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        辛伐他汀對(duì)白癜風(fēng)氧化應(yīng)激模型中角質(zhì)形成細(xì)胞趨化因子分泌的影響

        2017-03-24 08:39:35
        關(guān)鍵詞:角質(zhì)原代趨化因子

        辛伐他汀對(duì)白癜風(fēng)氧化應(yīng)激模型中角質(zhì)形成細(xì)胞趨化因子分泌的影響

        常毓倩 李舒麗 堅(jiān) 哲 安亞文 高天文 李春英

        目的:明確辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下人原代角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)分泌趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的影響。方法:常規(guī)培養(yǎng)KC,H2O2組給予1 mM H2O2模擬白癜風(fēng)KC氧化應(yīng)激模型,實(shí)驗(yàn)組予不同濃度辛伐他汀(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L)預(yù)處理后加入H2O2;采用Real-time PCR、ELISA及Western blot檢測(cè)CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的mRNA表達(dá)及蛋白分泌。結(jié)果:辛伐他汀組CXCL9、CXCL10、CXCL11水平低于H2O2組,CCL22水平高于且呈H2O2組,呈劑量依賴方式。結(jié)論:辛伐他汀能通過應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞調(diào)控分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的水平。

        辛伐他汀;原代角質(zhì)形成細(xì)胞;氧化應(yīng)激;趨化因子

        白癜風(fēng)是一種常見的自身免疫性皮膚病,氧化應(yīng)激被公認(rèn)為是發(fā)病的重要原因之一,而T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫是黑素細(xì)胞破壞的關(guān)鍵效應(yīng)環(huán)節(jié)。研究表明[1],白癜風(fēng)皮損Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11顯著升高,介導(dǎo)白癜風(fēng)CD8+T細(xì)胞向皮膚遷移,而CCL22顯著降低,抑制Treg細(xì)胞向皮膚浸潤(rùn),最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞免疫損傷[2,3]。最近研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可顯著降低CD8+T細(xì)胞在白癜風(fēng)小鼠皮損處局部的浸潤(rùn),促進(jìn)白癜風(fēng)復(fù)色,但具體機(jī)制不清[4]。辛伐他汀是甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,也是臨床上廣泛使用的降脂類藥物。近年來(lái),大量研究證實(shí)其藥物的多效性,即“非降脂作用”,具體表現(xiàn)在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等方面[5]。值得注意的是,辛伐他汀的免疫調(diào)節(jié)作用被證實(shí)可治療多種自身免疫性疾病,并在多發(fā)性硬化中取得臨床證據(jù)[6,7]。早在2004年,No l等報(bào)道一位白癜風(fēng)合并高膽固醇血癥的患者,每日80mg大劑量口服辛伐他汀時(shí)顯著促進(jìn)了其白癜風(fēng)皮損復(fù)色[8],首次證實(shí)辛伐他汀可以治療白癜風(fēng)。本研究擬證明在氧化應(yīng)激條件下,白癜風(fēng)發(fā)病重要趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的表達(dá)變化,進(jìn)一步探討辛伐他汀對(duì)這些趨化因子表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器與試劑原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基KSFM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。辛伐他汀(分子式:C25H39NaO6,貨號(hào)D00175272)購(gòu)自Calbiochem公司。細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。RIPA裂解液及BCA蛋白定量試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司。兔抗人CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技公司。

        1.2.1 原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)及處理正常包皮組織均來(lái)源于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科2015年度2~4月,2~18歲男性,取泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后皮損,約3.0cm直徑大小,用添加雙抗的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)漂洗。剪除脂肪組織和結(jié)締組織,避免破壞表皮,將皮損剪至條狀,約1.0cm×0.5cm大,反復(fù)漂洗后移入Dispase液中,4℃過夜消化17 h。輕輕剝離皮膚表皮層,剪碎,無(wú)菌濾網(wǎng)過濾,收集過濾細(xì)胞懸液,加入含有0.25%胰酶的DMEM培養(yǎng)基,37℃消化10min,確保表皮層90%角質(zhì)形成細(xì)胞分離后終止消化。1000rpm離心10min,收集細(xì)胞,置于限制性角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(KSFM)調(diào)定細(xì)胞密度(1~2)×106接種,37℃、5%CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下持續(xù)觀察細(xì)胞,選擇培養(yǎng)到第三代至第五代的原代角質(zhì)形成細(xì)胞,進(jìn)行常規(guī)伊紅和蘇木精染色,鑒定其純度達(dá)95%,方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。常規(guī)培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%融合時(shí),實(shí)驗(yàn)組予以濃度梯度的辛伐他汀預(yù)處理24 h,之后再予以1mM H2O2處理24 h。對(duì)照組予DMSO處理,培養(yǎng)后收集細(xì)胞裂解液及上清檢測(cè)CXCL9,CXCL10,CXCL11及CCL22的分泌及蛋白、mRNA的表達(dá)水平。

