周桂，鄒成林，丘立杭，，劉小霞，毛江江，楊麗濤，李楊瑞，*

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530008；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，南寧530007；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

三種甘蔗葉片蛋白質(zhì)分離純化方法比較及雙向電泳體系優(yōu)化

周桂1，鄒成林2，丘立杭2，3，劉小霞1，毛江江1，楊麗濤3，李楊瑞2，3*

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530008；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，南寧530007；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

為了優(yōu)化適用于甘蔗葉片蛋白質(zhì)的分離純化方法與雙向凝膠電泳體系，比較了3種蛋白質(zhì)分離純化方法對甘蔗葉片蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜、蛋白質(zhì)提取率以及雙向凝膠電泳的影響,同時(shí)優(yōu)化了雙向電泳條件。結(jié)果顯示，SDS提取法的SDS-PAGE電泳圖譜中條帶較少，蛋白質(zhì)沉淀雜質(zhì)多,效果差；三氯乙酸/丙酮沉淀法蛋白質(zhì)沉淀得率高，但沉淀復(fù)溶性差，蛋白質(zhì)溶液濃度低，難于滿足雙向電泳大膠的高上樣量要求；酚抽提法蛋白質(zhì)沉淀得率雖低，但沉淀純度高、復(fù)溶性好，蛋白質(zhì)溶液濃度高，是適合雙向電泳分離純化甘蔗葉片蛋白質(zhì)的理想方法。酚抽提法蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳合適的膠條pH范圍為4～7，17 cm大膠合適的上樣量為800 μg，平均可分離出954個(gè)蛋白點(diǎn)。

甘蔗葉片；蛋白質(zhì)純化；SDS-PAGE；雙向凝膠電泳；條件優(yōu)化

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是后基因組時(shí)代系統(tǒng)研究生物功能基因的有效手段[1-2]，而雙向凝膠電泳（twodimensional protein electrophoresis，2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[3-4]。該技術(shù)自1975年由O’Farrell[5]首次建立以來，目前已成為從復(fù)雜系統(tǒng)中分離檢測蛋白的有效手段，其主要包括蛋白質(zhì)的提取純化、等電聚焦（isoelectrofocusing，IEF）、SDS-PAGE、凝膠染色、圖像分析等步驟。其中蛋白質(zhì)的提取尤為重要,尤其植物組織中富含的色素、酚等次生代謝產(chǎn)物會(huì)對蛋白質(zhì)的提取與電泳分離產(chǎn)生嚴(yán)重干擾[6-8]。適于雙向電泳分離的植物組織蛋白質(zhì)提取方法主要有十二烷基硫酸鈉（SDS）提取法、三氯乙酸（trichlomacetic acid，TCA）/丙酮沉淀法和酚抽提法等[9-11]，但不同的材料以及不同的研究目標(biāo)需要采取不同的蛋白質(zhì)提取與分離策略。因此，不同材料或特殊目標(biāo)需要針對不同來源的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取與雙向凝膠電泳條件的優(yōu)化。

甘蔗是廣西的特色與優(yōu)勢作物，甘蔗產(chǎn)業(yè)是廣西的支柱產(chǎn)業(yè)，目前有關(guān)甘蔗蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道還較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用3種不同方法提取蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳與雙向電泳分析，優(yōu)化甘蔗葉片蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)體系，為進(jìn)一步開展甘蔗葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗（Saccharum officinarum L.）品種新臺(tái)糖22號，溫室育苗至5～6片葉時(shí)采取+1葉于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

IPG膠條（IPG Strip）、IPG buffer為Bio-Rad公司產(chǎn)品；3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇購自Sigma公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、碘乙酰胺、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺（TEMED）、過硫酸銨（Ammonium persulfate，AP）、硫脲、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）等均購自AMRESCO公司；考馬斯亮藍(lán)G250、甘氨酸、40%丙烯酰胺單體、Tris-飽和酚（pH 7.5）、甘油、低熔點(diǎn)瓊脂糖等試劑均購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

雙向電泳系統(tǒng)為：等電聚焦儀Protean IEF Cell，電泳儀PowerPac Universal Power Supply（Bio-Rad）、電泳槽Mini PROTEAN Tetra Cell（Bio-Rad）、Protein II（Bio-Rad）；凝膠掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer（BIO-RAD），圖像分析軟件為Quantity One和PDQuest（Bio-Rad）；離心機(jī)為5810R（德國Eppendorf）和Mikro 200R（德國HETTICH）。

