劉紅全, 潘藝華, 林小園, 李潔瓊, 袁 莎, 盧恩秋

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三角褐指藻紫外線誘變及高產(chǎn)EPA藻株選育

劉紅全, 潘藝華, 林小園, 李潔瓊, 袁 莎, 盧恩秋

(廣西民族大學(xué) 海洋與生物技術(shù)學(xué)院, 化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530006)

利用紫外誘變法對三角褐指藻()進(jìn)行誘變育種。實(shí)驗(yàn)得到三角褐指藻的最佳紫外輻射劑量為18 W的紫外燈距離藻液35 cm照射15 min。通過單細(xì)胞分離技術(shù)獲得1株突變株UP1, 與出發(fā)藻株相比, 突變株UP1的EPA產(chǎn)量提高10.2%。研究了誘變株的最適生長及產(chǎn)EPA的條件, 結(jié)果表明UP1在NaNO375 mg/L, pH 7.5, 晝夜溫度17~15℃, 接種量為10%時(shí)培養(yǎng)7天, 具有最大的生長速率和EPA產(chǎn)量。探討了誘變株的遺傳穩(wěn)定性, 結(jié)果表明誘變株可穩(wěn)定遺傳。

三角褐指藻(); 紫外誘變; EPA; 培養(yǎng)條件; 遺傳穩(wěn)定性

三角褐指藻()是一種真核海洋單細(xì)胞硅藻, 光合作用極強(qiáng), 是重要的光能轉(zhuǎn)換器, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中處于重要的營養(yǎng)級別[1]。由于海洋微藻富含各種營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物被作為潛在的巨大資源, 應(yīng)用于工業(yè)各個(gè)領(lǐng)域。三角褐指藻能夠大量合成并積累PUFAs, 特別是EPA, 有望作為工業(yè)化生產(chǎn)EPA的來源[2]。微藻PUFAs的積累量不僅與培養(yǎng)條件有關(guān), 還受藻種自身遺傳決定。目前對三角褐指藻產(chǎn)脂肪酸培養(yǎng)條件的研究見諸多報(bào)道[3-4],但在藻種的誘變改良方面的研究相對較少[5]。目前, 生產(chǎn)采用的藻種多直接從自然界分離獲得, 性狀單一, 藻種易退化, 微藻的產(chǎn)量及生物活性物質(zhì)無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求[6]。因此利用海洋微藻的育種技術(shù), 改良微藻品質(zhì), 培養(yǎng)出生長快速, EPA產(chǎn)量高的新品種迫在眉睫。

紫外輻射是一種最常用有效的物理誘變方法, 其誘變效應(yīng)是引起物種的DNA結(jié)構(gòu)改變而形成突變型[7]。研究表明中波長的紫外輻射對微藻的光合作用、細(xì)胞分裂及不飽和脂肪酸的產(chǎn)量具有促進(jìn)作用[8]。Liang等[5]研究結(jié)果表明, 三角褐指藻通過紫外輻射能顯著提高不飽和脂肪酸的含量, 尤其是EPA的含量。本實(shí)驗(yàn)用紫外線照射對三角褐指藻進(jìn)行誘變, 以期篩選出生長速度快, EPA含量高的株系。

1 材料與方法

1.1 藻種

試驗(yàn)所用的三角褐指藻購買于武漢中國科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 培養(yǎng)條件

250 mL的三角瓶內(nèi)裝100 mL的培養(yǎng)液, 于121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(24±1)℃, 光照強(qiáng)度(4×40 W日光燈照射), 光暗周期為12 h/12 h。培養(yǎng)液采用F/2配方配制, 人工海水的配方參考陳百靈[9]的稍作改進(jìn)。每天振搖2~3次, 藻懸液長到指數(shù)生長后期時(shí), 用于試驗(yàn)。

0.5 mg/mL尼羅紅溶液配置[10]: 稱取0.01 g尼羅紅粉末溶于20 mL丙酮, 配置得到0.5mg/mL的尼羅紅溶液, 在1mL的藻液中(細(xì)胞密度為106個(gè)/mL)加入染色液20 μL。

