廖 青 周群麗 唐艷華 黃 鋒 許道軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,湖南長沙 410128)

轉(zhuǎn)錄組測序技術在篩選免疫相關基因中的應用

廖 青 周群麗 唐艷華 黃 鋒 許道軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,湖南長沙 410128)

轉(zhuǎn)錄組是細胞或組織內(nèi)全部的RNA轉(zhuǎn)錄本，可以從整體水平上反映細胞中所有基因的表達情況及其調(diào)控規(guī)律，揭示細胞和組織中的分子構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術是對轉(zhuǎn)錄組進行深度測序的技術。利用RNA-Seq技術對機體免疫相關基因進行篩選，可為進一步研究宿主對抗病原提供新的思路。本文主要對RNA-Seq技術、RNA-Seq測序平臺的原理及特點以及RNA-Seq技術在篩選免疫相關基因中的應用做一概述。

RNA-Seq技術 轉(zhuǎn)錄組 免疫基因

RNA-Seq是隨著高通量測序發(fā)展起來的對整個轉(zhuǎn)錄組進行分析的方法，即從總RNA中富集出單鏈mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，而后對其進行深度測序分析[1]。RNA-Seq可對任意物種的所有轉(zhuǎn)錄本進行檢測，通過與基因組進行比對發(fā)現(xiàn)差異表達基因，還能發(fā)現(xiàn)未知及稀有轉(zhuǎn)錄本、可變剪切、cSNP（codingregion single nucleotide polymorphism）、UTR（untranslated region）、內(nèi)含子邊界鑒定等[2]。本文主要對RNA-Seq技術、RNA-Seq測序平臺的原理及特點以及RNA-Seq技術在篩選免疫相關基因中的應用做一概述，并對目前RNA-Seq技術目前存在的問題進行了展望。

1 RNA-Seq測序平臺

1977年，生化學家Fred Sanger及其同事創(chuàng)建了用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止檢測DNA核苷酸序列的技術，即Sanger末端終止法[3]。另外還有傳統(tǒng)的鏈終止法，化學降解法[4]，以及在此基礎上發(fā)展的各種DNA測序技術統(tǒng)稱為第一代測序。第一代測序技術的誕生，為人類在動植物及微生物基因組的研究提供了科學的工具。但是，第一代測序檢測通量低且費時費力。因此，隨著科技的進步，高通量測序技術即第二代測序技術問世。自2005年以來，主要有三種轉(zhuǎn)錄組測序技術平臺可用于RNA-Seq測序：ROCH/454 FLX測序技術、 Illumina/Solexa測序技術以及ABI/SOLiD測序技術。由于各測序技術平臺的原理及特點有差別，因此我們應了解各高通量測序技術的優(yōu)缺點根據(jù)實驗的需要對測序平臺進行選擇。

1.1 ROCH454 GS FLX測序

2003年，454公司首創(chuàng)了邊合成邊測序技術，推出一種新的基于焦磷酸測序法的高通量基因組測序系統(tǒng)[5]，這為新一代測序技術奠定了堅實的基礎。之后，ROCH收購了454公司，在此基礎上對測序性能進行改造和優(yōu)化，于2008年研制出一種更加先進的基因組焦磷酸測序系統(tǒng)——Genome Sequncer FLX System。此測序技術的流程為：①構(gòu)建測序文庫：將樣品DNA隨機切割成300-800bp的小片段并在兩端加錨定接頭。② 乳液PCR：1個DNA片段與1個磁珠結(jié)合，在一個油包水的微反應器中進行獨立擴增。③ GS FLX測序：將帶有擴增產(chǎn)物的磁珠放入PTP載板后上機測序，每發(fā)生1個堿基配對即產(chǎn)生1個焦磷酸，焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下產(chǎn)生熒光信號并被配套的儀器實時收集?？偟膩碚f，GS FLX的測序流程為：1個片段+1個磁珠=1個讀長。

由于454GS FLX測序平臺的測序讀長長、速度快、通量高、準確率高，可以不需分離細菌直接對不能分離培養(yǎng)的微生物進行研究。解決了復雜微生物群研究過程中的難題。因此，454測序平臺在微生物生態(tài)學研究中應用最為廣泛。

1.2 Illumina Solexa測序

Genome Analyzer IIx是Solexa公司研發(fā)的具有“DNA簇”“可逆性末端終結(jié)”專利技術的第二代測序儀[6]。2007年被Illumina公司收購，2010年升級優(yōu)化到Hiseq2000。是目前為止，在各個領域中使用最多的測序平臺。此測序技術的流程為：①構(gòu)建測序文庫：將DNA隨機打斷成200～500bp的片段并在每條打斷了的DNA片段兩端加上接頭。②錨定接頭：帶接頭的DNA片段與測序通道中的單鏈接頭連接。③產(chǎn)生DNA簇：橋式PCR擴增后，測序通道表面生成DNA簇。④單堿基邊延伸邊測序：在測序通道內(nèi)加入接頭引物、DNA聚合酶以及被熒光標記的dNTP，當堿基延伸時釋放熒光信號并收集記錄，記錄完成后，淬滅熒光信號并進行下一輪測序。

