肖寶華, 廖寶林, 楊小東, 謝子強

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基于三種分子標記的外伶仃島石珊瑚系統(tǒng)進化關(guān)系研究

肖寶華1, 2, 廖寶林2, 楊小東2, 謝子強3

(1. 廣東海洋大學, 廣東 湛江 524025; 2. 廣東海洋大學 深圳研究院, 廣東 深圳 518108; 3. 深圳市碧海藍天海洋科技有限公司, 廣東 深圳 518108)

以廣東省珠海市外伶仃島地區(qū)常見的4屬5種石珊瑚為研究對象, 對線粒體COI、16S rRNA和ITS三種基因片段數(shù)據(jù)進行分析, 并計算了種間遺傳距離。序列分析結(jié)果表明5種石珊瑚的COI、16S rRNA基因片段堿基AT含量大于GC含量, 而ITS序列堿基AT含量小于GC含量; 5種石珊瑚種間的三種基因平均遺傳距離分別為0.043、0.134和0.763, 所得遺傳距離結(jié)果存在一定差異。將三種基因串聯(lián)起來并利用鄰位連接法(NJ)、最大似然法(ML)和最小進化法(ME)分別構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中, 科一級的系統(tǒng)進化關(guān)系與形態(tài)學分類一致, 但蜂巢珊瑚科內(nèi)的分子系統(tǒng)分類結(jié)果與形態(tài)學分類闡述的遺傳進化關(guān)系略有差別, 說明石珊瑚傳統(tǒng)分類可能受骨骼可塑性的影響。研究結(jié)果為外伶仃島石珊瑚的親緣關(guān)系研究提供相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 并為該地區(qū)石珊瑚資源保護奠定理論基礎(chǔ)。

石珊瑚; COI; 16S rRNA; ITS; 分子系統(tǒng)進化

石珊瑚分子系統(tǒng)進化研究始于20世紀90年代, 1996年Romano等[1]在世界上首次使用分子標記(線粒體16S rRNA和細胞核28S rRNA)對石珊瑚系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究, 研究結(jié)果表明現(xiàn)有石珊瑚目起源于兩個分支類群(堅實型類群和復合型類群)。目前, 應(yīng)用于石珊瑚系統(tǒng)進化的分子標記主要有核糖體18S rRNA、5.8S rRNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(Internal transcribed spacers, ITS)和線粒體的12S rRNA基因、16S rRNA基因和細胞色素b(cytochromeb, cyt b)基因、細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)等[2]。經(jīng)過近20年的研究發(fā)展, 石珊瑚的分子系統(tǒng)進化研究已經(jīng)對石珊瑚較高階元的系統(tǒng)分類學產(chǎn)生了極大的影響, 顛覆了以往通過形態(tài)學對石珊瑚系統(tǒng)進化的認識[3]。

鹿角珊瑚科的石珊瑚品種是目前國內(nèi)外利用分子標記研究系統(tǒng)進化關(guān)系最多一類珊瑚。Odorico等[4]利用ITS基因?qū)?種鹿角珊瑚科品種的系統(tǒng)關(guān)系進行了初步的探討, 為鹿角珊瑚科分子系統(tǒng)研究打下了堅實的理論基礎(chǔ)。Fukami等[5]利用線粒體的細胞色素b和ATP6兩種基因片段對鹿角珊瑚科4個屬15個品種進行系統(tǒng)進化分析, 分子系統(tǒng)進化樹顯示15種珊瑚可分為三個大的珊瑚類群。Forsman等[6]利用16S rRNA作為分子標記對鹿角珊瑚科的薔薇珊瑚屬()多種薔薇珊瑚的種間遺傳關(guān)系進行分析, 構(gòu)建了薔薇珊瑚屬的系統(tǒng)進化樹。蜂巢珊瑚科的石珊瑚作為石珊瑚種類第二豐富的種類, 使用分子標記進行系統(tǒng)進化研究也在國內(nèi)外積累了大量的報道。Huang等[7]基于線粒體COI和一個非編碼區(qū)序列對新加坡附近海域的41種蜂巢珊瑚科珊瑚系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究, Arrigoni等[8]采用COI作為分子標記對印度洋海域的蜂巢珊瑚科的珊瑚品種進行系統(tǒng)進化分析。這些學者都發(fā)現(xiàn)蜂巢珊瑚科的分子系統(tǒng)進化結(jié)果與形態(tài)學系統(tǒng)進化結(jié)果存在一定的差異, 再次證明石珊瑚中普遍存在并系現(xiàn)象。相比較國外對石珊瑚分子系統(tǒng)進化的報道, 國內(nèi)有關(guān)石珊瑚分子系統(tǒng)進化的研究報道仍較少, 僅有海南[9-10]、廣東徐聞[11-13]等少數(shù)地方的石珊瑚系統(tǒng)進化有過相關(guān)的報道。