1.3 紫外線的誘導(dǎo)突變

1.3.1 紫外線誘變預(yù)實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的藻液6 mL置于 9 cm 培養(yǎng)皿底部鋪一薄層, 距離18 W 的紫外燈35 cm進(jìn)行不同時(shí)間的照射, 時(shí)間梯度為 : 0、5、10、15、20和30 min, 設(shè)置 3 個(gè)平行樣。誘變后, 置于暗環(huán)境中培養(yǎng)12 h, (避免光修復(fù)), 再轉(zhuǎn)至光照環(huán)境中培養(yǎng)。第3天待藻細(xì)胞死亡率穩(wěn)定后, 統(tǒng)計(jì)其死亡率。將恢復(fù)生長后的藻液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 測定比生長速率, 及粗脂肪含量, 確定合適的誘變劑量。

1.3.2 紫外線誘變及突變株的篩選

以預(yù)試驗(yàn)中確定的誘變劑量對出發(fā)株誘變。誘變后將全部藻液轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶中, 遮光12 h, 3 d后將藻液涂布在固體培養(yǎng)基上, 12 d后挑取體積較大、顏色較純的藻落200株于50 mL的培養(yǎng)液中。比較藻液顏色、是否貼壁篩選30株, 接種到150 mL培養(yǎng)液中培養(yǎng), 2個(gè)平行樣。以未經(jīng)誘變的藻液為對照, 每隔一天計(jì)算細(xì)胞密度, 10 d后離心, 干燥, 測定脂肪酸。以C0為對照組, 根據(jù)終細(xì)胞密度及脂肪酸含量選育一株優(yōu)良藻株, 進(jìn)行后續(xù)工作。

1.4 致死率的計(jì)算

待藻液死亡細(xì)胞穩(wěn)定后用血球計(jì)數(shù)板記錄各組存活細(xì)胞數(shù)量, 按下面公式進(jìn)行計(jì)算:

致死率(%)=(1–處理組存活細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù))×100

1.5 脂肪酸含量的初步測定——尼羅紅染色法

尼羅紅是一種脂溶性熒光染色劑, 通過染色選擇合適的而激發(fā)波長和自發(fā)波長可測定細(xì)胞內(nèi)的油脂含量, 細(xì)胞經(jīng)染色后的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著相關(guān)[11]。取1mL細(xì)胞密度為106個(gè)/mL的藻液, 加入尼羅紅染料(0.5 mg/mL)20 μL于40℃孵育10 min, 將染好顏色的藻細(xì)胞滴入載玻片中, 于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞中脂滴的大小和數(shù)量[12]。

1.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.6.1 NaNO3對誘變株生長及產(chǎn)EPA的影響

NaNO3設(shè)置6個(gè)梯度: 0、37.5、75、102.5和150 mg/L, 其余培養(yǎng)條件不變。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣, 隔天測細(xì)胞密度, 求平均值, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6.2 pH對誘變藻株生長及產(chǎn)EPA的影響

pH設(shè)置5個(gè)梯度: 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5, 其余培養(yǎng)條件不變。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣 , 隔天測細(xì)胞密度, 求平均值, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6.3 溫度對誘變藻株生長及產(chǎn)EPA的影響

溫度設(shè)置5個(gè)梯度: 17、20、23、25、27和30℃, pH為7.5, 其余培養(yǎng)條件不變。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣, 隔天測細(xì)胞密度, 求平均值, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6.4 環(huán)境條件的正交試驗(yàn)對誘變藻株生長及產(chǎn)EPA的影響

根據(jù)微藻生長及產(chǎn)EPA的條件差異, 選擇合適的培養(yǎng)條件, 通過正交試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合, 正交試驗(yàn)表如下。

表1 試驗(yàn)因子及其水平

pH為7.5, 其余培養(yǎng)條件不變。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次, 隔天測細(xì)胞密度, 求平均值。

1.7 遺傳穩(wěn)定性分析

將篩選得到的誘變株連續(xù)轉(zhuǎn)接6代, 測定第一代和第六代的EPA含量, 看是否能穩(wěn)定遺傳。

1.8 不飽和脂肪酸的提取及氣相譜測定

1.8.1 采用甲醇—氯仿提取法

參考姚領(lǐng)等[13]采用氯仿–甲醇混溶液(2︰1,/)超聲提取粗脂肪酸, 將粗提液加入3 mL1 mol/L的KOH–CH3OH混溶液于75℃水浴中皂化, 最后用正己烷萃取上機(jī)氣相色譜測定。