1.2 總蛋白的提取與分離純化

SDS提取法：準(zhǔn)確稱取2 g甘蔗葉片，迅速用液氮研磨成粉狀，將粉狀樣品轉(zhuǎn)入50 mL預(yù)冷離心管中，加入10 mL預(yù)冷提取液（0.25 mol/L Tirs-HCl pH 7.5，50 mmol/L EDTA-Na2，2%SDS，2%PVPP，2%DTT），渦旋、振蕩處理5 min，12000 r/min，4℃離心20 min后取上清，上清中加入1/4體積50%TCA/丙酮溶液，4℃沉淀2 h以上，12000 r/min，4℃離心20 min后棄上清，沉淀用4倍體積的冷丙酮洗滌3次，冷凍干燥后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法：準(zhǔn)確稱取2 g甘蔗葉片液氮速凍，迅速用液氮研磨成粉狀，加入0.2 g PVPP，分次加入-20℃預(yù)冷的10%TCA/丙酮溶液15 mL冰浴研磨勻漿10 min后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，-20℃靜置過夜，4℃，12000 r/min離心20 min取沉淀，沉淀用冷丙酮（含0.07%β-巰基乙醇）洗滌1～2次，沉淀冷凍，凍干燥后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酚抽提法參照文獻(xiàn)[12]采用Tris-飽和酚萃取蛋白質(zhì)，然后用乙酸銨的甲醇溶液沉淀酚層中的蛋白質(zhì)。

1.3 蛋白質(zhì)溶解與定量

將蛋白質(zhì)干粉加入2.5 mL蛋白溶解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，1%IPG buffer，40 mmol/ L DTT，5 mmol/L EDTA-Na2，1 mmol/L PMSF）復(fù)溶振蕩讓其充分分散，于30℃水浴超聲溶解1 h，然后12000 r/min，20 min離心取上清，采用Bradford法[13]進(jìn)行定量測定。

1.4 電泳

1.4.1 SDS-PAGE電泳SDS-PAGE電泳采用4%的濃縮膠，12%分離膠，凝膠厚度為1 mm，電極緩沖液為Tris-甘氨酸（pH=8.3）系統(tǒng)。樣品溶液按一定比例與上樣緩沖液（15%甘油，2%SDS，62.5 mmol/L Tris-HCl pH6.8，5%β-巰基乙醇，0.001%溴酚蘭）混合，振蕩混勻，95℃加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，離心10 min后取上清上樣，上樣量20 μg，恒流模式（20 mA/gel）電泳，電泳完畢采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色。待充分染色觀察到明顯的條帶條紋時(shí)可終止染色。脫色液用20%甲醇和10%乙酸進(jìn)行脫色，在此過程中不斷更換脫色液，把膠面的底色全部脫掉，至條帶條紋清晰明朗而止。

1.4.2 雙向電泳將蛋白質(zhì)溶解液與上樣水化緩沖液（8 mol/L尿素、2%CHAPS、2%IPG buffer、40 mmol/L DTT和0.001%溴酚藍(lán)）混合，調(diào)節(jié)上樣體積為125 μL（7 cm小膠）和300 μL（17 cm大膠），混勻后將上樣液加入到等電聚焦盤，然后將IPG膠條膠面向下放入槽內(nèi)，加適量覆蓋油覆蓋膠條表面后進(jìn)行等電聚焦（IEF）電泳，聚焦溫度為18℃，每根膠條限流50 μA。聚焦結(jié)束后，分別用含2%DTT和2.5%的碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液（6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mmol/L Tris-HCl pH8.8，20%甘油）平衡膠條各15 min后將膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE凝膠上方，進(jìn)行第二向SDS-PAGE恒流模式（20 mA/gel）電泳，電泳完畢采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色。

1.5 凝膠圖像處理與分析

脫色后的凝膠用臺(tái)式凝膠掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer（BIO-RAD）進(jìn)行數(shù)字化處理。掃描圖像與凝膠大小比例為1∶1。應(yīng)用Quantity Qne軟件對SDS-PAGE電泳圖譜進(jìn)行處理與分析，用PDQuest 8.0分析軟件分析處理雙向電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白質(zhì)提取方法的比較

