整合素β8在惡性黑素瘤細(xì)胞增殖及侵襲中的作用

廖曉容1 高永良2

目的:明確整合素β8(ITGB8)在惡性黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法:Transwell侵襲實驗在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中獲得侵襲性癌細(xì)胞和相對靜止性癌細(xì)胞，RT－PCR比較兩者整合素家族的表達。流式分選ITGB8細(xì)胞，比較其侵襲能力的差異。使用siRNA敲除技術(shù)敲低ITGB8，敲低效率分別為:si1組50%，si2組70%，si3組80%，比較其增殖、侵襲能力的變化。Western bolt檢測細(xì)胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶及EMT相關(guān)分子的表達變化，提取細(xì)胞核蛋白比較細(xì)胞核內(nèi)β－catenin的變化。利用TCF4的啟動子報告質(zhì)粒檢測Wnt/β－catenin信號通路的激活情況。結(jié)果:ITGB8在侵襲性癌細(xì)胞中高表達，是靜止性癌細(xì)胞的5倍(P＜0．01);ITGB8陽性組侵襲細(xì)胞數(shù)為516±45，陰性組為120±22，差異有顯著性(P＜0．01);與Mock組細(xì)胞相比，si2和si3組細(xì)胞的增殖速度明顯減弱(P＜0．01)，敲低后細(xì)胞阻滯在S期。與Mock細(xì)胞相比Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在si2和si3細(xì)胞中的表達明顯減少，Ecadherin明顯增加。si2、si3細(xì)胞核內(nèi)β－catenin相比Mock組明顯減少(P＜0．05)。敲低ITBG8后TCF4的啟動子活性明顯降低。結(jié)論:ITGB8對惡性黑素瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移具有重要作用，可能是通過調(diào)控Wnt/β－catenin信號通路發(fā)揮作用。

惡性黑素瘤;TGB8;Wnt/β－catenin信號通路;侵襲;轉(zhuǎn)移

惡性黑素瘤是危害人類健康的惡性腫瘤，是女性三大惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、死亡率高的特點。侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性黑素瘤的主要特點和致死原因［1］。近年來惡性黑素瘤治療手段不斷改進，但其死亡率依然較高，主要原因就是對其侵襲、轉(zhuǎn)移的機制認(rèn)識不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，整合素家族在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中越來越被關(guān)注，并發(fā)現(xiàn)整合素β8(integrinβ8，ITGB8)在前列腺癌的發(fā)生［2］、肝癌的耐藥［3］、胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［4］、乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移［5］等都發(fā)揮作用，并且發(fā)現(xiàn)ITGB8同ITGB6具有活化TGF－β的作用［6］。但ITGB8在黑素瘤中的作用及其分子機制并不清楚。為此，我們研究了ITGB8在惡性黑素瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的作用，探討ITGB8對黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)、試劑和儀器A375細(xì)胞系(ATCC提供)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素(美國Gibco公司)，胰酶、EDTA(北京索萊寶);ITGB8鼠抗人單克隆抗體(Abcam，ab30436)，RIPA裂解液、SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS－PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CCK8檢測試劑(碧云天)，硝酸纖維素(NC)膜、化學(xué)發(fā)光試劑盒(Immun－StarTM WesternCTM Chemiluminescence kit)(美國Biorad公司)。

1．2 siRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞siRNA交由吉瑪基因公司合成。siITGB8序列分別為:Mock:ACCCGTTTATGTGTCTCCCGGCAAA，sh1:CATGAAACTTTCAGGTGCAACTTCTsh2:ACCGCTGCATTTGTCTGCCTGCAAAsh3:TGAAGACAATAGATGTGCATCTTCA。

利用LipofectamineTM2000(Thermofisher公司)的轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，將A375細(xì)胞消化重懸后取2× 105個鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后采用無血清的培養(yǎng)基饑餓6 h，配制轉(zhuǎn)染試劑200μL=10μL LipofectamineTM2000+10μL siRNA+180μL OPTI－MEM。搖晃著加入6孔板中，6 h后換成正常的含血清培養(yǎng)基，48 h后取細(xì)胞進行檢測及后續(xù)實驗。