1.8.2 脂肪酸的色譜測定法

采用日本島津的氣相色譜儀, 60 m×0.32 mm× 0.25 μm石英毛細(xì)管柱, 汽化室和檢, 測器的溫度均為250℃, 色譜柱的升溫程序: 初始70℃, 以30 ℃/min的速率升溫至150℃, 然后以5 ℃/min升溫到250℃, 保持到所測樣品的峰值都出現(xiàn)。載氣為高純N2, 流速30 mL/min, H2流速為40 mL/min, 空氣流速為450 mL/min, 分流比為l︰60, 進(jìn)樣量1μL。通過與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸保留時(shí)間的對比鑒別各脂肪酸組分, 面積歸一化法計(jì)算出各脂肪酸的相對含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 紫外線對三角褐指藻誘變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在紫外線的照射下, 隨照射時(shí)間的延長藻液顏色逐漸變淺, 活細(xì)胞數(shù)也隨照射時(shí)間的延長而降低。當(dāng)照射15~20 min時(shí)藻液變?yōu)闇\色且有混濁白色, 而照射30 min后的藻液出現(xiàn)白色糝狀固體。待藻細(xì)胞死亡率穩(wěn)定下來, 統(tǒng)計(jì)其死亡率(圖1)。

由圖1可看出, 輻射時(shí)間從15 min增至20 min時(shí), 藻細(xì)胞死亡率倍增, 說明此時(shí)的輻射量是處于多數(shù)細(xì)胞的敏感區(qū)域與耐受極限。經(jīng)紫外誘變處理后的三角褐指藻生長受到抑制, 恢復(fù)生長的速度緩慢, 當(dāng)照射30 min后幾乎不生長。為了獲得較多的突變型, 又不因輻射劑量過大造成大部分細(xì)胞死亡而殘留一些不活躍的細(xì)胞, 同時(shí)根據(jù)恢復(fù)生長后測得的比生長速率及EPA含量, 本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為三角褐指藻的最佳輻射條件為在18 W紫外燈的照射下, 距離 35 cm照射15 min。

圖1 紫外照射下三角褐指藻的致死率

2.2 誘變后優(yōu)良藻株的選育

2.2.1 尼羅紅染色進(jìn)行初篩

尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料, 能與脂類物質(zhì)結(jié)合, 在一定的激發(fā)波長下能發(fā)射脂特異性熒光, 通過檢測脂熒光強(qiáng)度可以對細(xì)胞中的油脂進(jìn)行定量分析。利用熒光顯微鏡觀察比較細(xì)胞內(nèi)油珠的大小、數(shù)量, 熒光強(qiáng)度可以判斷微藻油脂含量高低。尼羅紅染色法可以作為富油微藻初篩的指標(biāo), 簡便快速。對分離得到的微藻進(jìn)行尼羅紅染色, 觀察熒光強(qiáng)度。

由圖2可看出篩選得到的誘變藻株細(xì)胞和脂肪粒都比出發(fā)藻株大, 尤其細(xì)胞內(nèi)脂肪粒明顯增多, 根據(jù)激發(fā)出的熒光強(qiáng)度可以初步判定誘變株的總脂肪酸含量要高于對照組。這與氣象色譜測定的脂肪酸含量提高相一致。

圖2 誘變藻株油脂的熒光定性分析(10×20倍)

2.2.2 通過比生長速率及EPA含量進(jìn)行篩選

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)的最佳誘變劑量誘變后, 利用單細(xì)胞分離技術(shù)篩選得到1株生長較快, 脂肪酸含量較高的藻株, 以誘變劑名稱及微藻名稱的首字母命名為UP1。其EPA質(zhì)量比及比生長速率分別見圖3和圖4。

圖3 誘變后選育藻株的EPA質(zhì)量比

圖4 誘變后選育藻株的比生長速率

由圖3中可看出選育出的藻株EPA質(zhì)量比明顯高于對照組, 為23.53 mg/g, 比對照組提高了10.2%。由圖4可看出EMS誘變后的微藻生長受到輕微抑制, 比生長速率略低于對照組。

2.3 對選育出的藻株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 氮源對誘變藻株產(chǎn)EPA的影響

氮源是海洋微藻生存的必需營養(yǎng)鹽, 不僅影響細(xì)胞的生長速度, 而且嚴(yán)重影響細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的合成積累。本實(shí)驗(yàn)考察了氮源濃度對誘變藻株產(chǎn)EPA的影響, 結(jié)果見圖5。

由圖5可知在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨氮源含量的增加脂肪酸積累量增大, 在NaNO3質(zhì)量濃度為75 mg/L時(shí), EPA的積累量達(dá)到最大, 此后隨NaNO3質(zhì)量濃度增加, EPA含量降低。這與Mujtaab[14]研究的相一致較低的氮源濃度有利于脂肪酸的積累。通過方差分析(=0.096)發(fā)現(xiàn)氮源對UP1產(chǎn)EPA的影響不是很顯著。

