王立梅，任清華，鄭麗雪，孫 姜，齊 斌，朱益波,*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.煙臺啤酒青島朝日有限公司，山東 煙臺 264000；3.中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司，江蘇 無錫 214000）

內(nèi)源性氧化脅迫促進釀酒酵母合成谷胱甘肽的潛在機制分析

王立梅1，任清華2，鄭麗雪1，孫 姜3，齊 斌1，朱益波1,*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.煙臺啤酒青島朝日有限公司，山東 煙臺 264000；3.中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司，江蘇 無錫 214000）

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性來研究釀酒酵母突變株高產(chǎn)谷胱甘肽的潛在機制。結(jié)果表明：突變株谷胱甘肽合成限速酶、抗氧化酶活力及其編碼基因表達(dá)量、過氧化氫和還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）含量顯著提高；丙酮酸激酶活力、丙酮酸、檸檬酸和琥珀酸含量顯著降低；此外，三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的基因表達(dá)量分別顯著下調(diào)和上調(diào)。因此，突變株可能在遭受內(nèi)源性活性氧過氧化氫的脅迫下，通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽合成限速酶活力加強了谷胱甘肽的合成，與抗氧化酶共同抵御氧化脅迫；丙酮酸激酶活力減弱降低了丙酮酸的合成，減少了三羧酸循環(huán)的通量，使得磷酸戊糖途徑通量增加，從而提高了NADPH含量，為谷胱甘肽的合成提供了充足的還原力。

谷胱甘肽；氧化脅迫；釀酒酵母；還原型輔酶Ⅱ

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一類普遍存在于生物體內(nèi)的活性小肽化合物[1-3]，具有解毒[4]、抗氧化[5]和增強免疫力[6]等多種生物學(xué)功能，能夠清除外源異物[7]，抵御由活性氧造成的氧化性損傷[8]以及增強白細(xì)胞的免疫功能[9]。隨著各種生物活性功能的不斷揭曉，GSH的應(yīng)用范圍也越來越廣泛[10-12]，國內(nèi)外的需求量日益增大，其中存在的巨大商業(yè)價值推動了GSH的工業(yè)化生產(chǎn)。

GSH主要的生產(chǎn)方法包括溶劑萃取法[13]、化學(xué)合成法[14]、酶轉(zhuǎn)化法[15]和微生物發(fā)酵法[16]。其中微生物發(fā)酵法是最高效最經(jīng)濟的GSH工業(yè)化生產(chǎn)方法。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是目前最常用的一種GSH微生物發(fā)酵菌株，胞內(nèi)GSH合成能力強，安全無毒。然而，普通的S. cerevisiae菌株GSH產(chǎn)量一般不足細(xì)胞干質(zhì)量的1%[17]，因此研究者不斷地通過一些物理和化學(xué)方法（紫外[18]、亞硝基胍[19]和γ-射線[20]等）對S. cerevisiae進行誘變處理從而篩選高產(chǎn)GSH的突變菌株。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指一門從整體層面上研究特定細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，主要建立在測序技術(shù)的基礎(chǔ)上。RNA高通量測序（RNA-Seq）是一種新的測序技術(shù)，能夠提供全面的轉(zhuǎn)錄組方面的信息，檢測靈敏，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高，樣品用量少，操作簡便[21]。從而為研究生物體在不同條件下的基因轉(zhuǎn)錄情況提供了便利、高效和功能強大的技術(shù)平臺。

在之前的研究中，以保藏的S. cerevisiae 2-10515為出發(fā)菌株，利用化學(xué)誘變劑亞硝基胍誘變篩選得到一株高產(chǎn)GSH的S. cerevisiae突變株Y518，本研究在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性來進一步研究突變株Y518高產(chǎn)GSH的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

S. cerevisiae 2-10515（出發(fā)菌株）和S. cerevisiae Y518（突變株）由蘇州食品生物技術(shù)重點實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

檸檬酸和琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；GSH和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）檢測試劑盒、過氧化氫檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GPX）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）測試盒、丙酮酸測試盒、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）測試盒、丙酮酸激酶測試盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒 德國Qiagen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

S. cerevisiae培養(yǎng)基[22]：酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀6 g/L、硫酸鉀3 g/L、硫酸銨5 g/L、硫酸鎂1.5 g/L，pH 6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本島津公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；TissueLyserⅡ高通量組織破碎儀 德國Qiagen公司；2100生物分析儀 美國Agilent公司；HiSeq 2000測序儀美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵

