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        申克孢子絲菌酵母相對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路及TNF-α的影響

        2017-03-24 08:39:35劉彩霞段志敏杜蕾蕾曾榮沈永年胡素泉?jiǎng)⒕S達(dá)陳青李
        關(guān)鍵詞:絲菌孢子孵育

        劉彩霞段志敏杜蕾蕾曾 榮沈永年胡素泉?jiǎng)⒕S達(dá)陳 青李 岷

        申克孢子絲菌酵母相對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路及TNF-α的影響

        劉彩霞1段志敏1杜蕾蕾1曾 榮1沈永年1胡素泉1劉維達(dá)1陳 青2李 岷1

        目的:明確申克孢子絲菌酵母相對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)NF-κB信號(hào)通路激活和腫瘤壞死因子α(TNF-α)分泌的影響。方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α分泌量,免疫印跡法分析申克孢子絲菌酵母相體外作用于THP-1細(xì)胞后IκBα和磷酸化IκBα的水平,免疫熒光法觀察NF-κB-p65核轉(zhuǎn)位。同時(shí)設(shè)置地塞米松(NF-κB抑制劑)抑制組,并檢測(cè)100 nM地塞米松預(yù)處理THP-1細(xì)胞后TNF-αmRNA水平的變化。結(jié)果:申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后6 h TNF-αmRNA水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.001)。申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后24 h,TNF-α蛋白水平為(4610.419±121.501)pg/mL,顯著高于空白對(duì)照組(186.964±98.073)pg/mL,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。申克孢子絲菌酵母相作用THP-1細(xì)胞后30~60 min,磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高,為時(shí)間依賴性。申克孢子絲菌酵母相組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB-p65較空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。100 nM地塞米松預(yù)處理各組THP-1細(xì)胞后,TNF-αmRNA水平較前明顯降低。結(jié)論:人THP-1細(xì)胞體外與申克孢子絲菌酵母相作用后激活NF-κB信號(hào)通路并上調(diào)TNF-α分泌。

        申克孢子絲菌;單核細(xì)胞白血病;腫瘤壞死因子α;NF-κB

        孢子絲菌病(sporotrichosis)是一種由雙相病原真菌申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)感染引起的亞急性或慢性肉芽腫性疾病。申克孢子絲菌是一種分布于自然界的腐生菌,可從土壤、木材、植物、水果、昆蟲(chóng)、海藻、海生動(dòng)物及動(dòng)物糞便中分離出來(lái)。孢子絲菌病遍布世界各地,熱帶及亞熱帶地區(qū)多見(jiàn),在我國(guó)主要集中于東北及長(zhǎng)江中下游地區(qū),多為局部微創(chuàng)傷后接觸孢子絲菌污染物致病,通常散發(fā),偶因爆發(fā)洪水或飼養(yǎng)寵物而引起小范圍爆發(fā)流行[1-3]。近年孢子絲菌病發(fā)病率較前攀升,隨著抗真菌藥物的應(yīng)用,多藥耐藥菌株不斷出現(xiàn),威脅人類(lèi)健康[4]。因此,研究人體天然免疫反應(yīng)在抗申克孢子絲菌感染過(guò)程中的作用極為重要。單核巨噬細(xì)胞作為宿主天然免疫中重要的反應(yīng)細(xì)胞,能夠識(shí)別并吞噬、殺傷、清除入侵的申克孢子絲菌病原體[5]。本研究旨在探討申克孢子絲菌酵母相能否激活人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)的核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)信號(hào)通路并誘導(dǎo)分泌TNF-α。

        1 材料和方法

        1.1 材料細(xì)胞、菌株、主要試劑:申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)D1a,由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心提供。人THP-1細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection,ATCC)。兔抗人IκBα、磷酸化IκBα抗體和β肌動(dòng)蛋白抗體為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒為欣博盛公司產(chǎn)品。PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。iTaq Universal SYBR Green Supermix為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。佛波酯(PMA)、Curdlan為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,地塞米松為美國(guó)Invivogen公司產(chǎn)品。

