠，常作為確證方法，但存在設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員、前處理復(fù)雜耗時(shí)、樣品通量低等不足。免疫檢測技術(shù)具有高通量、靈敏、快速等特點(diǎn)，可與高效液相色譜-質(zhì)譜法確證技術(shù)搭配應(yīng)對(duì)量大面寬的農(nóng)產(chǎn)品、食品安全快速篩查需求，近年來已成為研究熱點(diǎn)[16-17]。而采用化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLEIA）方法具有高靈敏度、操作簡單、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用于農(nóng)藥、獸藥、生物毒素等食品危害成分的快速檢測[18-21]。但是，有關(guān)ITeA的CLEIA快速檢測技術(shù)研究目前鮮見報(bào)道。因此，本研究基于抗原抗體特異反應(yīng)結(jié)合化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)，擬建立了ITeA的間接競爭CLEIA（indirect competitive CLEIA，icCLEIA）檢測方法，用于高效液相色譜法-質(zhì)譜確證前樣品的大批量篩查，簡便快速，對(duì)于實(shí)現(xiàn)食品中ITeA快速篩檢具有重要參考和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄醬、蘋果汁（廣州市購），經(jīng)驗(yàn)證為陰性樣品。

水合肼 阿拉丁試劑股份有限公司；ITeA、TeA、異細(xì)交鏈孢菌酮酸水合肼衍生物（ITeAH）、ITeAH卵清蛋白包被原（ITeAH-ovalbumin，ITeAH-OVA）、抗ITeAH單克隆抗體由實(shí)驗(yàn)室制備[22-13]；交鏈孢酚（alternariol，AOH）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol monomethylether，AME） 北京泰樂祺股份有限公司；封閉液化學(xué)發(fā)光液、增強(qiáng)液 廣州萬聯(lián)生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

96 孔化學(xué)發(fā)光板 深圳金燦華公司；DEM-3型自動(dòng)洗板機(jī) 北京拓普分析儀器有限公司；SupectraMax I型化學(xué)發(fā)光微孔板讀板機(jī) 美國MD公司。

1.3 方法

1.3.1 icCLEIA方法的建立

用0.1 mol/L pH 7.4碳酸鹽緩沖溶液將ITeAH-OVA稀釋到一定質(zhì)量濃度，100 μL/孔37 ℃包被過夜。用含0.05%吐溫的磷酸緩沖溶液洗滌2 次，加入封閉液（5%的脫脂奶粉水溶液）120 μL/孔，振蕩混勻，37 ℃孵育3 h；甩干孔中液體，37 ℃烘干備用。將適量ITeA標(biāo)品溶于氯仿中，加入過量水合肼振蕩反應(yīng)30 min，氮吹揮干氯仿，加入適量甲醇復(fù)溶至1 mg/mL，梯度稀釋成不同質(zhì)量濃度，50 μL/孔加入板孔，再加入稀釋后的抗體50 μL/孔，37 ℃孵育40 min，洗板5 次，加入100 μL/孔HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體；37 ℃孵育50 min；洗板5 次，加入化學(xué)發(fā)光底物液100 μL/孔，振蕩反應(yīng)1 min，測定相對(duì)發(fā)光值（relative light unit，RLU）。

1.3.1.1 包被抗原質(zhì)量濃度

RLUmax/IC50（RLUmax為最大相對(duì)發(fā)光值，IC50為半抑制濃度）越大，化學(xué)發(fā)光檢測方法的靈敏度和重復(fù)性越好[24]，因此，將RLUmax、IC50、RLUmax/IC50作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的綜合參考指標(biāo)。

將包被原稀釋32 000、64 000、128 000、192 000 倍，按照icCLEIA法步驟，測定并計(jì)算出相應(yīng)RLUmax和IC50，選取最佳包被質(zhì)量濃度。

1.3.1.2 抗體質(zhì)量濃度

在包被原質(zhì)量濃度確定的情況下，將抗體分別稀釋32 000、64 000、96 000、128 000 倍。按照1.3.1節(jié)步驟，測定并計(jì)算出相應(yīng)RLUmax和IC50，選取最佳抗體質(zhì)量濃度。