分別將活化好的出發(fā)菌株和突變株單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h，再將種子液等量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.3.2 GSH和GSSG含量測定

取發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液洗滌一次后按照GSH和GSSG檢測試劑盒說明書的要求利用酶標(biāo)儀進行測定，測定結(jié)果用mg/g細(xì)胞干質(zhì)量表示。細(xì)胞干質(zhì)量于105 ℃條件下烘干測定。

1.3.3 總RNA提取和高通量測序

菌體細(xì)胞用冷的DEPC水洗滌2 次并用液氮猝滅2 min，按照總RNA提取試劑盒說明書要求用高通量組織破碎儀破壁后提取總RNA。RNA高通量測序委托深圳華大基因研究院進行，原始數(shù)據(jù)已上傳GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi?acc=GSE47787）。具體步驟如下：總RNA樣品質(zhì)量經(jīng)生物分析儀檢測合格后進行cDNA文庫的構(gòu)建；cDNA文庫構(gòu)建合格后利用測序儀進行序列鑒定，測序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)過去雜處理轉(zhuǎn)換成clean reads用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析；利用SOAP2序列比對軟件將獲得的clean reads與S. cerevisiae S288c參考基因序列進行比對計算基因表達(dá)量并篩選出差異表達(dá)基因（上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)不小于1），后續(xù)分析中Gene Ontology（GO）和KEGG Pathway顯著性富集分析都是基于差異表達(dá)基因進行的；GO功能顯著性富集分析能夠篩選出差異表達(dá)基因顯著富集的GO功能條目，并鑒定出這些差異表達(dá)基因參與哪些生物學(xué)功能；KEGG Pathway顯著性富集分析能夠篩選出差異表達(dá)基因顯著性富集的通路，從而了解這些差異表達(dá)基因主要參與的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.3.4 過氧化氫和抗氧化酶活力測定

過氧化氫和抗氧化酶（SOD、CAT和GPX）活力分別參照各自的檢測試劑盒說明書在酶標(biāo)儀上進行測定。1.3.5 γ-GCS活力、丙酮酸激酶活力、NADPH和丙酮酸含量測定

γ-GCS活力、丙酮酸激酶活力、NADPH和丙酮酸含量按照各自測試盒說明書的要求在分光光度計上進行測定。

1.3.6 檸檬酸和琥珀酸含量測定

利用高效液相色譜法測定檸檬酸和琥珀酸的含量[23]，分析條件為：分離柱Shim-pack VP-ODS C18、流動相0.5%磷酸氫二銨、流速0.8 mL/min，進樣量20 μL、柱溫25 ℃、檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH產(chǎn)量

圖1 Y518和2-10515胞內(nèi)GSH（A）和GSSG（B）含量Fig.1 Intracellular GSH (A) and GSSG (B) contents of the mutant Y518 and the parent strain 2-10515

Y518 GSH含量在前48 h逐漸增加，48～60 h有所降低（圖1A），GSSG含量逐漸減少（圖1B），說明隨著發(fā)酵時間的延長有部分GSSG逐漸轉(zhuǎn)化成GSH；2-10515 GSH和GSSG含量均逐漸降低（圖1），說明兩者之間的轉(zhuǎn)化保持平衡；而在一個完整的發(fā)酵周期內(nèi)，Y518 GSH產(chǎn)量比2-10515提高了約55%，表明突變株胞內(nèi)積累GSH的能力比出發(fā)菌株強。為了進一步揭示突變株Y518胞內(nèi)GSH合成增強的機制，進行了以RNA-Seq為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

2.2 GO功能顯著性富集分析

RNA-Seq共鑒定篩選出1 628 個差異表達(dá)基因，對這些差異表達(dá)基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)在分子功能類群下有6 個差異表達(dá)基因參與抗氧化活性功能（圖2）。GPX2/HYR1編碼GPX，CTT1編碼CAT，TRR1/TRR2編碼硫氧還蛋白還原酶，它們能夠催化清除過氧化氫；而SOD1編碼Cu/Zn SOD，能夠催化清除超氧陰離子自由基。Y518的這6 個基因中除了TRR1下調(diào)外其余均顯著上調(diào)（表1），表明Y518胞內(nèi)可能存在氧化脅迫。

圖2 GO功能顯著性富集分析Fig.2 GO functional enrichment analysis

表1 Y518參與抗氧化活性功能的差異表達(dá)基因Table1 Up- or down-regulated expression of antioxidant enzyme gens in Y518 relative to 2-10515