外伶仃島位于萬山群島中部東北端, 珠江口東側(cè)。目前, 有關(guān)外伶仃島附近海域石珊瑚的研究知之甚少, 僅有黃暉等[15]在2008年開展萬山群島的石珊瑚群落分布研究時對外伶仃島海域石珊瑚情況進行了初步的調(diào)查, 調(diào)查結(jié)果顯示多孔同星珊瑚()和腐蝕刺柄珊瑚()為外伶仃島的優(yōu)勢種。其他有關(guān)外伶仃島石珊瑚的研究還未見報道。

本研究采用線粒體COI、16S rRNA基因以及核糖體ITS基因的部分序列片段作為分子標記, 對外伶仃島海域的5種石珊瑚的系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究, 為外伶仃島石珊瑚的親緣關(guān)系研究提供相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 并為該地區(qū)石珊瑚資源保護奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和形態(tài)學鑒定

本研究的石珊瑚樣品采自廣東省珠海市外伶仃島附近海域, 形態(tài)學鑒定依照鄒仁林[16]的《中國動物志·腔腸動物門·珊瑚蟲綱·石珊瑚目·石珊瑚》和Veron[17]的六射珊瑚骨骼形態(tài)特征分類系統(tǒng)。經(jīng)形態(tài)學鑒定采集的樣品可分為3科4屬5種, 樣品形態(tài)學鑒定結(jié)果見表1。截取一小段斷枝保存于無水乙醇中以備后續(xù)DNA提取實驗使用。

表1 珊瑚樣品

1.2 基因組總DNA的提取

使用北京天根生物有限公司生產(chǎn)的海洋動物組織基因組提取試劑盒提取珊瑚樣品的DNA, 所提取的DNA置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計合成

COI基因的PCR引物參考李曉娜等[11]的研究報道, 16S rRNA基因的PCR引物參考Forsman等[6]的研究報道, ITS基因的PCR引物參考Odorico等[4]的研究報道。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成, 引物信息見表2。

1.4 PCR擴增和DNA測序

PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積25 μL: 10×Buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL, 上下游引物各1 μL, , Taq DNA聚合酶1U及DNA模板2 μL; 其余用去離子水補至25 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預變性5min, 95℃變性45 , 50℃退火45 s, 72℃延伸1 min 30 s, 共35個循環(huán), 最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中檢測, 凝膠成像儀拍照記錄。選取擴增條帶單一、濃度較高的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進行測序, 獲取各基因片段的序列信息。

表2 COI、16S rRNA、ITS基因的PCR引物

1.5 序列分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

測序所得序列用DNASTAR中的Editseq軟件進行編輯、剪切、校正, 再將校正好的序列與NCBI的數(shù)據(jù)庫進行比對, 確認樣品的分子結(jié)果。采用MEGA6.0軟件進行三種基因序列的串聯(lián)與分析, 統(tǒng)計出三種線粒體基因組序列長度、堿基組成、簡約信息位點等相關(guān)信息。同時根據(jù)簡約信息位點, 計算出種間遺傳距離。本研究三種基因的系統(tǒng)進化樹是使用MEGA6.0軟件基于Kimu-ra雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter, K2P), 只計算顛換(Transversional substitutions only), 采用鄰位連接法(Neighbor-Joinning, NJ)、最大似然法(Minimum-Likelihood, ML)和最小進化法(Minimum-Evolution, ME)構(gòu)建出來的。三種系統(tǒng)進化樹中節(jié)點的自舉置信度水平由自引導值(Bootstrapvalue) 估計, 重復次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種基因序列及堿基組成分析

本研究的5個物種的COI、16S rRNA基因以及ITS基因部分序列長度分別為464~465bp, 470~485bp, 964~988bp。從5種石珊瑚的COI、16S rRNA基因以及ITS基因部分序列的堿基組成比例來看, 兩種線粒體基因(COI、16S rRNA)片段堿基中的A、T、C、G含量相差較大, 序列堿基AT含量大于GC含量, 與目前已知的無脊椎動物mtDNA序列中AT含量大于GC含量的情況相同。而ITS基因序列片段堿基中的A、T、C、G含量相差不大, 除大角孔珊瑚外(), 其余物種的堿基AT含量小于GC含量。三種片段序列基因都處于高度飽和狀態(tài)。堿基組成比例見表3。