1.3.1.3 緩沖體系pH值

IteAH是一種烯醇式的化合物，其在弱酸性、中性、弱堿性中都可能有較好的溶解性，通過改變緩沖液的pH值，找出藥物溶解的最佳pH值；其次，抗體作為一種蛋白質(zhì)，其活性和穩(wěn)定性易受緩沖液的pH值影響，進(jìn)而導(dǎo)致分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性受到影響。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)體系pH 6.4、7.4、8.4對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響。

1.3.1.4 競爭反應(yīng)時(shí)間

分別考察了20、30、40、50 min 4個(gè)不同競爭反應(yīng)時(shí)間對(duì)靈敏度及穩(wěn)定性的影響。

1.3.1.5 二抗反應(yīng)時(shí)間

分別考察了不同二抗反應(yīng)時(shí)間（30、40、50、60 min）對(duì)抑制曲線的影響，比較不同競爭時(shí)間條件下IC50、RLUmax、RLUmax/IC50的變化，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最優(yōu)條件下，以ITeA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，RLU/RLU0為縱坐標(biāo)（RLU為添加藥物時(shí)的相對(duì)發(fā)光值，RLU0為不添加藥物時(shí)的相對(duì)發(fā)光值，即為RLUmax），用Origin 9.0軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ITeA的半抑制濃度（IC50）、線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）及檢測限（IC10）[25]。

1.3.3 特異性實(shí)驗(yàn)

采用交叉反應(yīng)率（cross-reactivity，CR）評(píng)價(jià)方法特異性，CR越大，特異性越差[26]。按照1.3.3節(jié)的方法分別繪制ITeA類似物的抑制曲線，并計(jì)算出相應(yīng)的CR見下式：

1.3.4 樣品前處理

番茄醬（蘋果汁）：取2 g（2 mL）樣品于15 mL離心管中，加5 mL氯仿振蕩提取2 次，4 629×g離心10 min，取上清液加入適量水合肼，振蕩反應(yīng)35 min后，氮吹吹干溶劑；加入1 mL H2O復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后稀釋30 倍后用于測定。

1.3.5 樣品添加回收

取2 g（2 mL）樣品，分別加入ITeA標(biāo)準(zhǔn)品250、50、25 ng/g（ng/mL），按照1.3.5節(jié)方法處理后，用CLEIA方法平行測定3 次。

1.3.6 高效液相色譜條件

色譜柱：SunFireTM-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；流動(dòng)相：A為含5 mmol/L甲酸銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 7.8），B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5 min，5% B；5～8 min，5%～45% B；8～25 min，45%～100% B；25～30 min，100% B；檢測波長：305 nm；出峰時(shí)間：21 min。

2結(jié)果與分析

2.1 CLIEA工作條件的確定

2.1.1 包被原質(zhì)量濃度的確定

圖1 包被原質(zhì)量濃度對(duì)CLEIA的影響Fig.1 Effect of coating antigen concentration on CLEIA

如圖1所示，隨著包被原質(zhì)量濃度逐漸降低，RLUmax均逐漸降低，IC50呈先降低后上升的趨勢。當(dāng)稀釋64 000 倍時(shí)，RLUmax/IC50最大，IC50最小，RLUmax適中。因此，確定最佳稀釋倍數(shù)為64 000 倍，此時(shí)的包被原質(zhì)量濃度為15.6 ng/mL。

2.1.2 抗體質(zhì)量濃度的確定

由圖2可以看出，抗體稀釋32 000 倍時(shí)，RLUmax/IC50最大，但RLUmax較大，IC50最大；因此，選擇稀釋96 000 倍作為最佳抗體稀釋倍數(shù)，此時(shí)RLUmax/IC50＞106，IC50較小，RLUmax適中，且此時(shí)抗體的用量更少。

圖2 抗體質(zhì)量濃度對(duì)CLEIA的影響Fig.2 Effect of antibody concentration on CLEIA

2.1.3 緩沖體系pH值的確定

圖3 緩沖溶液pH值對(duì)CLEIA的影響Fig.3 Effect of buffer pH on CLEIA

如圖3所示，隨著pH值升高，IC50先降低后上升，RLUmax/IC50逐漸上升；當(dāng)pH 7.4時(shí)，IC50最低，RLUmax/IC50較大，RLUmax適中；當(dāng)pH 8.4時(shí)，RLUmax/IC50最高，但其與當(dāng)pH 7.4時(shí)較為接近；綜上，選擇pH 7.4為最佳緩沖體系的pH值。

