劉大凱 王罡 趙鋼 遲曉飛

脊髓損傷是周圍神經(jīng)損傷, 是臨床常見(jiàn)病之一, 嚴(yán)重影響了人類健康及生活質(zhì)量, 不同程度的的損傷主要由于外傷所致［1］, 目前臨床治療缺乏特效藥物, 加快周圍神經(jīng)再生的速度一直是基礎(chǔ)和神經(jīng)研究工作者的研究目標(biāo)［2］。血府逐瘀, 湯為活血化瘀中藥, 由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、生地、白芍、丹參、牛膝等構(gòu)成, 宜疏通督脈, 活血化瘀。有研究顯示, 血府逐瘀湯能夠使兔實(shí)驗(yàn)性頸髓急性損傷神經(jīng)元周圍水腫減輕, 白質(zhì)腫脹減輕, 有明顯微血管再通, 細(xì)胞凋亡減少作用［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究血府逐瘀湯含藥血清對(duì)背根神經(jīng)元的保護(hù)作用來(lái)探討血府逐瘀湯的作用機(jī)理, 為中醫(yī)藥治療脊髓損傷提供可靠地理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h的SD大鼠(由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)10只, 雌雄不限, 體質(zhì)量為5～8 g。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 血府逐瘀血清(醫(yī)院自行配置)、蛋白酶(GIBCO公司)、高糖型DMEM/F12培養(yǎng)基、NGF(Invitrogen公司)、鼠尾膠(杭州生友生物技術(shù)有限公司)、胎牛血清(PAA公司)、逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 背根神經(jīng)元分離及培養(yǎng) 在無(wú)菌的狀態(tài)下, 用乙醚將10只大鼠麻醉后, 切開(kāi)背部皮膚, 打開(kāi)錐板, 解剖顯微鏡下取出背根神經(jīng), 放于4℃清洗液后, 剪成1 mm3的碎塊, 移入0.25%的胰蛋白酶的離心管中, 37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化,消化15 min后向試管中加入FBS終止消化并吹打成細(xì)胞懸液, 離心10 min, 離心速度為1000 r/min后棄上清, 加入培養(yǎng)基, 將細(xì)胞懸液移入未包被的25 cm2的培養(yǎng)瓶中, 37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h。取未貼壁細(xì)胞懸液于另一離心試管中,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/ml, 分別在包被好鼠尾膠原的96孔的細(xì)胞板中。24 h后全量換液, 48 h后加入阿糖胞苷,終濃度為2.5 μg/ml, 繼續(xù)培養(yǎng)背根神經(jīng)元。

1.3.2 建立細(xì)胞損傷模型 將培養(yǎng)5 d的神經(jīng)元取出, 吸去培養(yǎng)液, 換上亞硫酸鈉(濃度為0.3 mol/L)的培養(yǎng)基, 放置在37℃, 5%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 復(fù)氧2 h后開(kāi)始按2、6、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) ①空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)7 d不進(jìn)行缺氧損傷；②損傷對(duì)照組：建立細(xì)胞缺氧損傷模型,在缺氧損傷前24 h給予磷酸緩沖試劑(0.01 mol/L)約10 μl；③空白血清組：建立細(xì)胞缺氧損傷模型, 細(xì)胞種植3 d后入空血清約10 μl, 1%為最終的濃度；④含藥血清組：建立細(xì)胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入含藥血清(最佳濃度為1.0×10-10mol/L)約10 μl ；⑤神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組：建立細(xì)胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入NGF (濃度為 1%)約 10 μl。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) ①M(fèi)DA的測(cè)定：MDA含量=(測(cè)定管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度) ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度), MDA可以反映脂質(zhì)的過(guò)氧化程度, 間接反映細(xì)胞損傷程度。②SOD的測(cè)定：SOD 活力=(對(duì)照吸光度值-測(cè)定吸光度值)×2×反應(yīng)體系倍數(shù)/對(duì)照吸光度值；SOD可以清除超氧陰離子自由基, 保護(hù)細(xì)胞受損。③LDH的測(cè)定：LDH活力=(測(cè)定管OD值-測(cè)定空管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度×2 μmol/ml×1000 ml/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)。LDH生高代表有大量細(xì)胞死亡。④MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率, 存活率=(每組試驗(yàn)組光密度值-空白對(duì)照組光密度值)/(陰性對(duì)照組光密度值-空白對(duì)照組光密度值)×100%；MTT法檢測(cè)最終產(chǎn)物越少表明細(xì)胞死亡或不活躍, 相反說(shuō)明細(xì)胞越活躍。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA含量比較 空白對(duì)照組MDA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化不大, 損傷對(duì)照組是各組中同時(shí)間點(diǎn)MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對(duì)照組, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組SOD活力比較 空白對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD含量變化不大。同時(shí)間點(diǎn)含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對(duì)照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；同時(shí)間點(diǎn)含藥血清組與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組SOD含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組LDH活力比較 損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對(duì)照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 但與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表 3。