表3 5種石珊瑚COI、16S rRNA以及ITS基因片段的堿基組成比例

2.2 5種石珊瑚種間遺傳距離

通過MEGA6.0計算5種石珊瑚的種間遺傳距離, 得到COI、16S rRNA基因以及ITS序列間的平均距離為0.043、0.134和0.763。在COI序列中, 標準蜂巢珊瑚和大角孔珊瑚的種間遺傳距離最大為0.093, 而標準蜂巢珊瑚和猩紅筒星珊瑚的遺傳距離最小, 為0.004。在16S rRNA基因序列中, 猩紅筒星珊瑚和多孔同星珊瑚以及向日葵蜂巢珊瑚的種間遺傳距離最大, 都為0.224, 而標準蜂巢珊瑚和多孔同星珊瑚的遺傳距離最小, 為0.002。在ITS序列中, 大角孔珊瑚和多孔同星珊瑚的種間遺傳距離最大, 為1.224, 而多孔同星珊瑚和向日葵蜂巢珊瑚的遺傳距離最小, 為0.028。三種序列得出的種間遺傳距離結(jié)果存在一定差異, 種間遺傳距離見表4、表5和表6。

表4 基于COI的5種石珊瑚種間遺傳距離

表5 基于16S rRNA基因的5種石珊瑚種間遺傳距離

表6 基于ITS的5種石珊瑚種間遺傳距離

2.3 基于三種基因序列對5種石珊瑚的系統(tǒng)進化分析

使用MEGA6.0軟件將每種石珊瑚的COI、16S rRNA基因以及ITS三種基因片段序列串聯(lián)起來, 再采用鄰位連接法(Neighbor-Joinning, NJ)、最大似然法(Minimum-Likelihood, ML)和最小進化法(Minimum-Evolution, ME)構(gòu)建5種石珊瑚的分子系統(tǒng)樹, 結(jié)果顯示3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)完全一致, 蜂巢珊瑚科、濱珊瑚科和木珊瑚科的珊瑚品種各聚為一枝, 但在蜂巢珊瑚科中, 向日葵蜂巢珊瑚與多孔同星珊瑚先聚為一支然后再與標準蜂巢珊瑚再聚為一支, 這與傳統(tǒng)形態(tài)學科屬分類結(jié)果存在一定差異。三種基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖1、圖2和圖3。

圖1 利用三種基因序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化NJ樹

圖2 利用三種基因序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化ML樹

圖3 利用三種基因序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化ME樹

3 討論

3.1 5種石珊瑚COI、16S rRNA基因和ITS基因序列特點

線粒體細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)是動物線粒體DNA的重鏈上參與細胞色素氧化反應(yīng)的關(guān)鍵基因。COI基因擁有長度適宜、進化速率慢及富含系統(tǒng)發(fā)育信號等特點, 常被當作動物界物種鑒定的DNA條形碼工具[18]。近年來, 很多研究表明在許多低等動物的分子系統(tǒng)進化研究中COI基因具有更為緩慢的進化速率, 特別是石珊瑚。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于石珊瑚采用無性生殖方式使珊瑚蟲個體可以存活上百年[19]。Hellberg[19]在使用COI基因?qū)Τ缺汉?)和猩紅筒星珊瑚系統(tǒng)進化的研究中發(fā)現(xiàn)其較慢的進化速率導致其較低的種內(nèi)分化。然而在石珊瑚種間關(guān)系的研究中, COI基因作為主要的分子標記得到了廣泛的應(yīng)用[20-22]。本研究的5種石珊瑚COI序列長度變化不大, 遵循真核生物線粒體基因AT偏向性的規(guī)律, 是本研究三種基因中種間序列變化程度最小的基因。