2.1.4 競爭反應(yīng)時(shí)間的確定

圖4 競爭反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLEIA的影響Fig.4 Effect of competitive reaction time on CLEIA

如圖4所示，隨著競爭反應(yīng)時(shí)間的延長，IC50呈先下降后上升趨勢，RLUmax、RLUmax/IC50先上升后下降；反應(yīng)40 min時(shí)，IC50最小，RLUmax/IC50最大。因此，選擇40 min為最佳競爭反應(yīng)時(shí)間。

2.1.5 二抗反應(yīng)時(shí)間的確定

如圖5所示，當(dāng)二抗反應(yīng)時(shí)間為50 min時(shí)，IC50最小，RLUmax/IC50最高，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，雖然RLUmax、RLUmax/IC50變化不大，但是IC50升高，因此，確定最佳二抗反應(yīng)時(shí)間為50 min。

圖5 二抗反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLEIA的影響Fig.5 Effect of secondary antibody reaction times on CLEIA

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以ITeA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，RLU/RLU0為縱坐標(biāo)建立ITeA的icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Origin 9.0擬合，計(jì)算得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.031+ 0.952 2/[1+（x/2.13）0.9530]，R2=0.999 6，該方法的IC50為2.13 ng/mL，線性范圍為0.50～9.12 ng/mL，方法檢測限為0.10 ng/mL。

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考察ITeA結(jié)構(gòu)功能類似物的CR，結(jié)果顯示CR小于0.1%（表1），說明建立的icCLEIA特異性良好。

表1 ITeA及其類似物與抗體的交叉反應(yīng)Table1 Cross-reactivity of ITeA and its analogues with antibody

2.4 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

向陰性樣品（番茄醬、蘋果汁）分別添加250、 50、20 ng的ITeA標(biāo)準(zhǔn)品，采用所建立的icCLEIA方法及高效液相色譜方法檢測并計(jì)算平均回收率及變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。表2顯示：icCLEIA方法的番茄醬、蘋果汁樣品的平均回收率分別為78.60%～93.30%和81.87%～110.83%，CV小于15%，高效液相色譜法的樣品回收率分別在80.50%～91.15%和79.40%～111.26%，CV小于15%。

表2 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)（n=3）Table2 Recoveries of spiked real samples (n= 3)

3 討 論

在免疫分析方法中，方法靈敏度和穩(wěn)定性主要取決于抗體原抗體間的特異性反應(yīng)及可逆性反應(yīng)是否達(dá)到平衡。本研究考察了包被原質(zhì)量濃度、抗體質(zhì)量濃度、緩沖溶液pH值、競爭反應(yīng)時(shí)間和二抗反應(yīng)時(shí)間對(duì)icCLEIA方法的影響。結(jié)果表明在抗原固相化的過程中，合適的抗原和抗體質(zhì)量濃度是影響反應(yīng)平衡的關(guān)鍵，質(zhì)量濃度過低則導(dǎo)致相互之間不能充分結(jié)合，反應(yīng)不完全，質(zhì)量濃度過高又容易造成多層吸附導(dǎo)致抗原決定簇的相互遮掩，從而對(duì)分析方法穩(wěn)定性和靈敏度造成影響；其次，抗體是一種活性蛋白，需要適宜質(zhì)量濃度的鹽離子及pH值維持其內(nèi)外滲透壓的平衡和抗體的活性；而且ITeA是一種烯醇式化合物，緩沖體系的pH值對(duì)其溶解性也會(huì)造成一定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳的緩沖溶液pH 7.4；最后，抗原抗體的反應(yīng)時(shí)間也是影響方法靈敏度的重要因素，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，方法的IC50均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致抗原抗體間的結(jié)合不完全，過長則容易造成非特異性吸附，因而只有合適的反應(yīng)時(shí)間才能使方法的靈敏度達(dá)到最佳。

4 結(jié)論

針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、食品中ITeA污染物，通過條件優(yōu)化，建立了其icCLEIA快速檢測方法，該方法IC50為2.13 ng/mL，線性范圍在0.50～9.12 ng/mL之間；果汁、番茄樣品添加回收率為78.60%～110.83%，CV小于15%，說明該方法準(zhǔn)確可靠，適用于高通量樣品種ITeA污染的快速篩檢。

參考文獻(xiàn)：

[1] OSTRY V. Alternaria mycotoxins: an overview of chemical characterization, producers, toxicity, analysis and occurrence in foodstuffs[J]. World Mycotoxin Journal, 2008, 1(2): 175-188. DOI:10.3920/WMJ2008.x013.