2.3 KEGG Pathway顯著性富集分析

表2 Y518上調(diào)的磷酸戊糖途徑基因表達(dá)量Table2 Up-regulated expression of genes involved in the pentose phosphate pathway in Y518 relative to 2-10515

表3 Y518下調(diào)的三羧酸循環(huán)基因表達(dá)量Table3 Down-regulated expression of genes involved the citrate cycle pathway in Y518 relative to 2-10515

為了進一步了解這些差異表達(dá)基因在代謝途徑里的變化情況，對差異表達(dá)基因進行KEGG Pathway分析，結(jié)果顯示磷酸戊糖通路基因顯著上調(diào)（上調(diào)倍數(shù)不小于2）（表2），而三羧酸循環(huán)通路基因顯著下調(diào)（下調(diào)倍數(shù)不小于2）（表3），表明磷酸戊糖途徑的通量可能加強而三羧酸循環(huán)的通量可能減弱。GO和KEGG Pathway顯著性富集分析都是基于基因?qū)用孢M行的分析，并不能完全說明突變株高產(chǎn)GSH的表觀現(xiàn)象，所以進行了一些生理生化特性方面的研究。

2.4 GSH合成限速酶活力變化

圖3 Y518和2-10515 GSH合成限速酶活力變化Fig.3 The activities of rate-limiting enzymes for GSH synthesis of Y518 and 2-10515

γ-GCS是催化合成GSH反應(yīng)的限速酶[24]，其活力強弱直接影響GSH的產(chǎn)量。如圖3所示，在發(fā)酵過程中，Y518和2-10515的γ-GCS活力均呈現(xiàn)出下降的趨勢，6～24 h，Y518的γ-GCS活力高于2-10515，48 h略低于2-10515。整體而言，Y518的γ-GCS活力顯著高于2-10515，說明Y518 GSH產(chǎn)量的提高和γ-GCS活力的增強有關(guān)。

2.5 抗氧化酶活力和過氧化氫含量變化

圖4 Y518和2-10515抗氧化酶活力和胞內(nèi)過氧化氫含量變化Fig.4 Antioxidant enzymes activities and intracellular hydrogen peroxide contents of Y518 and 2-10515

SOD[25]、CAT[26]和GPX[27]是細(xì)胞防御體系重要的抗氧化酶，能夠催化氧化還原反應(yīng)清除活性氧，抵御氧化性損傷。Y518 SOD活力在6～24 h逐漸增加，24～48 h下降，而2-10515 SOD活力則變化很?。▓D4A）；兩者CAT的活力變化趨勢一致，都是從6～12 h增加，12～48 h逐漸下降（圖4B）；兩株菌GPX的活力在6～48 h都呈下降趨勢（圖4C）。在整個發(fā)酵過程中，Y518的3 種酶活力均顯著高于2-10515，而之前的研究中發(fā)現(xiàn)Y518胞內(nèi)活性氧水平顯著高于出發(fā)菌株2-10515[28]，表明Y518胞內(nèi)存在由活性氧引起的氧化脅迫，GO功能顯著性富集分析顯示，參與抗氧化活性功能的6 個差異表達(dá)基因中有5 個基因的主要功能是清除活性氧過氧化氫，因此繼續(xù)測定突變株和出發(fā)菌株胞內(nèi)過氧化氫的含量，結(jié)果顯示，Y518胞內(nèi)過氧化氫含量幾乎是2-10515的兩倍多（圖4D），因此，Y518可能遭受由活性氧過氧化氫引起的內(nèi)源性氧化脅迫，從而啟動抗氧化酶和提高GSH含量來抵御氧化性損傷[29]。

2.6 NADPH含量變化

圖5 Y518和2-10515胞內(nèi)NADPH含量變化Fig.5 Intracellular NADPH contents of Y518 and 2-10515

如圖5所示，Y518胞內(nèi)NADPH顯著高于2-10515，能夠為Y518轉(zhuǎn)化GSSG生成GSH提供充足的還原力[30]。而NADPH主要產(chǎn)生于磷酸戊糖途徑，通過KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，相對于2-10515，Y518磷酸戊糖途徑整體基因表達(dá)量顯著上調(diào)（表2），通量增加，因此，Y518胞內(nèi)NADPH含量的提高可能是由于磷酸戊糖途徑通量增加導(dǎo)致的。

2.7 丙酮酸激酶活力和丙酮酸含量變化

圖6 Y518和2-10515丙酮酸激酶活力（A）和胞內(nèi)丙酮酸含量（B）變化Fig.6 Pyruvatekinase activities (A) and intracellular pyruvate contents (B) of Y518 and 2-10515