1.3 ABI SOLiD測序

2007年ABI公司推出了SOLiD測序系統(tǒng)。該系統(tǒng)的特點是通過DNA連接酶在連接時對待測樣品DNA進行測序，即邊連接邊測序[7]。此測序技術的流程為：① 構(gòu)建測序文庫：與454測序類似。②乳液PCR：與454測序類似。③邊連接邊測序：在測序小孔內(nèi)加入DNA連接酶、引物以及八聚核苷酸探針。此探針的第6--8位堿基帶有熒光標記，由于連接法測序是2堿基編碼的測序，因此，探針的第1和第2位堿基被DNA聚合酶連接上即發(fā)出熒光信號，在熒光信號記錄完成后，在探針的第5位后切斷熒光信號。之后進行第6和第7位置的測序，每次測序位置相差5位，以此類推至DNA片段末尾。由于通用引物在第二輪測序比第一輪測序前移1位，因此要完成全部位置的測序需要5輪反應。

這種雙堿基編碼技術以2個堿基對應1個熒光信號，使得每個位點能被檢測兩次，大大降低了測序的錯誤率。

1.4 三種測序平臺的比較

測序情況分析詳見表1。

表1 測序情況分析表

2 RNA-Seq技術簡介

轉(zhuǎn)錄組是一個細胞或組織內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA和非編碼RNA。我們對轉(zhuǎn)錄組的研究通常是以mRNA為主。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術是最近幾年發(fā)展起來的獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的一項高通量測序技術[1]。與基于雜交的基因芯片技術（DNA microarray或DNA macroarray）、基于標簽的基因表達系列分析技術（Serial analysis of gene expression，SAGE）及大規(guī)模平行信號測序技術（Massively parallel signature sequencing，MPSS）相比，RNA-Seq技術可以獲得任意物種的全基因組序列，能檢測到未知基因發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。這對未知基因組序列物種的研究尤為重要。葛怡靜等人用RNA-Seq技術對黃蜻頭部進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)黃蜻的遷飛與線粒體和代謝活動基因有關。為后續(xù)的研究提供了依據(jù)[8]。RNA-Seq技術具有高度的靈敏性，可以檢測表達量極低的轉(zhuǎn)錄本。另外，RNA-Seq技術檢測通量高，重復性好[9]。近年來，此技術廣泛應用于動植物學研究中，為生命科學研究提供全新的角度。

RNA-Seq技術的流程為：首先提取樣品中的總RNA，將RNA富集純化后片段化處理，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（或先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再將cDNA打碎成小片段），然后在cDNA片段兩段加上接頭，PCR擴增文庫。最后利用測序平臺獲得序列數(shù)據(jù)。具體流程如圖1：

圖1 RNA-Seq實驗流程圖

3 RNA-Seq技術在篩選免疫相關基因中的應用

將測序獲得的原始序列信息進行過濾后得到干凈序列再生物信息學分析，若待測物種有參考基因組則將RNA-Seq所得到的結(jié)果直接與基因組進行比對，若無參考基因組則通過對序列進行拼接、從頭組裝再進行比對。從而發(fā)現(xiàn)新基因、可變剪切、重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)、獲得基因表達等結(jié)果。對基因表達的差異分析，是獲得感興趣基因的重要手段。

當機體被細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體感染后，機體啟動體液免疫和細胞免疫的抗感染作用，激活參與機體免疫應答相關信號通路的細胞因子，從而產(chǎn)生免疫應答。有學者對雛鵝和成年鵝的脾臟進行了轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過序列比對、GO分析及KEGG分析，發(fā)現(xiàn)大量與免疫相關的基因，其中TNFRSF13B、CCL4、CXCR4、TAP2基因表達差異及其顯著，為研究鵝免疫系統(tǒng)的分子機制奠定了基礎[10]。Gaur等用感染沙門氏菌的豬的脾臟進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)與免疫相關的部分基因顯著上調(diào)[11]。王慧珂等用RNA-Seq技術對被APEC損傷的雛雞小腸進行了測序分析，篩選出CCL9、DDX3X、CALB1等與免疫相關的差異基因[12]。為分析宿主抗菌感染的分子機制提供了一定的科學依據(jù)。也有學者用RNA-Seq技術對被DHAV-1感染的雛鴨肝臟做了轉(zhuǎn)錄組測序分析，研究發(fā)現(xiàn)有部分免疫基因表達上調(diào)，推測上調(diào)的免疫基因可能在抑制病毒在細胞內(nèi)的復制發(fā)揮重要作用，為深入探究DHAV-1的致病機制及雛鴨機體清除病毒的機制奠定了基礎[13]。Mu等用RNA-Seq技術對被嗜水氣單胞菌感染大黃魚前后的脾臟做了轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異顯著表達的基因主要集中在Toll- like、JAK-STAT和MAPK等免疫信號通路[14]。Pereiro等采用RNA-Seq技術對免疫刺激后的大菱蝦進行轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG分析在Toll- like受體、補體凝血級聯(lián)、T細胞受體和B細胞受體等重要的免疫信號通路中得到了很多參與免疫防御的基因[15]。這些基因的發(fā)現(xiàn)對研究魚類的免疫系統(tǒng)及抗病作用有了很大的幫助。因此，利用RNA-Seq技術對機體免疫相關基因進行篩選，可為進一步研究宿主對抗病原提供新的思路。

4 展望

RNA-Seq技術的發(fā)展為動植物及微生物轉(zhuǎn)錄組學研究提供了新的技術手段，但RNA-Seq能產(chǎn)生非常龐大的數(shù)據(jù)，如何借助生物信息學對測序數(shù)據(jù)進行挖掘使其為后續(xù)的研究提供最大的價值，是目前來說最大的挑戰(zhàn)。相信隨著相關學科的發(fā)展，RNASeq技術面臨的困難也會被解決。

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