3種方法提取的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示，Quantity Qne軟件分析可知，SDS提取液提取法、TCA/丙酮沉淀法以及酚抽提法可分離出的蛋白質(zhì)條帶分別為18條、28條、與29條。SDS提取液提取法直接提取法電泳圖譜中條帶較少且比較模糊，說明樣品中影響電泳的鹽離子濃度較高或蛋白質(zhì)有所降解。

而TCA/丙酮沉淀法以及酚抽提法的SDS-PAGE電泳效果較好，所得蛋白質(zhì)條帶數(shù)目相近，條帶分布也相似，TCA/丙酮沉淀法在分離分子量為18.4～25.0 kμ范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)效果稍好于酚抽提法，但各方法所獲得的蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量、沉淀溶解性與提取率之間差別較大。

圖1 不同蛋白質(zhì)提取方法的甘蔗葉蛋白質(zhì)12%分離膠SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 The protein profiles produced by 12%separating gels of SDS-PAGE,extracted from sugarcane leaves with different methods

表1 不同蛋白質(zhì)提取方法對甘蔗葉蛋白質(zhì)提取效果比較Table 1 Comparison of sugarcane leaf protein extraction results with different methods

如表1所示，SDS提取法蛋白質(zhì)沉淀顏色深，狀態(tài)粘稠，雜質(zhì)多，給后續(xù)的沉淀洗滌與純化帶來困難；TCA/丙酮沉淀法蛋白質(zhì)沉淀為黃白色粉狀、沉淀得率顯著高于SDS提取法與酚抽提法（P＜0.05），但含有許多不溶解性雜質(zhì)；而酚抽提法沉淀得率與SDS提取法無顯著差異（P＞0.05），但蛋白質(zhì)沉淀為白色粉狀，雜質(zhì)少，有利于后續(xù)的復(fù)溶。

采用同量的溶解液溶解蛋白質(zhì)沉淀，酚抽提法獲得的蛋白質(zhì)溶液濃度顯著高于SDS提取法與TCA/丙酮沉淀法（P＜0.05），濃度達(dá)到（5.13±0.24）μg/μL，可以滿足雙向電泳上樣量要求；TCA/丙酮沉淀法獲得的蛋白質(zhì)溶液濃度最低，濃度為酚抽提法的56.7%，說明采用TCA/丙酮沉淀法獲得的蛋白質(zhì)沉淀得率雖然高，但沉淀雜質(zhì)多、復(fù)溶性差。

從蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜、蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量、狀態(tài)、復(fù)溶性以及蛋白質(zhì)提取率綜合分析，酚抽提法是較理想的方法。

2.2 不同蛋白質(zhì)提取方法的雙向電泳圖譜比較

圖2為TCA/丙酮法與酚抽提法提取的蛋白質(zhì)采用7 cm膠條，上樣量為200 μg條件下的雙向電泳圖譜，圖譜經(jīng)過PDQuest 8.0分析軟件分析，TCA/丙酮沉淀法與酚抽提法分別檢測出232±11與409±13個(gè)點(diǎn)。

TCA/丙酮沉淀法作為一種雙向電泳蛋白質(zhì)提取的常用方法，獲得的蛋白質(zhì)經(jīng)過洗滌除雜、復(fù)溶后獲得的雙向電泳圖譜的分離效果也基本可行，但由于蛋白質(zhì)的復(fù)溶性差，造成蛋白質(zhì)丟失嚴(yán)重，檢出蛋白點(diǎn)只有酚抽提法的56.7%。所以酚抽提法是適合于甘蔗葉蛋白質(zhì)雙向電泳分析的蛋白質(zhì)提取方法。

圖2 TCA/丙酮法與酚抽提法甘蔗葉蛋白質(zhì)雙向電泳分析Fig.2 2-DE analysis of protein from sugarcane leaves extracted with TCA/acetone precipitation and phenol extraction methods a:TCA/丙酮法TCA/acetone precipitation；b：酚抽提法phenol extraction