[2] SIEGEL D, MERKEL S, KOCH M, et al. Quantification of the alternaria mycotoxin tenuazonic acid in beer[J]. Food Chemistry, 2010, 120(3): 902-906. DOI:10.1016/J.Foodchem.2009.10.070.

[3] SMITH E R, FREDRICKSON T N, HADIDIAN Z. Toxic effects of the sodium and the N,N’-dibenzylethylenediamine salts of tenuazonic acid (NSC-525816 and NSC-82260)[J]. Cancer Chemotherapy Reports: Part 1, 1968, 52(5): 579-585.

[4] OSTRY V. Alternaria mycotoxins: an overview of chemical characterization, producers, toxicity, analysis and occurrence in foodstuffs[J]. World Mycotoxin Journal, 2008, 1(2): 175-188. DOI:10.3920/WMJ2008.x013.

[5] 強(qiáng)勝, 董云發(fā), 安傳福, 等. 紫莖澤蘭鏈格孢菌代謝物用于生物除草的方法: 1644046A[P]. 2005-10-03.

[6] GITTERMAN C O. Antitumor, cytotoxic, and antibacterial activities of tenuazonic acid and congeneric tetramic acids[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 1965, 8(4): 483-486. DOI:10.1021/jm00328a015.

[7] LEBRUN M H, NICOLAS L, BOUTAR M, et al. Relationships between the structure and the phytotoxicity of the fungal toxin tenuazonic acid[J]. Phytochemistry, 1988, 27(1): 77-84. DOI:10.1016/0031-9422(88)80594-6.

[8] QIN J C, ZHANG Y M, LING H, et al. Cytotoxic metabolites produced by Alternaria No. 28, an endophytic fungus isolated from Ginkgo biloba[J]. Natural Product Communications, 2009, 4(11): 1473-1476.

[9] MARINA E H M, KORN U. Alternaria mycotoxins in wheat: a 10 years survey in the Northeast of Germany[J]. Food Control, 2013, 34(1): 191-197. DOI:10.1016/j.foodcont.2013.04.018.

[10] ABRAMSON D, DELAQUIS P, SMITH D. Assessment of ochratoxin A and tenuazonic acid in Canadian ice-wines[J]. Mycotoxin Research, 2007, 23(3): 147-151. DOI:10.1007/BF02951511.

[11] STINSON E E, OSMAN S F, HEISLER E G, et al. Mycotoxin production in whole tomatoes, apples, oranges, and lemons[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1981, 29(4): 790-792. DOI:10.1021/jf00106a025.

[12] LI F Q, YOSHIZAWA T. Alternaria mycotoxins in weathered wheat from China[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(7): 2920-2924. DOI:10.1021/jf0000171.

[13] NOSER J, SCHNEIDER P, ROTHER M, et al. Determination of six alternariatoxins with UPLC-MS/MS and their occurrence in tomatoes and tomato products from the Swiss market[J]. Mycotoxin Research, 2011, 27(4): 265-271. DOI:10.1007/s12550-011-0103-x.

[14] ASAM S, LIU Y, KONITZER K, et al. Development of a stable isotope dilution assay for tenuazonic acid[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(7): 2980-2987. DOI:10.1021/jf104270e.

[15] ASAM S, RYCHLIK M. Potential health hazards due to the occurrence of the mycotoxin tenuazonic acid in infant food[J]. European Food Research and Technology, 2013, 236(3): 491-497. DOI:10.1007/ s00217-012-1901-x.

[16] 余振, 周雪林, 陳娟, 等. 食品安全檢測中的酶聯(lián)免疫技術(shù)應(yīng)用農(nóng)產(chǎn)品加工[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2014, 9(9): 59-61. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2014.09.019.

[17] 湯軼偉, 高子媛, 魏立巧, 等. 標(biāo)記免疫層析技術(shù)在食品安全檢測中應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2014, 5(7): 1913-1916.

[18] 金茂俊, 王靜, 楊麗華, 等. 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測中的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2014, 5(3): 840-844.