丙酮酸激酶催化糖酵解途徑最后一步將磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，而丙酮酸又是進入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵代謝物，Y518丙酮酸激酶活力和胞內(nèi)丙酮酸含量均顯著低于2-10515（圖6），說明Y518減弱了丙酮酸激酶活力從而減少了丙酮酸的生成，這有可能會降低三羧酸循環(huán)的通量[31]。

2.8 檸檬酸和琥珀酸含量變化

圖7 Y518和2-10515胞內(nèi)檸檬酸（A）和琥珀酸（B）含量變化Fig.7 Intracellular contents of citrate (A) and succinate (B) of Y518 and 2-10515

KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，Y518三羧酸循環(huán)整體基因表達(dá)量顯著下調(diào)（表3），而重要中間產(chǎn)物檸檬酸和琥珀酸含量也顯著減少（圖7），說明三羧酸循環(huán)的通量的確降低，而糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑是互補的兩個通路，所以磷酸戊糖途徑通量的增加可能是三羧酸循環(huán)通量降低導(dǎo)致的[31]。

2.9 突變株Y518高產(chǎn)GSH的機制

圖8 Y518高產(chǎn)GSH的機制Fig.8 Mechanism underlying glutathione oversynthesis in Y518

從圖8可以看出，過氧化氫含量的提高產(chǎn)生了氧化脅迫，Y518增強了抗氧化酶的活力，提高了胞內(nèi)還原力，增加了GSH的含量，共同抵御氧化脅迫。

3 結(jié) 論

以亞硝基胍誘變篩選出的一株高產(chǎn)G S H的Saccharomyces cerevisiae突變株Y518為研究對象，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性初步探索了突變株高產(chǎn)GSH的潛在機制。研究表明突變株Y518胞內(nèi)可能存在由活性氧過氧化氫引起的氧化脅迫，從而啟動了一系列的防御機制來維持胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的平衡。一方面通過增強GSH合成限速酶的活力促進GSH合成來抵御氧化脅迫；另一方面通過增加磷酸戊糖途徑的通量加強NADPH的產(chǎn)生為GSSG轉(zhuǎn)化成GSH提供充足的還原力。

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Elucidation of the Underlying Mechanism by Which Endogenous Oxidative Stress Promotes Glutathione Synthesis of Saccharomyces cerevisiae

WANG Limei1, REN Qinghua2, ZHENG Lixue1, SUN Jiang3, QI Bin1, ZHU Yibo1,*
(1. College of Biological and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. Yantai Beer Tsingtao Asahi Co. Ltd., Yantai 264000, China; 3. Wuxi Ocean Engineering Equipment Co. Ltd. of Zhonghai Ocean, Wuxi 214000, China)

The potential mechanism for glutathione oversynthesis in the Saccharomyces cerevisiae mutant Y518 was researched using transcriptome analysis combined with physiological and biochemical characteristics. The results indicated that the rate-limiting enzyme of glutathione synthesis, antioxidant enzymes activities and the expression levels of their encoding genes, and the contents of hydrogen peroxide and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) were signif i cantly increased in the mutant whereas pyruvatekinase activity, the contents of pyruvate, citrate and succinate were markedly decreased. Besides, the expression levels of genes involved in the citrate cycle were significantly down-regulated while those involved in the pentose phosphate pathway were signif i cantly up-regulated. Therefore, under endogenous oxidative stress, the mutant might strengthen the synthesis of glutathione by adjusting the activities of rate-limiting enzymes of glutathione synthesis to defend against oxidative stress together with the antioxidant enzymes. Meanwhile, weakened pyruvatekinase activity decreased pyruvate generation, which led to declined citrate cycle fl ux and increased NADPH production by the pentose phosphate pathway and consequently provided appropriate reducing power for glutathione biosynthesis.

glutathione; oxidative stress; Saccharomyces cerevisiae; NADPH

10.7506/spkx1002-6630-201704005

Q815

A

1002-6630（2017）04-0026-06

王立梅, 任清華, 鄭麗雪, 等. 內(nèi)源性氧化脅迫促進釀酒酵母合成谷胱甘肽的潛在機制分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 26-31. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704005. http://www.spkx.net.cn

WANG Limei, REN Qinghua, ZHENG Lixue, et al. Elucidation of the underlying mechanism by which endogenous oxidative stress promotes glutathione synthesis of Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2017, 38(4): 26-31. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704005. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171758）

王立梅（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wlmqb@126.com

*通信作者：朱益波（1980—）男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：centuryrain@cslg.edu.cn