圖5 NaNO3對三角褐指藻誘變株產(chǎn)EPA的影響

2.3.2 pH對誘變藻株產(chǎn)EPA的影響

pH對海洋微藻的生長及生化組分的有著重要的影響作用。有些研究者認(rèn)為pH 會(huì)影響藻細(xì)胞在光合作用中對CO2及有機(jī)碳源的利用效率, 并在培養(yǎng)基中影響微藻細(xì)胞對離子的吸收和利用[15]。本實(shí)驗(yàn)的pH值試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 pH對UP1產(chǎn)EPA的影響

由圖6可看出誘變株產(chǎn)EPA的最適pH值為7.5。在此pH條件下UP1 EPA產(chǎn)量為25.87 mg/g, 通過方差分析得到值小于0.05, 說明pH對微藻EPA的產(chǎn)量影響呈顯著性差異。

2.3.3 溫度對誘變藻株產(chǎn)EPA的影響

海洋微藻的較適生長溫度一般在20~30℃, 但低溫有利于提高不飽和脂肪酸含量, 以增加膜的流動(dòng)性[16]。結(jié)果見圖7。

由圖7可看出低溫更有利于三角褐指藻EPA的積累, 在30℃條件下三角褐指藻幾乎不生長, EPA產(chǎn)量低。篩選獲得的誘變藻在20℃條件下EPA質(zhì)量比最高, 為 22.59 mg/g。通過方差分析發(fā)現(xiàn)溫度對EPA的產(chǎn)量影響差異性不顯著(= 0.89)。

圖7 溫度對UP1產(chǎn)EPA的影響

2.3.4 環(huán)境條件的正交組合對誘變藻株產(chǎn)EPA的影響

不同的培養(yǎng)條件對微藻中EPA含量的影響見直觀分析表2。根據(jù)表2中R值得到, 影響UP1產(chǎn)EPA的因素主次順序: 接種量>培養(yǎng)天數(shù)>晝夜溫度, 其最優(yōu)化組合為: 17~15 ℃、接種量10%、培養(yǎng)7 d。由此可看出較低溫及短時(shí)間培養(yǎng)更有利于三角褐指藻積累EPA。

2.4 遺傳穩(wěn)定性分析

鑒于誘變藻株的性狀常常不穩(wěn)定, 尤其是在連續(xù)繼代培養(yǎng)時(shí), 為了檢測所得藻株的性狀是否穩(wěn)定, 在同樣的培養(yǎng)條件下連續(xù)轉(zhuǎn)接6代, 測定第一代和第六代的EPA含量, 結(jié)果見圖8。

由圖8可看出誘變株第一代和第6代的EPA產(chǎn)量變化不顯著(=0.16), 說明選育的變異藻種具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展, 微藻的商業(yè)化開發(fā)不再局限于只作為海產(chǎn)養(yǎng)殖的食物餌料, 還廣泛應(yīng)用于食品, 醫(yī)藥保健, 化妝品等領(lǐng)域。但微藻的應(yīng)用價(jià)值需依賴于藻種的生理遺傳穩(wěn)定性及生產(chǎn)活性物質(zhì)的高效性。目前已從自然界中分離得到幾種較好的生產(chǎn)藻種[17-18], 但在長期培養(yǎng)下, 易退化, 活性物質(zhì)的產(chǎn)量降低。因此需做大量工作, 在現(xiàn)有的藻種資源中選育出更多的優(yōu)良藻種。紫外線輻照作為最常用, 成本最低的遺傳育種方法, 已廣泛應(yīng)用微藻的誘變育種中。周玉嬌等[19]采用紫外線對小球藻 Y019 進(jìn)行誘變, 篩選獲得M37 和 M67 兩個(gè)高含油量株系, 油脂含量分別提高了24.58%、17.88%。張學(xué)成等[20]采用紫外線誘變小球藻, 篩選得到突變株M51、M59、M73, 其生長速率比出發(fā)藻株分別提高了6.23%、3.8%、5.92%, 蛋白含量提高約2.5%。本文采用18 w的紫外輻射對三角褐指藻進(jìn)行誘變, 篩選得到1株油脂產(chǎn)量較高的藻株命名為UP1, 其EPA產(chǎn)量為23.53 mg/g, 比對照組提高了10.2%。

表2 培養(yǎng)條件對UP1產(chǎn)EPA的影響正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