2.3 酚抽提法雙向電泳分離甘蔗葉蛋白質(zhì)體系優(yōu)化

IPG膠條可以在很廣的pH范圍進(jìn)行IEF電泳，從pI值為3的強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)到pI值為10的強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)，有不同的pH范圍可供選擇。實(shí)驗(yàn)將酚抽提法純化的蛋白質(zhì)采用7 cm長，pH 3～10的膠條進(jìn)行雙向電泳分離，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，酚抽提法純化的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）主要集中分布在4～7的范圍，由于采用了pH 3～10的膠條，造成蛋白質(zhì)斑點(diǎn)擁擠，分離效果差，蛋白質(zhì)聚集拖尾嚴(yán)重，而采用pH 4～7窄pH范圍的膠條分離則改善了蛋白質(zhì)的分離效果（圖3b）。

IEF電泳是在超高壓下蛋白質(zhì)不斷移動(dòng)聚焦到其等電點(diǎn)處。IEF電泳參數(shù)的設(shè)置直接影響到聚焦效果。表2是針對7 cm與17 cm膠條優(yōu)化設(shè)置的等電聚焦電泳參數(shù)。

圖3 酚抽提法甘蔗葉蛋白質(zhì)7 cm長不同pH范圍膠條的雙向電泳分析Fig.3 2-DE analysis of proteins from sugarcane leaves in 7 cm and pH 3-10 IPG strip by phenol extraction method

表2 IPG膠條的等電聚焦電泳參數(shù)Table 2 Parameters of the isoelectric focusing (IEF) electrophoresis of immobile pH gradients (IPG)

圖4 酚抽提法提取的甘蔗葉蛋白質(zhì)在17 cm長，pH 4～7的膠條雙向電泳分析Fig.4 2-DE analysis of proteins from sugarcane leaves extracted with phenol extraction method in a 17 cm long IPG strip with pH 4～7

參數(shù)設(shè)置中采用50 V低電壓進(jìn)行主動(dòng)水化，有利于干膠條的充分溶脹以及樣品進(jìn)入膠條。一次典型的IEF電泳，需要經(jīng)過一系列的升壓過程，直至達(dá)到預(yù)設(shè)電壓。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索，采用多步升壓除鹽，可保證樣品聚焦時(shí)能達(dá)到預(yù)設(shè)電壓，聚焦充分。

有關(guān)載樣量，7 cm長的小膠合適的載樣量在200 μg左右，過高的載樣量引起蛋白點(diǎn)分離效果差，而上樣量過低，也引起可檢測的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)減少。在7 cm長的小膠條件摸索的基礎(chǔ)上，采用17 cm長，窄pH范圍（pH 4～7）的大膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，大膠的載樣量在800 μg左右合適。

優(yōu)化條件下所獲得的雙向電泳圖譜如圖4所示。圖譜經(jīng)過PDQuest 8.0分析軟件分析可檢測出的蛋白點(diǎn)數(shù)為954±13個(gè)。從圖譜中可以清晰地顯示酚抽提法分離甘蔗葉片蛋白質(zhì)分布情況，分子量主要集中在15 kDa~100 kDa范圍。

3 討論

蛋白樣品的提取是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的先決條件，只有得到了高純度的蛋白質(zhì)才能為后面的實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。本研究比較了SDS提取法、TCA/丙酮提取法和酚抽提法3種蛋白樣品的提取方法。

綜合比較，SDS提取液提取法直接提取法電泳圖譜中條帶較少且比較模糊，蛋白質(zhì)在提取過程中可能有損失和降解。另外，蛋白質(zhì)沉淀顏色深，狀態(tài)粘稠，可能含有較多的鹽、多糖、色素、酚、醌等雜質(zhì)，不適合雙向電泳。TCA/丙酮沉淀法是提取植物蛋白常用的一種方法，該法可降低蛋白質(zhì)樣品中的鹽離子，并能抑制蛋白酶的活性[14]。鹽是雙向電泳中最常見的一種雜質(zhì)[15]，樣品溶液中鹽離子濃度過高，引起等電聚焦電壓偏低，影響等電聚焦。TCA/丙酮沉淀法雖能有效地去除蛋白質(zhì)樣品中的鹽離子，但對多糖、色素等雜質(zhì)的去除欠佳，所以配合添加PVPP吸附劑，可減少植物色素等次生代謝物質(zhì)的干擾。TCA/丙酮沉淀法獲得蛋白沉淀得率雖高，但沉淀復(fù)溶性差，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液濃度低，蛋白質(zhì)丟失嚴(yán)重，難于滿足雙向電泳大膠的高上樣量要求。酚抽提法采用Tris-飽和酚將蛋白質(zhì)萃取到酚相，而鹽、核酸、色素、酚和多糖等可溶性物質(zhì)則進(jìn)入水相，然后用乙酸銨的甲醇溶液沉淀酚層中的蛋白質(zhì)，從而可以有效去除樣品中的可溶性干擾雜質(zhì)[16]。所以蛋白質(zhì)沉淀得率雖然低，但沉淀純度高、復(fù)溶性好，蛋白質(zhì)溶液濃度高，是適合雙向電泳分離甘蔗葉片蛋白質(zhì)的理想方法。