        1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)趨化因子的表達(dá)Trizol試劑提取細(xì)胞RNA,按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,人CXCL9上游引物:5'-TCTAAACCCAGATTCAGCA-3',下游引物:5'-CTCCTTTGGAATGATAGCG-3';人CXCL10上游引物:5'-CTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGA-3',下游引物:5'-CAATGATCTCAACACGTGGACAA-3';人CXCL11上游引物:5'-GGGTACATTATGGAGGCTTTCTCA-3',下游引物:5'-GAGGACGCTGTCTTTGCATAGG-3',人CCL22上游引物:5'-ATCGCCTACAGACTGCACTC-3',下游引物:5'-GACGGTAACGGACGTAATCAC-3';人β-actin上游引物:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3',下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。

        1.2.3 ELISA檢測(cè)趨化因子的表達(dá)收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞上清,按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明檢測(cè)CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22分泌水平。

        1.2.4 Western blot印跡檢測(cè)趨化因子蛋白表達(dá)的水平收集實(shí)驗(yàn)處理組及對(duì)照組原代角質(zhì)形成細(xì)胞,以RIPA裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)BCA法定蛋白含量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠,12%分離膠)。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(直流電300mA)。轉(zhuǎn)膜后,用5%脫脂奶粉室溫封閉1~4 h,加入一抗(兔抗人CCL22單克隆抗體1:1000;兔抗人CXCL9多克隆抗體1:1500;兔抗人CXCL10多克隆抗體1:500;兔抗人CXCL11多克隆抗體1∶500;鼠抗人β-actin 1∶5000,均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)4℃過夜,次日予以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶5000)、山羊抗小鼠IgG(1∶5000)二抗室溫孵育1 h,使用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果。

        1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用student t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22 mRNA表達(dá)的影響在1 mM H2O2模擬白癜風(fēng)KC氧化應(yīng)激模型,Real Time-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCL9、CXCL10及CXCL11的mRNA水平均明顯上調(diào)(圖1a,c),而CCL22的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖1d)。當(dāng)用不同濃度辛伐他汀預(yù)處理KC 24 h,發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可呈劑量依賴趨勢(shì)抑制H2O2誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10及CXCL11的mRNA表達(dá),其中對(duì)CXCL10的影響最為顯著(圖1a,b),并且可以呈濃度依賴的趨勢(shì)增強(qiáng)CCL22的mRNA表達(dá)(圖1d)。

        2.2 辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的影響通過ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),同Real time-PCR結(jié)果一致,氧化應(yīng)激條件下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11的能力增強(qiáng),且CXCL10明顯呈時(shí)間依賴趨勢(shì)(圖2a,b,c),CCL22分泌降低(圖2d)。同樣,當(dāng)用不同濃度辛伐他汀預(yù)處理后,可以呈濃度依賴的趨勢(shì)抑制H2O2誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10及CXCL11分泌(圖2a,b,c),上調(diào)CCL22的水平(圖2d)。

        2.3 伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22蛋白水平表達(dá)的影響選取最佳辛伐他汀藥物濃度1.0μmol/L,預(yù)處理KC,再經(jīng)1.0 mmol/L H2O2刺激后,檢測(cè)KC中不同趨化因子蛋白表達(dá)情況。Western印記結(jié)果顯示辛伐他汀可顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10及CXCL11蛋白表達(dá),上調(diào)CCL22的表達(dá)(圖3)。

        圖1 a,b,c,d辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22 mRNA表達(dá)的影響(n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

        圖2 a,b,c,d辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的影響(n=3,#與DMSO組比較,#P<0.05,## P<0.01,###P<0.001;*與DMSO+H2O2處理組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