        1.2 方法(1)申克孢子絲菌酵母相誘導(dǎo):將申克孢子絲菌接種至沙堡弱固體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d,活化3次后轉(zhuǎn)種于含2%葡萄糖的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基,37℃5%CO2下培養(yǎng),每14天傳代,觀察菌落及革蘭染色后顯微鏡下形態(tài)是否完全轉(zhuǎn)化為酵母相。培養(yǎng)14~28天制備酵母相菌液,生理鹽水沖洗2遍,計(jì)數(shù)后配制成109CFU/mL濃度菌懸液待用。(2)細(xì)胞培養(yǎng):人THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細(xì)胞制備成2×105/mL細(xì)胞懸液,接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔1 mL)及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔2 mL),加入100 ng/mL PMA刺激48 h后誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),分別加入終濃度為2×106CFU/mL的申克孢子絲菌酵母相及100μg/mL的Curdlan共培養(yǎng)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR:申克孢子絲菌與THP-1細(xì)胞共孵育,并設(shè)陽(yáng)性刺激物Curdlan組、空白對(duì)照組、地塞米松抑制組(100 nM NF-κB抑制劑地塞米松預(yù)先30 min與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng))。預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾設(shè)置多個(gè)申克孢子絲菌與THP-1細(xì)胞共孵育時(shí)間點(diǎn),刺激后隨時(shí)間延長(zhǎng),TNF-α mRNA表達(dá)水平漸升高,6 h后達(dá)最高峰,繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間則開(kāi)始降低。本實(shí)驗(yàn)選擇3、6 h作為觀察時(shí)間,而地塞米松抑制組選擇6 h。TRIzol法抽提總RNA,按PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI 7300 PCR儀,采用Syber green法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照,引物TNF-α及β-肌動(dòng)蛋白由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列TNF-α上游5'-CGAGTGACAAGCCTGTAGC-3',下游5'-GGTGTGGGTGAGGAGCACAT-3',β-肌動(dòng)蛋白上游5'-TCTGGCACCACACCTTCAT-3',下游5'-AGGCATACAGGGACAGCAC-3',反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃10 min,變性95℃15 s,退火60℃30 s,延伸72℃30 s,循環(huán)數(shù)40。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的變化水平,△Ct=目的基因-內(nèi)參照(β肌動(dòng)蛋白);某一樣品的△△Ct=某一樣品△Ct–對(duì)照組樣品的△Ct。2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。(4)ELISA法:刺激THP-1細(xì)胞后24 h,收集上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α含量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后,上清液TNF-α含量升高更明顯。設(shè)置不同的共孵育時(shí)間,發(fā)現(xiàn)刺激24 h后上清液TNF-α含量達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)選擇24 h作為觀察時(shí)間。(5)Western印跡分析:收集處理后的THP-1細(xì)胞,裂解細(xì)胞,提取總蛋白。應(yīng)用BCA定量法計(jì)算蛋白濃度,煮沸變性,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%血清白蛋白(BSA)封閉2 h,兔抗人單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST液(Tris-Buffered Saline Tween-20)洗膜3次后,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG第二抗體孵育2 h,Supersignal試劑顯色發(fā)光,檢測(cè)申克孢子絲菌酵母相與THP-1細(xì)胞共孵育30、60 min后IκBα和磷酸化IκBα水平變化。(7)免疫熒光法觀察NF-κB-p65核轉(zhuǎn)位:THP-1細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi),細(xì)胞培養(yǎng)同上。共孵育16 h后吸棄培養(yǎng)基,細(xì)胞待PBS清洗后用4%多聚甲醛室溫固定30 min,并用0.1% Triton X-100室溫通透15 min。3%BSA室溫封閉1 h后,細(xì)胞與NF-κB-p65抗體4℃孵育過(guò)夜,TBST洗后與Texas Red-羊抗兔IgG室溫避光孵育1 h,TBST漂洗干凈后用500 ng/mL DAPI染核,避光孵育10 min,熒光顯微鏡下觀察,NF-κB-p65呈紅色熒光,細(xì)胞核為藍(lán)色,核轉(zhuǎn)位時(shí)紅色熒光進(jìn)入細(xì)胞核。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)以珋x±s表示。不同時(shí)間不同組別間TNF-αmRNA比較采用多因素方差分析;不同組別間TNF-α蛋白含量的比較采用單因素方差分析,并采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP-1細(xì)胞TNF-α mRNA水平的影響申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后3、6 h,TNF-αmRNA水平逐漸增高,均顯著高于空白對(duì)照組,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 4503.89,P<0.001)。TNF-αmRNA水平的變化情況,見(jiàn)表1。

        2.2 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP-1細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響申克孢子絲菌酵母相與THP-1細(xì)胞共孵育24 h,申克孢子絲菌組、Curdlan組、空白對(duì)照組的上清液中TNF-α蛋白濃度分別為(4610.419± 121.501)pg/L、(4505.824±198.124)pg/L、(186.964± 98.073)pg/L,申克孢子絲菌組、Curdlan組與空白對(duì)照組比較TNF-α蛋白濃度均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1802.37,P<0.001)。