另外，高電壓是等電聚焦成功的關(guān)鍵，由于樣品提取與溶解過程中，一些鹽離子、糖分、核酸類小分子的干擾引起等電聚焦電壓偏低[17]，聚焦不充分，圖譜出現(xiàn)水平拖尾現(xiàn)象。本研究中的酚抽提法可以較好地除去干擾物質(zhì)，同時(shí)配合等點(diǎn)聚焦參數(shù)設(shè)置較長的低壓脫鹽步驟，使得樣品等電聚焦電壓達(dá)到預(yù)設(shè)值，解決了圖譜出現(xiàn)水平拖尾的現(xiàn)象。上樣量的高低也直接影響圖譜的分辨率與分離效果。上樣量過高，等電聚焦中容易引起蛋白的聚集沉淀，鹽離子及其它雜質(zhì)含量提高，影響等電聚焦，且上樣量過高可導(dǎo)致電泳圖譜蛋白點(diǎn)重疊，而上樣量過低則導(dǎo)致低豐度蛋白點(diǎn)的檢測靈敏度下降，影響軟件的分析和識(shí)別。

本研究中通過對甘蔗蛋白樣品的提取方法比較，篩選出適合雙向電泳分離甘蔗葉片蛋白質(zhì)的酚抽提法，并優(yōu)化了膠條pH范圍、上樣量、等電聚焦參數(shù)等條件。結(jié)果顯示，采用酚抽提法純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳合適的膠條pH范圍為4～7，17 cm長大膠上樣量為800 μg，平均可分離出954個(gè)蛋白點(diǎn)。

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Comparison of Three Extraction and Purification Approaches and Optimization of Two Dimensional Electrophoresis System for Proteins from Sugarcane Leaves

ZHOU Gui1,2,ZOU Cheng-lin2,QIU Li-Hang2,3,LIU Xiao-xia1,MAO Jiang-jiang1,YANG Li-tao2,3,LI Yang-rui2,3*
(1.School of Marine Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources/Key Laboratory of Chemical and Biological Transforming Process in Universities of Guangxi, Nanning 530008;2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory/Guangxi Academy of Agricultural Sciences/ Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi),China Ministry of Agriculture/Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences;3.College of Agriculture/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources,Guangxi University,Nanning 530004)

Proteins in sugarcane leaves were extracted and purified by using three methods i.e.SDS extraction methods,trichloroacetic acid(TCA)/acetone precipitation and phenol extraction.Their productivity and profiles were assessed by means of SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis.The conditions of two-dimensional electrophoresis were also optimized.The results showed that the result of SDS extraction method was poor because of less bands and impurity in protein precipitation.For TCA/acetone precipitation method,the productivity of protein precipitation was high,but it was difficult to re-resolve the precipitated protein,and the resulted concentration of proteins was too low to match the normal requirement of 2-DE analysis.The phenol extraction method was found to be the best for high purification and high protein concentration.The optimized conditions for two-dimension electrophoresis of phenol extraction method was pH 4~7 for 17 cm dry strip with 800 μg protein loading amount,which produced 954 spots in average.

sugarcane leaves;protein purification;SDS-PAGE;two-dimensional electrophoresis

S566.1；Q51

A

1007－2624（2017）02－0001－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.001

2016-10-13

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010GXNSFA013101，2011GXNSFF018002）；廣西農(nóng)科院團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（桂農(nóng)科2011YT01）。

周桂（1969-），女，博士，教授，從事植物生物化學(xué)研究。E-mail：zhouguigx@hotmail.com

李楊瑞（1957-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事甘蔗栽培、育種和生物技術(shù)研究。E-mail：liyr@gxaas.net