表1 各組MDA的含量測(cè)定比較(±s, nmol/ml)

表1 各組MDA的含量測(cè)定比較(±s, nmol/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對(duì)照組 1.268±0.028 1.284±0.076 1.559±0.009 2.003±0.019含藥血清組 1.249±0.086 1.279±0.102 1.785±0.043 2.865±0.006空白血清組 1.268±0.072 1.320±0.056 2.236±0.072a 3.698±0.048a損傷對(duì)照組 1.456±0.069 1.782±0.089 2.863±0.059a 3.765±0.037a神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組 1.272±0.043 1.283±0.027 1.630±0.038 2.378±0.081

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對(duì)照組 75.30±3.28 70.24±2.08 68.68±3.37 65.45±3.05含藥血清組 60.94±3.08 52.24±3.10 38.89±3.39 31.69±3.49空白血清組 41.20±2.32a 26.01±3.25a 20.19±2.01a 18.76±3.95a損傷對(duì)照組 35.92±3.69a 22.63±3.01a 18.56±2.89a 16.97±3.23a神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組 62.75±4.82 53.35±3.61 39.60±3.00 32.56±3.42

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 24 h 48 h空白對(duì)照組 375.30±17.68 487.74±17.08含藥血清組 545.34±20.08 892.24±17.90空白血清組 660.20±21.32a 1167.61±23.25a損傷對(duì)照組 782.22±20.09a 1152.63±20.01a神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組 489.75±18.84 675.35±20.34

2.4 各組 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細(xì)胞存活率為(0.529±0.010),空白血清組細(xì)胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對(duì)照組細(xì)胞存活率為(0.221±0.034)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組細(xì)胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細(xì)胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對(duì)照組, 與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組及空白對(duì)照組較為接近。

3 討論

脊髓損傷后軸突的再生和修復(fù)是醫(yī)學(xué)界的一大難題。近10年間, 一系列作用于不同發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物已經(jīng)相繼用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床, 其中部分已被證明有減輕或阻止繼發(fā)損傷、保留和促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的作用［4］。

中藥治療繼發(fā)脊髓損傷主要以舒筋活血, 扶正固本為主,大致可分為中藥復(fù)方及中藥提取物兩大類。在脊髓損傷早期治宜疏通督脈, 活血化瘀。大量研究表明中藥三七、丹參、人參、黃芪等有助于改善微循環(huán)、抗氧自由基, 減輕脊髓繼發(fā)性損傷, 抑制成纖維細(xì)胞增生, 還可興奮脊髓, 促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維的再生［5-10］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)量比較各組MDA含量及SOD、LDH活力, 并采用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率, 觀察血府逐瘀血清對(duì)大鼠背根神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用, 結(jié)果顯示, 空白對(duì)照組MDA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化不大, 損傷對(duì)照組是各組中同時(shí)間點(diǎn)MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對(duì)照組, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？瞻讓?duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD含量變化不大。同時(shí)間點(diǎn)含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對(duì)照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；同時(shí)間點(diǎn)含藥血清組與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組SOD含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對(duì)照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 但與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細(xì)胞存活率為(0.529±0.010), 空白血清組細(xì)胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對(duì)照組細(xì)胞存活率為(0.221±0.034)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組細(xì)胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細(xì)胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對(duì)照組, 與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)組及空白對(duì)照組較為接近。說(shuō)明血府逐瘀血清對(duì)大鼠背根神經(jīng)元缺氧損傷具有保護(hù)作用, 可以促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)。

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