1．3 RT－PCR引物由Invitrogen公司合成，稀釋引物前瞬時離心，按照說明書，使用滅菌水將引物稀釋成10 nM的工作液，總RNA提取采用RNAiso。cDNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR采用TakaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒。

1．4 Western blot取10 cm培養(yǎng)皿細(xì)胞1皿用PBS溶液潤洗2次，置于冰上，加入RIPA蛋白裂解液400 μL，用細(xì)胞刮反復(fù)搔刮細(xì)胞，在冰上放置30 min。收集蛋白裂解液至1．5 mL EP管中，15000 r/min 4℃離心15 min。吸取轉(zhuǎn)移上清蛋白液至新的1．5 mL離心管中。蛋白濃度測定采用Thermo公司BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計算蛋白濃度，并將各樣品濃度調(diào)為一致。按照比例添加5X SDSPAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后100℃煮5 min充分變性蛋白。照上述方法配制好分離膠和濃縮膠，將玻璃板組裝入電泳槽中，加入500 mL電泳液，然后拔出梳子，使用微量加樣器上樣，每孔上樣30μg總蛋白，樣品旁孔加入預(yù)染的蛋白marker。電泳至溴酚藍到達膠的底端處時停止電泳，將濾紙和PVDF膜浸泡入配好的膜轉(zhuǎn)移緩沖液中，將濾紙、PVDF膜及凝膠制作三明治，放入電轉(zhuǎn)槽中。使用濕轉(zhuǎn)，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為恒流150 mA，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入準(zhǔn)備好的封閉液中(5%脫脂奶粉溶液)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1～2 h。取出封閉后的PVDF膜，立即加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。取出孵育一抗的膜，使用PBST洗滌3次，每次15 min，然后將膜放入稀釋好的二抗溶液中，室溫?fù)u床上緩慢搖動孵育2 h，然后使用PBST洗滌3次，每次15 min。蛋白檢測:使用Thermo公司的顯影液進行蛋白顯影，并照相。

1．5 Transwell侵襲實驗使用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(預(yù)冷至4℃)，等比例稀釋基質(zhì)膠，吸取10μL稀釋好的基質(zhì)膠，均勻涂布于Transwell小室上室底部的膜表面，37℃培養(yǎng)箱30 min使基質(zhì)膠凝固。分別消化Mock、sh1、sh2組細(xì)胞并洗滌去除血清后使用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸取2×105細(xì)胞200μL加入Transwell小室的上室，下室加入500μL 10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，用PBS潤洗小室2次然后用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min。A染液染色，然后用棉簽輕輕擦去膜上面的細(xì)胞，洗凈后隨機選取5個視野照相并計數(shù)細(xì)胞，進行統(tǒng)計分析。

1．6 CCK8及細(xì)胞周期測定按照碧云天公司提供的說明書進行。

1．7 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17．0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 Transwell模型分選侵襲差異的兩類細(xì)胞如圖1a中模式圖所示，我們利用在A375中獲得侵襲能力具有差異的兩區(qū)細(xì)胞，利用擦刮和胰酶消化的方法可以得到上下兩群細(xì)胞(上群為靜止性癌細(xì)胞;下群為侵襲性癌細(xì)胞)。利用RT－PCR的方法比較常見的整合素家族分子在上下兩群細(xì)胞間的差異(圖1b)，發(fā)現(xiàn)整合素β8(ITGB8)表達差異最為顯著(5倍)。在A375中檢測發(fā)現(xiàn)正常的A375中12%的細(xì)胞是ITGB8陽性細(xì)胞，并檢測了分析出來的陰性核陽性細(xì)胞ITBG8的表達差異，發(fā)現(xiàn)差異具有顯著性，進一步說明分選的效率達到實驗的要求(圖1c)。在分選得到了陰性核及陽性兩群細(xì)胞后，分別進行Transwell侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)ITBG8陽性細(xì)胞具有更強的侵襲能力，ITGB8陰性組為(120±22)個，陽性組為(516±45)個，差異有顯著性(圖1d，P＜0．01)，反過來也驗證了ITBG8可以作為侵襲性惡性黑素瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。