圖8 誘變藻株第1代與第6代的EPA含量比較

海洋微藻的脂肪酸組分及產(chǎn)量不僅與藻種自身有關(guān), 還受生長的環(huán)境條件影響, 如培養(yǎng)基組分, CO2的通氣量, 光照輻射量及溫度等密切相關(guān), 其中氮源及磷酸鹽作為基礎(chǔ)元素, 對微藻的生長及脂肪酸的積累有直接的影響。大量研究表明, 氮源缺乏會(huì)減少微藻細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量, 而增加脂肪酸和碳水化合物的含量 [21-22]。因?yàn)樵诘床蛔銜r(shí), 細(xì)胞的蛋白合成和增殖分裂活動(dòng)均受到抑制, 而不斷吸收的多余碳源就轉(zhuǎn)化為脂肪酸貯存在細(xì)胞中。Piorreck等[23]報(bào)道三角褐指藻和杜氏藻在缺氮的情況下, 有利于脂肪酸的積累。在本試驗(yàn)中誘變株UP1在不同氮濃度的培養(yǎng)基中, 隨著氮濃度的升高, 油脂積累量逐漸下降, 在NaNO3為75 mg/L時(shí)EPA產(chǎn)量最大, 與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[24]。微藻的生長及油脂積累也隨pH不同呈現(xiàn)差異。pH通過影響細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性和對離子的吸收作用從而影響微藻的生長代謝。本實(shí)驗(yàn)得到三角褐指藻的產(chǎn)EPA的較適pH 為7.5, 這與Pahl等的研究一致, 硅藻的最適生長 pH 為7.2~8.1[25]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三角褐指藻生長和產(chǎn)EPA的溫度比小球藻的要低, 在高于27℃以上, 三角褐指藻幾乎不生長。這可能與藻種有關(guān), 三角褐褐藻屬于底棲硅藻, 在較低溫, 低光密度下也能自養(yǎng)生長[26]。錢振明等[27]考察了溫度對8種底棲硅藻生長及其理化成分的影響.結(jié)果表明: 在15.~25℃時(shí)細(xì)胞的比生長速率及主要理化成分(蛋白、多糖、脂肪酸)含量均可達(dá)到最大, 而低于15℃或高于30℃均不利于細(xì)胞生長及理化成分的積累。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三角褐指藻的較適生長溫度要比產(chǎn)脂肪酸的溫度稍高, 因此本實(shí)驗(yàn)采用晝夜溫差的培養(yǎng)方式。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 對篩選得到的誘變藻株UP1進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化, 得到較適培養(yǎng)條件為: NaNO375 mg/L, pH 7.5, 晝夜溫度17~15℃、接種量10%、培養(yǎng)7 d, 在此條件下培養(yǎng), 藻株的EPA產(chǎn)量為26.38 mg/g。通過遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)分析可知UP1的第一代和第6代EPA產(chǎn)量變化不顯著(=0.16), 說明選育的變異藻種具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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(本文編輯: 梁德海)

UV irradiation toand screening of EPA strains

LIU Hong-quan, PAN Yi-hua, LIN Xiao-yuan, LI Jie-qiong, YUAN Sha, LU En-qiu

(College of Marine Science and Biotechnology, Guangxi University for Nationlities , Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification, Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources, Nanning 530006, China)

This study investigated the mutagenesis ofinduced by UV irradiation and its capacity of EPA accumulation influenced by various cultivation factors. The appropriate ultraviolet irradiation dose that can be applied towas found to be below 35 cm for 15 min. A special clone UP1 was isolated from more than 200 mutant clones. Compared with the wild species, the EPA content of mutant UP1 was increased by about 10.2%. The effects of NaNO3concentration, pH of the medium, and temperature on EPA production were investigated, which showed that the optimal cultivation conditions were NaNO375 mg/L, pH 7.5, natural day/night temperature about 17–15℃, and 10% of inoculation density for 7 days of cultivation. The mutant species demonstrated inherited stable.

; UV mutagenesis; EPA; culture condition; genetic stability

Nov. 29, 2016

劉紅全(1975-), 男, 黑龍江肇東人, 副教授, 博士, 主要從事生物技術(shù)研究, 電話: 13977113695, E-mail: lhongquan@163.com

A

1000-3096(2017)09-0087-07

10.11759/hykx20140423005

2016-11-29;

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960215); 廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科青0728019)

[National Natural Science Foundation of China, No. 30960215; Guangxi Natural Science Foundation Program, No. 0728019]