[19] FANG L, CHEN H, YING X, et al. Micro-plate chemiluminescence enzyme immunoassay for aflatoxin B1in agricultural products[J]. Talanta, 2011, 84(1): 216-222. DOI:10.1016/j.talanta.2011.01.021.

[20] WANG J, ZHENG L, DONG Y, et al. Establishment of enhanced chemiluminescent immunoassay formats for stanozolol detection in animal-derived foodstuffs and other matrices[J]. Food Analytical Methods, 2015, 9(5): 1284-1292. DOI:10.1007/s12161-015-0307-3.

[21] LIU X Y, LI A F, CHEN M, et al. Chemiluminescence assay of organophosphorous pesticides phoxin in vegetable[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2007, 35(12): 1809-1912.

[22] 王雅麗, 王鋒, 王弘, 等. 基于光譜法研究異細(xì)交鏈孢菌酮酸半抗原-抗體的相互作用[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(5): 25-30. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.5.005.

[23] 楊星星, 劉細(xì)霞, 王弘, 等. 細(xì)交鏈孢菌酮酸酶聯(lián)免疫吸附分析方法研究[J]. 分析化學(xué), 2012(9): 1347-1352. DOI:10.3724/ SP.J.1096.2012.11253.

[24] QUAN Y, ZHANG Y, WANG S, et al. A rapid and sensitive chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of fumonisin B1in food samples[J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 580(1): 1-8. DOI:10.1016/j.aca.2006.07.063.

[25] SUN W J, SHEN Y D, SUN Y M, et al. Determination of residues of chlorpromazine in pork by chemiluminescent enzyme immunoassay[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(9): 1397-1402. DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.20054.

[26] ZHANG W, HE L, ZHANG R, et al. Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of 6-benzylaminopurine and its ribose adduct in bean sprouts[J]. Food Chemistry, 2016, 207: 233-238. DOI:10.1016/ j.foodchem.2016.03.103.

Development of Indirect Competitive Chemiluminescene Enzyme Immunoassay (icCLEIA) Method for Determination of Iso-Tenuazonic Acid in Fruit Juice and Tomato Sauce

ZHU Fan, LI Huanting, WANG Hong*, YANG Jinyi, XU Zhenlin, LEI Hongtao, XIAO Zhili, SUN Yuanming, SHEN Yudong*
(Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

An indirect competitive chemiluminescene enzyme immunoassay (icCLEIA) for the rapid determination of isotenuazonic acid (ITeA) in fruit juice and tomato sauce was developed. The optimized experimental parameters were obtained as follows: the coating antigen concentration was 15.6 ng/mL, the antibody was diluted 96 000 folds, the buffer pH was 7.4, and the time of competition and anti-mouse IgG reaction were 40 and 50 min, respectively. The half maximal inhibitory concentration (IC50) of the proposed method was 2.13 ng/mL with limit of detection (LOD) of 0.10 ng/mL in the linear range from 0.50 to 9.12 ng/mL. The cross-reactivity with ITeA analogues was lower than 0.1%. The recoveries of ITeA from spiked samples ranged from 78.60% to 110.83%. The coeff i cient of variation was lower than 15%. This proposed icCLEIA provided an eff i cient method for rapid detection of ITeA in real samples.

mycotoxin; iso-tenuazonic acid (ITeA); polyclonal antibody; chemiluminescene enzyme immunoassay; rapid detection

10.7506/spkx1002-6630-201704040

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0250-05

朱帆, 李煥婷, 王弘, 等. 間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測番茄醬和果汁中異細(xì)交鏈孢菌酮酸[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 250-254. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704040. http://www.spkx.net.cn

ZHU Fan, LI Huanting, WANG Hong, et al. Development of indirect competitive chemiluminescene enzyme immunoassay (icCLEIA) method for determination of iso-tenuazonic acid in fruit juice and tomato sauce[J]. Food Science, 2017, 38(4): 250-254. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704040. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371769；31271866）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B040402006；2014A020219008；2014A050503059；2014A030311043）

朱帆（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：shipin3211@sina.com

*通信作者：王弘（1973—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c營養(yǎng)。E-mail：gzwhongd@163.com

沈玉棟（1977—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩治雠c傳感技術(shù)。E-mail：syd_tyx@163.com