圖1 1a:用胰酶消化的方法得到靜止性癌細(xì)胞和侵襲性癌細(xì)胞，1b:用RT－PCR的方法發(fā)現(xiàn)ITBG8表達有顯著差異性，1c:用流式分選再次證明ITBG8表達有顯著差異性，1d:用Transwell侵襲實驗，證實ITBG8陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞侵襲力差異有顯著性

2．2 siRNA下調(diào)ITBG8的表達對黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為證明ITGB8對A375細(xì)胞侵襲能力的影響，我們利用siRNA技術(shù)選擇性的敲低ITBG8的表達，如圖2a所示，通過RT－PCR和Western Blot發(fā)現(xiàn)在合成的3個siRNA中，si2和si3的調(diào)低可以達到70%以上。利用CCK8實驗，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ITBG8可明顯抑制細(xì)胞的增殖能力(圖2b)，細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ITBG8可明顯增加S期，而減少G0/G1期(圖2c)。利用下調(diào)ITBG8細(xì)胞及對照細(xì)胞進行Transwell侵襲實驗，同樣發(fā)現(xiàn)下調(diào)ITGB8后可抑制細(xì)胞的侵襲能力，侵襲的細(xì)胞數(shù)Mock組為(573±57)個，si2組為(210±29)個，si3組為(125±20)個，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)(圖2d)。

2．3 下調(diào)ITBG8后對細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達Cyclin D1的影響在下調(diào)ITBG8的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1的表達明顯降低。通過Western Blot發(fā)現(xiàn)在下調(diào)ITBG8細(xì)胞中后si2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在和si3中明顯降低，Ecadherin在si2和si3中明顯增加(如圖3)。我們利用細(xì)胞核提取試劑盒在Mock和si2、si3細(xì)胞中得到了細(xì)胞核蛋白，通過檢測β－catenin的表達量發(fā)現(xiàn)敲低ITGB8后可以明顯減少核內(nèi)β－catenin的量(圖3a)。進一步我們利用了TCF4的啟動子雙熒光素報告系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)染TOP、FOP和海參熒光素質(zhì)粒，24小時后檢測其熒光素值，發(fā)現(xiàn)敲低ITBG8后可以明顯降低TCF4的啟動子活性，抑制了Wnt/β－catenin信號通路的活化(圖3b)。

圖2 2a:用RT－PCR和Western Blot發(fā)現(xiàn)si2和si3表達下調(diào)，RT－PCR的方法發(fā)現(xiàn)ITBG8表達有顯著差異性，2b:敲低ITBG8，顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，2c:用細(xì)胞周期試劑盒發(fā)現(xiàn)敲低ITBG8，可以明顯增加S期，而減少G0/G1期，2d:敲低細(xì)胞和Transwell侵襲實驗同樣證實ITGB8降低，可抑制細(xì)胞的侵襲能力，差異有顯著性圖3 3a:通過檢測β－catenin的表達量，發(fā)現(xiàn)敲低ITGB8可明顯減少核內(nèi)β－catenin的量;3b:用TCF4的啟動子雙熒光素報告系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)染TOP、FOP和海參熒光素質(zhì)粒，同樣證實敲低ITBG8后可明顯減弱TCF4的啟動子活性

