楊愛華 李秀梅 韓文瑜

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林長春 130062; 2.天津市動物疫病預防控制中心,天津 300402)

單增李斯特菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立

楊愛華1，2李秀梅2韓文瑜1

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林長春 130062; 2.天津市動物疫病預防控制中心,天津 300402)

研究針對細胞增生性李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）hlyA基因設計了4條特異性的環(huán)介導等溫核酸擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了單增李斯特菌的LAMP快速檢測方法。特異性和敏感性試驗結果顯示，該方法能夠特異地檢測單增李斯特菌，其最低檢測限為3 CFU/mL。擴增產物可通過瓊脂糖凝膠電泳、顯色反應進行判定。LAMP可以快速、直觀、準確地檢測單增李斯特菌，是一種適合基層現(xiàn)場應用的檢測方法。

單增李斯特菌 環(huán)介導等溫擴增 快速檢測 hlyA基因

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的人畜共患病原菌和食源性病原菌，人畜在食用了被該菌污染的食物后，除了出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等一般細菌性食物中毒癥狀外，還會導致腦膜炎、骨髓炎、敗血癥、心肌炎、流產等，病死率高達30%。該菌在自然界分布廣泛，4℃的環(huán)境中仍可生長、繁殖，增加了冷藏食品威脅人類健康的風險，WHO已將該菌列為重點檢測的食源性致病菌之一，因此，建立快速、準確的檢測方法對保證人類和動物生命安全具有重要意義。

目前，用于單增李斯特菌的檢測技術主要有細菌分離鑒定、免疫學方法和PCR等，但上述方法花費時間較長，而且判定結果需要借助精密儀器設備，難以在基層生產中普及應用，因此建立一種簡單、快速、準確的病原診斷方法顯得十分必要。Notomi等于2000年發(fā)明了環(huán)介導等溫核酸擴增技術，該技術依賴4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列。本試驗針對單增李斯特菌的hlyA基因設計了一套LAMP特異性引物，建立了一種用于單增李斯特菌基因檢測的方法。與傳統(tǒng)PCR相比，該方法操作簡便，實驗儀器要求較低，在普通恒溫水浴鍋中反應45min即可完成，而且可以通過在終產物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結果，能快速、準確地鑒定單增李斯特菌，在基層生產中具有廣闊的推廣應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

Bst DNA聚合酶、dNTP、10×buffer（Mg2+Free）緩沖液購自紐英倫生物技術（北京）有限公司；Betaine Solution（甜菜堿）、鈣黃綠素購自美國Sigma公司，MgCl2、DNA marker購自天根生化科技（北京）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、普通質粒小提試劑盒購自杭州博日股份科技有限公司；單增李斯特菌菌株（54003，2013.11.22）由CDC惠贈；金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株購自廣州粵晨生物科技有限公司。

1.2 引物設計與合成

采用引物設計軟件Primer 4.0（http：//primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan），針對單增李斯特菌保守的hlyA基因設計了4條LAMP的特異性引物，包括2條外引物（F3和B3）以及2條內引物（FIP和BIP）。引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 單增李斯特菌DNA模板的提取

使用細菌基因組DNA提取試劑盒對單增李斯特菌細菌培養(yǎng)液提取基因組DNA，經核酸蛋白定量儀定量后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單增李斯特菌LAMP檢測方法反應體系的建立

根據(jù)反應體系優(yōu)化策略，依次對引物濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和反應溫度進行優(yōu)化，具體梯度如下：內、外引物濃度比分別為：4、6、8、10，外引物終濃度為0.2μmol·L-1，其對應的內引物終濃度分別為：0.8、1.2、1.6、2.0μmol·L-1；Mg2+終濃度分別為2、3、4、6、8、10 mmol·L-1；甜菜堿終濃度分別為：0.4、0.6、0.8、1.0mmol·L-1；反應溫度分別為61、62、63、64、65℃；在25μL的反應體系中dNTP混合液終濃度為1.4 mmol·L-1，1×buffer（Mg2+free），Bst DNA聚合酶8 U，模板2μl。所有體系在63℃分別反應45 min，80℃加熱2 min終止反應，取5μl反應產物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳的反應體系。

1.5 單增李斯特菌LAMP反應產物的鑒定

1.5.1 電泳分析與測序鑒定

將含LAMP反應液的PCR反應管置于水浴鍋中63℃等溫擴增45min后，取5μL反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠分析和測序驗證。

1.5.2 可視化鑒定

反應前在LAMP反應液中加入1μl的熒光染料鈣黃綠素，LAMP反應結束后用肉眼直接觀察LAMP反應液的顏色變化。反應液顏色呈現(xiàn)綠色為陽性，反應液顏色呈現(xiàn)橘紅色為陰性。

1.6 LAMP的敏感性試驗

將單增李斯特菌細菌培養(yǎng)液經平板菌落計數(shù)后進行10倍梯度稀釋，用建立的LAMP檢測方法分別對各稀釋度單增李斯特菌菌液DNA模板進行擴增，擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定檢測方法的敏感性。