線粒體16S rRNA基因相對于其他石珊瑚的線粒體基因進化速率較慢, 且較為保守, 常用于種以上分子分類的標記[23]。本研究的5種石珊瑚16S rRNA基因序列長度變化較大, 遵循真核生物線粒體基因AT偏向性的規(guī)律。國外學者研究發(fā)現(xiàn), 16S rRNA基因在石珊瑚屬以上的分類階元中種間片段長度具有較大的差異, 而屬內(nèi)差異片段長度差異不大[23-24]。本研究的結(jié)果也較為符合這種情況, 兩種復合型珊瑚(大角孔珊瑚和猩紅筒星珊瑚)16S rRNA基因具有較為相似的堿基組成, 而與3種蜂巢珊瑚科珊瑚的16S rRNA基因序列堿基組成則相差較大。從序列的堿基組成、序列變化和遺傳距離上看, 16S rRNA基因比較適宜作為科、屬之間的分子分類標記。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS)是細胞核中核糖體18S r RNA和5.8S r RNA之間的一段非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列, 由于所受的選擇壓力較小、DNA堿基替換速率較快, 加上較大的拷貝數(shù)、適中的長度和快速的同步化等特點, 常被用于低等真核生物屬水平的種間關(guān)系研究[7]。而在石珊瑚目的鹿角珊瑚、扁腦珊瑚、沙珊瑚、濱珊瑚等類群研究中, 國內(nèi)外都有相關(guān)ITS標記的報道[3, 25]。本研究的5種石珊瑚ITS序列長度變化是本研究三種基因中變化最大的基因。序列堿基組成情況上與16S rRNA基因結(jié)果較為一致, 同時由于其較高的堿基變化率, 對蜂巢珊瑚科內(nèi)不同種石珊瑚遺傳分化情況是三種基因中最為顯著一種。從序列的堿基組成、序列變化和遺傳距離上看, ITS基因比較適宜作為屬間的分子分類標記。

3.2 石珊瑚系統(tǒng)進化分析

早在20世紀90年代, Romano和Palumbi[1]在應(yīng)用16S rRNA基因?qū)?4種石珊瑚的系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究的過程中, 發(fā)現(xiàn)全球范圍內(nèi)現(xiàn)存的石珊瑚可劃分為兩大分支類群, 并將其命名為堅實型(Robust)和復合型(Complex)。結(jié)合已有的形態(tài)學研究, Romano認為堅實型珊瑚骨骼鈣化程度較高, 具有堅實的骨骼結(jié)構(gòu), 珊瑚外觀主要以碟片狀和團塊狀為主, 其代表種類包括蜂巢珊瑚科、石芝珊瑚科、褶葉珊瑚科等。復合型珊瑚骨骼鈣化程度較低, 具有較為復雜多變的生長形態(tài), 其代表種類包括鹿角珊瑚科、菌珊瑚科、木珊瑚科、濱珊瑚科等。經(jīng)過近20年的石珊瑚分子系統(tǒng)學研究發(fā)展, 國內(nèi)外的許多學者積累的分子數(shù)據(jù)都極力地支持了這一學說。Fukami等[26]使用多種分子標記對17科75屬127種石珊瑚進行了系統(tǒng)進化分析, 通過構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹將127種石珊瑚細分成21個類群, 其中9個類群屬于復合型珊瑚, 12個類群屬于堅實型珊瑚。Kitahara等[22]對現(xiàn)有324種石珊瑚COI基因的系統(tǒng)進化關(guān)系進行了探討, 引入外源種進行分析后, 將堅實型分支的位置放在了復合型分支輻射范圍之內(nèi)。相對來說, 復合型珊瑚類群的分子系統(tǒng)進化關(guān)系與傳統(tǒng)分類學的系統(tǒng)關(guān)系較為一致。而堅實型珊瑚類群的分子系統(tǒng)進化關(guān)系則與傳統(tǒng)分類學存在很多不一致的地方, 部分科屬之間關(guān)系較為混亂。其中最為混亂的第17個分類群被稱為“Bigmessidae”, 里面包含了4個石珊瑚科: 蜂巢珊瑚科、裸肋珊瑚科、梳狀珊瑚科、腦珊瑚科。這個類群在分子系統(tǒng)進化關(guān)系上存在相互并系現(xiàn)象, 不同科屬之間的物種重新聚為新的分支[27]。蜂巢珊瑚科作為堅實型珊瑚的代表, 同時也是最為多源的系統(tǒng)進化種類, 在不同的分子系統(tǒng)進化研究中都分散在7種堅實型珊瑚分類群中, 在系統(tǒng)進化樹上與裸肋珊瑚科、褶葉珊瑚科、梳狀珊瑚科、鐵星珊瑚科等珊瑚種類交雜在一起, 成為并系情況最為復雜的一類珊瑚。這些分子證據(jù)與傳統(tǒng)形態(tài)學系統(tǒng)進化存在許多不協(xié)調(diào)和不統(tǒng)一的地方, 暗示著傳統(tǒng)形態(tài)學可能受珊瑚骨骼生長變異性限制, 對石珊瑚的系統(tǒng)進化關(guān)系分析中存在錯誤, 尤其是堅實型珊瑚類型。