3 討論

整合素是細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的重要分子，由α和β兩種亞基結(jié)合而成，目前發(fā)現(xiàn)整合素家族包括了18個α亞基和8個β亞基共同組成24個整合素分子，其配體包括了細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分如膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白及骨橋蛋白等。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)而影響細(xì)胞形狀、細(xì)胞遷移能力以及細(xì)胞周期變化。整合蛋白自身并不具有激酶結(jié)構(gòu)域或酶活性，其發(fā)揮作用主要依靠其他信號分子的作用來傳輸信號［7，8］。目前研究發(fā)現(xiàn)整合素家族分子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥治療等都有重要作用［9－11］。有研究發(fā)現(xiàn)如果在干細(xì)胞表達中缺失整合素會導(dǎo)致細(xì)胞分化異常而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生［12］。吳殿青的研究發(fā)現(xiàn)整合素信號能夠調(diào)控中性粒細(xì)胞的極性，猜測其在腫瘤免疫中可能也發(fā)揮作用［3］。Cordes等［13］確定β1－整合素(β1－integrin)/FAK/皮層肌動蛋白(cortactin)信號傳導(dǎo)途徑在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌抗放射治療中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。Moore的研究發(fā)現(xiàn)通過αvβ6靶向抗體264RAD可以明顯減少乳腺癌的大小和侵襲，聯(lián)合赫賽汀治療則能完全根除小鼠腫瘤［14］?？拐纤豤t5131的抗體能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與ECM的黏附，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長［15］。

惡性黑素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，目前全球的死亡率為4/5，其惡性程度與其高侵襲高轉(zhuǎn)移的特性密切相關(guān)，臨床上較難早期診斷，發(fā)現(xiàn)時病情已經(jīng)迅速發(fā)展。因此能夠闡述其侵襲轉(zhuǎn)移的機制對其預(yù)后的判斷，治療手段的發(fā)展都具有重要意義［16－18］。在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是其重要的機制和指標(biāo)分子，腫瘤細(xì)胞通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，不斷破壞周圍的組織結(jié)構(gòu)，同時獲得侵襲的空間。EMT是近年來逐漸被認(rèn)可的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移新機制，EMT最初是在胚胎發(fā)育的過程中被發(fā)現(xiàn)，隨后Wenberge教授將其引入腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中，即上皮源性的腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展中可以通過發(fā)生EMT而獲得間葉源性細(xì)胞的表型，具有更低的黏附能力，和更強的運動能力，而Ecadherin、Ncadherin、Vimentin被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生EMT重要的指標(biāo)分子，ITBG8一方面可以通過分泌更多的基質(zhì)金屬蛋白酶來獲得侵襲空間，另一方面也可以通過EMT來獲得更強運動能力。為了進一步探討ITBG8是通過什么樣的機制來調(diào)控細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，我們查閱文獻發(fā)現(xiàn)與周期及侵襲相關(guān)的信號通路是Wnt/β－catenin信號通路，經(jīng)典的Wnt/β－catenin信號通路是細(xì)胞在Wnt蛋白的作用下通過分子間的相互作用引起β－catenin在細(xì)胞漿的累積而進入細(xì)胞核結(jié)合TCF的啟動子區(qū)進而引起下游分子的變化，例如Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7等都是其經(jīng)典的下游分子。而β－catenin在細(xì)胞內(nèi)還會與Ecadherin相互結(jié)合在細(xì)胞膜上，Ecadherin的表達降低意味著會有更多的β－catenin得到釋放，而細(xì)胞核激活Wnt/β－catenin信號通路。