1.7 LAMP的特異性試驗

將單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株基因組核酸，按照建立的LAMP檢測方法，進行特異性試驗。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 LAMP 檢測方法反應條件的建立

優(yōu)化后的反應體系（2 5 μ l）確定為：外引物（F 3和B3）（5pmol·μl-1）各0.5μl，內引物（FIP和BIP）（40pmol·μl-1）各0.5μL，Mg2+（25mM）6μl，甜菜堿（5M）4μl，dNTP混合液（10mM）3.5μl，10×buffer（Mg2+free）2.5μl，Bst DNA聚合酶（8 U·μl-1）1μl，模板2μl，去離子水3μl，鈣黃綠素1μl。最佳反應溫度為63℃。

2.2 LAMP產物的電泳與測序分析結果

將提取的單增李斯特菌DNA進行LAMP擴增，取5μl反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，單增李斯特菌DNA擴增出了梯狀條帶，而陰性對照沒有擴增產物，表明建立的LAMP檢測方法可以用于單增李斯特菌核酸的檢測。測序結果分析表明，擴增產物目的片段與單增李斯特菌（GENBANK：HM589603.1）的同源性達到99.92%，證明LAMP產物為單增李斯特菌基因片段。

圖1 單增李斯特菌LAMP產物電泳圖

2.3 LAMP產物的可視化鑒定結果

在LAMP反應前加入熒光染料鈣黃綠素，反應結束后通過肉眼觀察，陽性樣品管呈綠色，而對照陰性管橘紅色，見圖2。其結果與LAMP產物電泳結果一致，表明加入鈣黃綠素后所呈現(xiàn)的顏色反應具有特異性。

圖2 單增李斯特菌LAMP可視化結果

2.4 LAMP敏感性試驗

單增李斯特菌細菌培養(yǎng)液經平板菌落計數(shù)后，原始菌濃度為3×106CFU/ml，10倍梯度稀釋菌液后，分別提取DNA模板進行LAMP擴增，擴增產物經1.5%的瓊脂凝膠電泳鑒定，結果見圖3。圖中3 CFU/mL以上的稀釋度均顯示了典型的LAMP擴增條帶，且信號依次遞增。說明該方法的靈敏度理論上可達到大約3 CFU/ml的水平。

圖3 敏感性試驗結果

LAMP特異性試驗

將單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株的基因組DNA進行LAMP反應，結果見圖4。該結果表明，只有單增李斯特菌的DNA出現(xiàn)目的條帶，其他均未擴增出任何條帶。

圖4 特異性試驗結果

3 討論

從本試驗可以看出，LAMP 擴增方法具有普通PCR 無法比擬的優(yōu)點：（1）只需一恒定溫度就能擴增反應。（2）高特異性。原理上LAMP法擴增的特異性很高，因此可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與否，即能夠進行細菌或病毒的定性檢測。（3）快速、高效擴增。整個擴增大約1 h 即可完成。（4）靈敏度高：擴增模板可達約3 CFU/ml。（5）步驟簡單。反應不需PCR 儀和特殊試劑，在水浴鍋中就能進行。（6）鑒定簡便。LAMP 擴增過程中，核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生大量的副產物—焦磷酸鎂沉淀，使陽性反應管有明顯的變渾濁現(xiàn)象，肉眼即可直接觀察結果。但在本試驗中我們發(fā)現(xiàn)產生這種沉淀的重復性不高且量很小，其靈敏度也低于瓊脂糖凝膠電泳分析法，這也是今后需要進一步研究的內容。同時大量的擴增產物在結合核酸染色劑鈣黃綠素的情況下，有肉眼可見的顏色變化（陰性為橙黃色，陽性偏綠色），結果肉眼可視。

保證引物的特異性是LAMP方法建立的關鍵。因此，選擇特異的保守基因作為靶基因，用來設計合適的引物至關重要。本研究選擇的靶基因是在李斯特菌屬種間有很高同源性，并且是單增李斯特菌最主要的致病因子的hlyA基因。利用該設計引物，經Blastn和Clustal W比對分析，在理論上保證其特異性并位于hlyA基因保守區(qū)段，再經對實際菌株樣品檢測進一步驗證，結果表明，本研究建立的LAMP快速檢測方法能特異性的檢測和鑒定單增李斯特菌，與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌無交叉反應，具有很高的特異性，能夠有效地避免假陽性問題。

為了提高檢測效率，縮短檢測周期，本研究建立了檢測單增李斯特菌的LAMP檢測方法。結果顯示該方法是一種快速、實用、靈敏的檢測技術，如果進一步優(yōu)化、完善和推廣，該技術將會在單增李斯特菌的早期診斷及預防控制方面發(fā)揮重要作用。

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楊愛華（1981-），女，獸醫(yī)師，本科學歷，主要從事動物疫病防控及實驗室檢測工作。

韓文瑜（1955-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為病原微生物學與免疫學。