本研究采用鄰位連接法(NJ)、最大似然法(ML)和最小進化法(ME)對5種石珊瑚三種基因片段的串聯(lián)序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 從科一級單元來看, 串聯(lián)基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化關(guān)系符合Romano的兩大分支類群學說。蜂巢珊瑚科的珊瑚品種屬于堅實型珊瑚類群分支、而濱珊瑚科和木珊瑚科品種屬于復合型珊瑚類群分支。同時, 蜂巢珊瑚科科內(nèi)多源系統(tǒng)進化的現(xiàn)象也在本研究體現(xiàn)出來, 傳統(tǒng)形態(tài)學分類中同屬的向日葵蜂巢珊瑚和標準蜂巢珊瑚并沒有聚為一支, 反而向日葵蜂巢珊瑚與不同屬的多孔同星珊瑚聚率先聚為一支。

近年來, 許多學者通過顯微掃描技術(shù)對石珊瑚骨骼的精細結(jié)構(gòu)進行觀察, 結(jié)合石珊瑚分子系統(tǒng)進化數(shù)據(jù), 綜合全面的分析其系統(tǒng)進化關(guān)系, 對Veron傳統(tǒng)形態(tài)學研究結(jié)果進行了校正和補充[28-29]。很多精細的石珊瑚骨骼數(shù)據(jù)正逐漸改變我們對石珊瑚傳統(tǒng)分類的看法, 同時也對分子系統(tǒng)進化研究結(jié)果進行了有力的佐證。在當今的石珊瑚系統(tǒng)進化研究中, 無論是傳統(tǒng)的形態(tài)學方法還是利用分子技術(shù)手段, 兩者都必須相互利用和補充。

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(本文編輯: 梁德海)

Study of phylogenetic relationships of scleractinian from Wailing-ding Island based on three standard molecular markers

XIAO Bao-hua1, 2, LIAO Bao-lin2, YANG Xiao-dong2, XIE Zi-qiang3

(1. Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China; 2. Guangdong Ocean University, Shenzhen Institute, Shenzhen 518108, China; 3. Shenzhen Bihai Blue Sky Marine Technology Co, LTD, Shenzhen 518108, China)

The mitochondrial cytochrome oxidase subunit I (CO I), 16S rRNA, and nuclear ITS genes have been routinely used as standard molecular markers. A total of five species pertaining to four genera of scleractinian, collected from Wailingding Island, Zhuhai City, Guangdong Province, were analyzed by partial sequences, and the genetic distances of these three genes were calculated. The results indicated that the average AT contents of CO I and 16S rRNA gene fragments were obviously higher than the GC contents. However, the average AT content of ITS fragments was obviously less than the GC content. The average genetic distances of the three genes were 0.043, 0.134, and 0.763 from the five species, respectively. The neighbor-joining, maximum-likelihood, and minimum-evolution trees of combined partial sequences of these three genes revealed that the phylogenetic relationships were consistent with the morphological classification in the families. However, the phylogenetic relationships were slightly different from the morphological classification in Faviidae. This result suggested that morphological classification may be limited by coral skeleton plasticity. These findings provide basic data for studying the genetic relationship of Wailingding Island corals and a theoretical basis for resource protection of stone corals in this area.

Scleractinian; COI; 16S RNA; ITS; Molecular phylogenetics

Dec. 22, 2016

肖寶華(1978-), 男, 福建長樂人, 高級工程師, 碩士, 主要從事海洋生態(tài)學, 特別是珊瑚生態(tài)系統(tǒng)方面研究, 電話: 0759- 2396216, E-mail: gdouxxhpaper@126.com

Q75

A

1000-3096(2017)09-0001-08

10.11759/hykx20160414001

2016-12-12;

2017-02-22

廣東省漁港建設(shè)和漁業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201708D06); 大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(KY20160107)

Guangdong Ocean and Fishery Administration Project, No. A201708D06; Dapeng New District Industry Development Fund, No. KY20160107]