在本實驗中，我們通過Transwell實驗成功的分離了惡性黑素瘤細(xì)胞的兩個亞群，并在此基礎(chǔ)上研究了整合素家族在其中的表達差異，發(fā)現(xiàn)ITGB8在兩個亞群中的表達明顯不同，通過Transwell侵襲實驗，我們發(fā)現(xiàn)ITBG8陽性細(xì)胞具有更強的侵襲能力，ITGB8陰性組為(120±22)個，陽性組為(516±45)個，差異有顯著性，說明ITBG8可能在惡性黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用，反過來也驗證了ITBG8可以作為侵襲性惡性黑素瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。我們還證實了ITBG8可以影響惡性黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，利用CCK8實驗，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)ITBG8可明顯抑制細(xì)胞的增殖能力，同時明顯增加S期，并減少G0/G1期，利用下調(diào)ITBG8細(xì)胞及對照細(xì)胞進行Transwell侵襲實驗，同樣發(fā)現(xiàn)下調(diào)ITGB8后可抑制細(xì)胞的侵襲能力。實驗中我們發(fā)現(xiàn)敲低ITBG8后可以明顯降低TCF4的啟動子活性，抑制了Wnt/β－catenin信號通路的活化。我們推測其具體的分子調(diào)控機制可能和Wnt/β－catenin信號通路的調(diào)控有關(guān)［19］，利用Wnt/β－catenin信號通路激活判斷標(biāo)準(zhǔn)，我們進一步證明了ITBG8確實是可以通過調(diào)控Wnt/β－catenin信號通路進一步調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期及侵襲轉(zhuǎn)移能力。

通過本實驗我們認(rèn)為ITGB8對惡性黑素瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移具有重要作用，可能是通過調(diào)控Wnt/β－catenin信號通路發(fā)揮作用。然而由于實驗條件的限制，我們的研究仍然不足，如果有能力進行更大范圍的基因及信號通路的篩選，可能會尋找到更有意義的分子，且在ITBG8的作用這方面沒有進行體內(nèi)實驗，缺少了一個重要證據(jù)。但是我們的研究結(jié)果仍然給研究人員提供了重要的方向和思路，提示ITBG8在惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到了關(guān)鍵作用。

［1］DeSantis CE，Lin CC，Mariotto AB，et al．Cancer treatment and survivorship statistics［J］．CA Cancer J Clin，2014，64 (4):252－271．

［2］Mertens－Walker I，F(xiàn)ernandini BC，Maharaj MS，et al．The tumour－promoting receptor tyrosine kinase，EphB4，regulatesexpression of Integrin－beta8 in prostate cancer cells［J］．BMC Cancer，2015，15:164．

［3］Wang WW，Wang YB，Wang DQ，et al．Integrin beta－8 (ITGB8)silencing reverses gefitinib resistance of human hepatic cancer HepG2/G cell line［J］．Int J Clin Exp Med，2015，8(2):3063－3071．

［4］Suh YS，Yu J，Kim BC，et al．Overexpression of plasminogen activator inhibitor－1 in advanced gastric cancer with aggressive lymph node metastasis［J］．Cancer Res Treat，2015，47(4):718－726．

［5］Culhane AC，Quackenbush J．Confounding effects in"a sixgene signature predicting breast cancer lung metastasis"［J］．Cancer Res，2009，69(18):7480－7485．

［6］Aluwihare P，Mu Z，Zhao Z，et al．Mice that lack activity of alphavbeta6－and alphavbeta8－integrins reproduce the abnormalities of Tgfb1－and Tgfb3－null mice［J］．J Cell Sci，2009，122(Pt 2):227－232．

［7］Hynes RO．Integrins:a family of cell surface receptors［J］．Cell，1987，48(4):549－554．

［8］Anthis NJ，Campbell ID．The tail of integrin activation［J］．Trends Biochem Sci，2011，36(4):191－198．

［9］Georgolios AK，Batistatou A，Charalabopoulos K．Integrins in head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC):a review of the current literature［J］．Cell Commun Adhes，2005，12(1－2):1－8．

［10］Jean C，Gravelle P，F(xiàn)ournie JJ，et al．Influence of stress on extracellular matrix and integrin biology［J］．Oncogene，2011，30(24):2697－2706．

［11］Subramani D，Alahari SK．Integrin－mediated function of Rab GTPases in cancer progression［J］．Mol Cancer，2010，9:312．

［12］van der Flier A，Sonnenberg A．Function and interactions of integrins［J］．Cell Tissue Res，2001，305(3):285－298．