        表1 申克孢子絲菌酵母對(duì)TNF-αmRNA水平的影響

        表1 申克孢子絲菌酵母對(duì)TNF-αmRNA水平的影響

        注:a與空白對(duì)照組比較,P<0.01

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        2.3 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP-1細(xì)胞IκBα激活的影響刺激后30 min,與空白對(duì)照組比,申克孢子絲菌酵母相刺激后30 min磷酸化IκBα蛋白水平已升高,60 min時(shí)磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高;IκBα蛋白水平則相應(yīng)有所降低,如圖1示申克孢子絲菌酵母相能夠激活THP-1細(xì)胞信號(hào)分子IκBα,并呈時(shí)間依賴性。

        圖1 申克孢子絲菌酵母對(duì)THP-1細(xì)胞IκBα活化的影響

        2.4 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κB-p65核轉(zhuǎn)位的影響結(jié)果見(jiàn)圖2,空白對(duì)照組的NF-κB-p65主要位于細(xì)胞漿,細(xì)胞核內(nèi)僅少量分布;而申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB-p65熒光強(qiáng)度增強(qiáng),進(jìn)一步提示申克孢子絲菌酵母相能夠激活NF-κB通路。

        圖2 申克孢子絲菌酵母對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κB-p65核轉(zhuǎn)位的影響

        2.5 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母相上調(diào)THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA的影響100 nM地塞米松預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min后,分別與申克孢子絲菌酵母相、Curdlan共培養(yǎng)6 h,TNF-αmRNA水平見(jiàn)表2。用地塞米松阻斷后各組TNF-αmRNA水平較未用地塞米松組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=564.81,P<0.001),表明100 nM地塞米松抑制申克孢子絲菌酵母相誘導(dǎo)的TNF-αmRNA上調(diào)。

        表2 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母上調(diào)THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄的影響

        表2 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母上調(diào)THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄的影響

        注:a與空白對(duì)照組比較,P<0.001;b與未用地塞米松阻斷組比較,P<0.01

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        3 討論

        天然免疫在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用,單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等作為主要的天然免疫細(xì)胞,識(shí)別、吞噬入侵的真菌,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)特異性基因表達(dá),最終合成分泌多種細(xì)胞因子,構(gòu)成抵御病原微生物入侵的第一道防線[6,7]。THP-1細(xì)胞是一種人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞,經(jīng)PMA誘導(dǎo)可分化為成熟的巨噬細(xì)胞,常用于單核-巨噬細(xì)胞的功能研究[8]。申克孢子絲菌是一種雙相致病真菌,該菌宿主體內(nèi)和37℃培養(yǎng)為酵母相,室溫下為分生孢子或菌絲相,皮膚創(chuàng)傷感染菌絲相待其轉(zhuǎn)換為酵母相后致病,本病患者的組織病理和電鏡檢查證實(shí)申克孢子絲菌在宿主體內(nèi)僅為酵母相[9]。因此,本研究選用申克孢子絲菌酵母相為研究對(duì)象,探討THP-1細(xì)胞經(jīng)申克孢子絲菌酵母相刺激后能否激活NF-κB信號(hào)通路并誘導(dǎo)分泌TNF-α。TNF-α是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的前炎癥因子,主要由激活的單核巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分泌,能促進(jìn)IL-12、IFN-γ表達(dá),增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化及樹(shù)突狀細(xì)胞遷移,誘發(fā)炎癥反應(yīng)[10]。有研究指出,TNF-α在抗白念珠菌感染中發(fā)揮重要作用[11]。Carlos等[12]對(duì)申克孢子絲菌感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),TNF-α表達(dá)降低時(shí)小鼠感染的病情加重。我們研究中發(fā)現(xiàn),申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后,TNF-αmRNA表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng),刺激后3 h已經(jīng)出現(xiàn)升高,6 h時(shí)為3 h的4.63倍。Curdlan是一種β-1,3-D-葡聚糖,被單核巨噬細(xì)胞表面C-型凝集素受體-1(Dectin-1)識(shí)別后,能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,合成分泌多種細(xì)胞因子[13]。我們選用Curdlan做為激活THP-1細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照物,本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出與申克孢子絲菌酵母相相似的效應(yīng),刺激后6 h TNF-α mRNA水平比3 h時(shí)升高3.95倍。申克孢子絲菌酵母相作用THP-1細(xì)胞后24 h,上清液TNF-α蛋白含量顯著高于空白對(duì)照組。此研究表明申克孢子絲菌酵母相在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TNF-α表達(dá)上調(diào)。Negrini等[14]和Sass 等[15]用申克孢子絲菌酵母相或脂類(lèi)抗原刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,能誘發(fā)炎癥反應(yīng)使TNF-α等表達(dá)增加。Romo-Lozano等[16]用申克孢子絲菌酵母相刺激肥大細(xì)胞,激活ERK信號(hào)通路,誘導(dǎo)分泌IL-6、TNF-α,引發(fā)固有免疫反應(yīng)。Verdan等[17]用申克孢子絲菌酵母相刺激樹(shù)突狀細(xì)胞也能誘導(dǎo)TNF-α分泌增強(qiáng)。以上研究與本研究結(jié)果一致,可見(jiàn)TNF-α在抗申克孢子絲菌感染中發(fā)揮重要作用。