        圖3 辛伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22蛋白水平表達(dá)的影響

        3 討論

        研究表明,白癜風(fēng)是在特定遺傳背景下,氧化應(yīng)激與自身免疫共同作用于黑素細(xì)胞導(dǎo)致表皮色素脫失的疾病,其中氧化應(yīng)激引起免疫失調(diào)是白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9-11]。最近有研究表明Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11在白癜風(fēng)皮損處高表達(dá),通過與受體CXCR3結(jié)合促進(jìn)IFN-γ活性效應(yīng)CD8+細(xì)胞定向皮膚遷移。此外有研究發(fā)現(xiàn),白癜風(fēng)患者皮損中介導(dǎo)Treg細(xì)胞皮膚遷移的趨化因子CCL22表達(dá)下調(diào),并認(rèn)為其造成Treg細(xì)胞數(shù)量減少,不能有效抑制CD8+T細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的殺傷效應(yīng),促進(jìn)白癜風(fēng)進(jìn)展[2,12]。并且體內(nèi)研究表明,通過上調(diào)CCL22表達(dá),促進(jìn)Treg細(xì)胞的皮膚浸潤(rùn),或是采用中和抗體抑制Th1型趨化因子CXCL10表達(dá),減少CD8+T細(xì)胞的皮膚聚集,均可抑制白癜風(fēng)進(jìn)展,促進(jìn)復(fù)色[13-15]。該系列研究表明這些趨化因子的異常表達(dá)是白癜風(fēng)致病的關(guān)鍵。我們的研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激條件下,角質(zhì)形成細(xì)胞可促進(jìn)致病性Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11分泌增多,而對(duì)CCL22的表達(dá)及分泌具有顯著抑制作用,提示白癜風(fēng)角質(zhì)形成細(xì)胞在調(diào)控致病性趨化因子表達(dá)方面起重要作用。

        最近有研究報(bào)道,辛伐他汀通過作用于IFN-r-STAT1通路可顯著抑制鼻病毒感染引起的單核細(xì)胞中CXCL10的表達(dá),因此被多位學(xué)者指出可作為鼻病毒導(dǎo)致相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的治療[4]。值得注意的是,John E Harris領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在白癜風(fēng)小鼠模型中,予以高劑量的辛伐他汀治療亦可產(chǎn)生同拮抗CXCL10、CXCR3一致的效果,即減少CD8+T細(xì)胞的皮膚浸潤(rùn),促進(jìn)白癜風(fēng)白斑復(fù)色[16]。然而辛伐他汀是否可以在原代細(xì)胞水平影響白癜風(fēng)中角質(zhì)形成細(xì)胞趨化因子的表達(dá)目前尚沒有研究。我們的研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可以劑量依賴的方式,抑制氧化應(yīng)激下角質(zhì)形成細(xì)胞分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11,并且對(duì)CXCL10的影響最為顯著,且能恢復(fù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的CCL22分泌障礙,顯著上調(diào)CCL22表達(dá)水平。該結(jié)果為辛伐他汀可用于白癜風(fēng)治療提供了新的理論依據(jù),辛伐他汀調(diào)控這些趨化因子表達(dá)的具體機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。

        綜上所述,本研究明確辛伐他汀通過調(diào)控應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11,以及CCL22的水平,促進(jìn)白癜風(fēng)局部免疫穩(wěn)態(tài)平衡,起到治療白癜風(fēng)的作用。

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        (收稿:2016-09-07修回:2016-10-26)

        Effects of simvastatin on the expression of chemokine in the keratinocyte under oxidative stress

        CHANGYuqian,LIShuli,JIANZhe,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.
        DepartmentofDermatology,XijingHospital,F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China Correspondingauthor:LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

        Objective:To determine the effect of simvastatin on the expression of CXCL9,CXCL10,CXCL11 and CCL22 in H2O2-treated primary human keratinocytes(KC).Methods:KC in the experimental group was pre-treated with different concentration of simvastatin(0.1μmol/L,0.5μmol/L and 1.0μmol/ L),and then,exposed to 1.0 mM H2O2for 24 h.KC in the H2O2group was treated with 1.0 mM H2O2only.The expression levels of mRNA and protein of CXCL9,CXCL10,CXCL11 and CCL22 were detected by Real-time PCR,Western blot and ELISA.Results:The expression levels of mRNA and protein of CXCL9,CXCL10 and CXCL11 in the experimental group were higher than those in H2O2group,and the level of CCL22 was lower than that in H2O2group.Conclusion:Simvastatin can influence the levels of CXCL9,CXCL10,CXCL11 and CCL22 through regulating oxidatively stressed KC.

        simvastatin;keratinocytes;oxidative stress;chemokine

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):XJZT15M10,81402599)作者單位:第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院,西安,710032

        李春英,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

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