［13］Arnold TD，Niaudet C，Pang MF，et al．Excessive vascular sprouting underlies cerebral hemorrhage in mice lacking alphaVbeta8－TGFbeta signaling in the brain［J］．Development，2014，141(23):4489－4499．

［14］Moore KM，Thomas GJ，Duffy SW，et al．Therapeutic targeting of integrin alphavbeta6 in breast cancer［J］．J Natl Cancer Inst，2014，106(8):169．

［15］Mattern RH，Read SB，Pierschbacher MD，et al．Glioma cell integrin expression and their interactions with integrin antagonists:Research Article［J］．Cancer Ther，2005，3A: 325－340．

［16］Mahadevan A，Patel VL，Dagoglu N．Radiation therapy in the management of malignant melanoma［J］．Oncology (Williston Park)，2015，29(10):743－751．

［17］Anthony EP，Godbolt A，Tang F，et al．Malignant melanoma disguised in a tattoo［J］．Australas J Dermatol，2015，56 (3):232－233．

［18］Braunlich J，Seyfarth HJ，F(xiàn)rille A，et al．Diffuse interstitial pulmonary infiltrates in malignant melanoma［J］．Respir Care，2015，60(7):115－117．

［19］de Sousa EM，Vermeulen L，Richel D，et al．Targeting wnt signaling in colon cancer stem cells［J］．Clin Cancer Res，2011，17(4):647－653．

(收稿:2016－02－15修回:2016－06－23)

The role of integrinβ8 in the invasion and metastasis of malignant melanoma

LIAOXiaorong1，GAOYongliang2．
1．DepartmentofDermatology，theSixthPeople＇sHospitalofChongqing，Chongqing400060，China;2．DepartmentofDermatology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China
Correspondingauthor:GAOYongliang，E－mail:gao2418@126．com

Objective:To determine the role of integrinβ8(ITGB8)in the invasion and proliferation of malignant melanoma．Methods:Melanoma cell line A375 cancer cells were divided into invasive cancer cells and non－invasive cancer cells through Transwell invasion experiment．The expression of integrin family in the A375 cancer cells was detected by RT－PCR．The invasive abilities of the A375 cancer cells of ITGB8 negative and positive cells were compared by flow cytometer．The ITGB8 positive A375 cancer cells were knocked out by siRNA knockout technology and the removal efficiency was 50%in si1 group，70%in si2 group and 80% in si3 group．The proliferation and invasion were compared among the three groups．The cellcycle protein molecules，matrix metalloproteinases and EMT related molecule were detected by Western bolt．The nucleus protein was extracted to compare the changes of Wnt/beta－catenin in the nucleus of the A375 cancer cells in different knockout efficiency．The activation of beta－catenin signaling pathway was detected through TCF4 promoter report plasmid(TOP/FOP)test．Results:The expression level of ITGB8 in invasive cancer cells was 5 times as high as in non－invasiveβ8(P＜0．01)．The number of ITGB8 positive invasive cancer cells was 516 ±45，which was higher than that in ITGB8 negative invasive cancer cells(120±22)，with a significant difference(P＜0．01)．The proliferation rate of the cells in si2 group and si3 group was lower than that in MOCK cells．Compared with the cells in MOCK group，the expression of Cyclin D1，MMP2，MMP9，MMP7 and Ncadherin，Vimentin decreased and Ecadherin increased in si2 and si3 groups．The amount of the beta－catenin in cell nucleus in the cells of si2 and si3 group was lower than that in Mock group．Promoter activity of TCF4 decreased after ITBG8 removed．Conclusion:ITGB8 plays an important role in the process of invasionand proliferation of malignant melanoma，which may through regulating the Wnt/beta－catenin signaling pathways．

Malignant melanoma，ITGB8，Wnt/beta－catenin signaling pathway，infect，transfer

1重慶市第六人民醫(yī)院皮膚科，重慶，400060 2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，400016

高永良，E－mail:gao2418@126．com