        細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子NF-κB在調(diào)控前炎癥因子轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起重要作用,在無(wú)外界刺激因素時(shí),p50和p65組成的亞單位與IκBα結(jié)合成復(fù)合體,在細(xì)胞漿中處于失活狀態(tài);適宜刺激后,IκB激酶復(fù)合體的激活可使IκBαN端保守的絲氨酸殘基磷酸化、降解,導(dǎo)致NF-κB p50、p65二聚體與IκBα解離,隨后移位入核,結(jié)合到NF-κB特異性結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[18]。申克孢子絲菌酵母相刺激THP-1細(xì)胞后能使磷酸化IκBα水平升高,促進(jìn)NF-κB-p65移位入核,最終激活NF-κB信號(hào)通路。

        有研究證實(shí),100 nM地塞米松能夠阻斷NF-κB信號(hào)通路并抑制多種細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。100 nM地塞米松預(yù)處理THP-1細(xì)胞抑制了申克孢子絲菌酵母誘導(dǎo)的TNF-αmRNA上調(diào),以上研究提示申克孢子絲菌酵母相可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路調(diào)控TNF-α的合成。但選用地塞米松作為NF-κB信號(hào)通路阻斷劑,不能排除對(duì)實(shí)驗(yàn)的其他影響,為本研究的不足之處。

        本研究發(fā)現(xiàn),人THP-1細(xì)胞經(jīng)申克孢子絲菌酵母相刺激后激活NF-κB信號(hào)通路并誘導(dǎo)分泌TNF-α,參與機(jī)體抗申克孢子絲菌天然免疫反應(yīng)。Toll樣受體2(TLR2)、TLR 4和Dectin-1是識(shí)別真菌的主要模式識(shí)別受體,已有研究表明TLR2和TLR4在抗申克孢子絲菌感染的天然免疫中發(fā)揮重要作用[7,14,15,20-22],我們將進(jìn)一步研究Dectin-1及其下游信號(hào)通路在抗申克孢子絲菌感染免疫中的作用。

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        (收稿:2016-09-13修回:2016-11-17)

        Effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF-κB signal pathway and secretion of TNF-αin human acute monocytic leukemia cells

        LIUCaixia1,DUANZhimin1,DULeilei1,ZENGRong1,SHENYongnian1,HUSuquan1,LIUWeida1,CHENQing2,LIMin1.
        1.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSicencesandPekingUnionMedicalCollege,Jiangsu KeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases,Nanjing210042,China;2.JiangsuProvinceBlood Center,Nanjing210042,China
        Correspondingauthors:LIMin,E-mail:drlimin@sina.cn
        CHENQing,E-mail:qngchen@hotmail.com

        Objective:To determine the effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF-κB signal pathway and secretion of TNF-αin human acute monocytic leukemia cells(THP-1).Methods:The expression of TNF-αmRNA was detected by Real-time fluorescence quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay respectively.The level of phosphorylated IκBαwas detected by Western blot.NF-κB-p65 nuclear translocation was measured by immunofluorescence.The level of TNF-αmRNA in THP-1 pretreated with 100 nM Dexamethasone(a NF-κB inhibitor)for 30 minutes was detected by Real-time fluorescence quantitative PCR.Results:The levels of TNF-αmRNA in THP-1 cells treated with Sporothrix schenckii yeasts for 6 hours were increased compared with the blank control group(P<0.001).The secretion level of TNF-αin the Sporothrix schenckii yeasts group was 4610.419±121.501 pg/mL,which was higher than that inthe blank group(186.964±98.073 pg/mL),with a significant difference(P<0.001).Phosphorylation IκBα protein increased obviously and in a time-dependent manner after treated with Sporothrix schenckii yeasts from 30 minutes to 60 minutes.The fluorescent intensity of NF-κB-p65 in the Sporothrix schenckii yeasts group was stronger than that in the blank group.The level of TNF-αmRNA was decreased in the THP-1 macrophages treated with 100 nM dexamethasone in the three groups.Conclusion:Sporothrix schenckii yeasts can increase the expression of TNF-αthrough enhancing the activation of NF-κB pathway.

        sporothrix schenckii;monocytic leukemia;TNF-α;NF-κB

        國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81502739)江蘇省自然科學(xué)基金(編號(hào):BK20150068)

        1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所,江蘇省皮膚性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京,210042 2江蘇省血液中心,南京,210042

        李岷,E-mail:drlimin@sina.cn陳青,E-mail:qngchen@hotmail.com

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