朱振華，袁偉杰，黃昌浩，陳子華

（1. 湖南省長沙市中心醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410004；2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410008）

胃癌是亞洲最常見的消化道惡性腫瘤，約占全球范圍癌癥死亡的10%以上，僅次于肺癌[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素[2]，但是促進胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移的淋巴管生成機制還不明了。EphA2已被證實在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中明顯過表達，并且與腫瘤微血管密度及患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。VEGF-C是近年來發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮生長因子，其與受體VEGFR-3結(jié)合后可發(fā)生淋巴管內(nèi)皮擴張，促使淋巴管形成[4]。為探究EphA2和VEGF-C兩種蛋白在胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移中關(guān)系，本實驗利用免疫組化SP法和real-time PCR方法分別檢測EphA2與VEGF-C蛋白和mRNA在胃癌組織中的表達及兩者相關(guān)性，同時用特異性淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40對淋巴管進行染色后分析EphA2和VEGF-C的表達對淋巴管生成的影響，為進一步抗腫瘤淋巴管生成的分子靶向治療提供臨床研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集82例中南大學(xué)湘雅醫(yī)院自2012年12月—2013年6月收治的胃癌患者的癌組織及其距腫瘤邊緣約2 cm的癌旁正常組織。所有患者術(shù)前均未行任何治療，其中女36例，男46例；年齡分布31～81歲，中位年齡5.5歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；按照國際抗癌聯(lián)盟UICC 1997年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期：I～II期40例，III期42例。

1.2 試劑

兔抗人EphA2多克隆抗體購自美國Millipore公司；兔抗人VEGF-C多克隆抗體和小鼠抗人D2-40單克隆抗體英國Abcam公司；即用型SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoScript TM Reverse Transcription System）購自美國Promega公司；SYBR Green購自瑞士Roche公司；引物由由上海生物生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 82例標(biāo)本均由10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。蠟塊切片，做免疫組織化學(xué)染色。所有石蠟標(biāo)本（包括NK、RCCC）均連續(xù)切片，片厚約4 μm，共5張。其中1張作常規(guī)HE染色，3張作EphA2、VEGF-C、D2-40免疫組化染色，1張以PBS液代替一抗體作為陰性對照。隨機抽取20例胃癌患者術(shù)后留取的新鮮標(biāo)本進行real-time PCR。每例患者手術(shù)后30 min內(nèi)取胃癌組織以及癌旁2 cm新鮮組織標(biāo)本，同時隨機選取2例患者遠離腫瘤組織（＞10 cm）的新鮮標(biāo)本作為PCR陰性對照。所有標(biāo)本放入已消毒的經(jīng)1%DEPC水溶液處理過的EP管中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱中，供后續(xù)試驗用。

1.3.2 免疫組化染色（SP二步法） 4 μm厚石蠟切片在65 ℃恒溫箱中烘烤90 min后常規(guī)脫蠟以及水化，用3%H2O2室溫下15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗 3次，每次 5 min；于 0.01 mol/L pH6.0 檸檬酸鈉緩沖液中，用微波法進行抗原修復(fù)；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μL 3%BSA，37 ℃水浴箱孵育30 min；棄去封閉液，分別滴加1:100稀釋的兔抗人EphA2多克隆抗體和兔抗人VEGF-C多克隆抗體以及1:150稀釋的小鼠抗人D2-40單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，用PBS代替一抗作陰性對照；PBS漂洗3次，每次5 min；分別滴加抗兔和抗鼠二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗 3 次，每次 5 min。DAB 顯色 1～5 min，顯微鏡下觀察染色情況，自來水沖洗2 min終止染色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核20 s，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

1.3.3 RNA提取和cDNA分析 TRIzol法提取總RNA。取100 mg組織置于盛有液氮的研缽中碾碎后加入1 mL TRIzol于繼續(xù)碾磨成粉狀，室溫冷卻后轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管；1 1000r/min 4 ℃離心10 min后取上清至新的1.5 mL EP管。每管加入0.2 mL 氯仿，震蕩 15 s混勻后室溫放置 5 min，11 000r/min 4 ℃離心 15 min。吸取含總 RNA 的上層無色水相至一新的離心管中，每管加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，冰上靜置 10 min 后 11 000r/min 4 ℃離心 10 min，棄上清。加入 1 mL 75% 乙醇（DEPC 水配制），顛倒混勻后 6 000r/min 4℃離心5 min。棄盡上清。待乙醇揮發(fā)干凈后，加入適量DEPC水溶解，10 μL分裝后，-70℃凍存。取OD260/OD280比值范圍在1.8～2.0之間的RNA進行下一步實驗。逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA：1 μL Oligo dT和1 μL總RNA加入到PCR小管中，補充DEPC水至 10 μL，混勻后，70 ℃ 5 min。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置10 μL反應(yīng)體系，混勻離心后42 ℃反應(yīng) 1 h，然后 70 ℃ 10 min，將所得的 cDNA 置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 real-time PCR 采用SYBR Green法進行real-time PCR。采用 primer 5.0 軟件設(shè)計引物，VEGF-C 正 向：AAG GAG GCT GGC AAC ATA AC；VEGF-C 反 向：CCA CAT CTG TAG ACG GAC AC；EphA2 正向：GTG TAC AAG GGC ATG CTG AA；EphA2 反向：AAC TTG TCC AGG GCC CCA TT；β-actin 正 向：ACA GAG CCT CGC CTT TGC；β-actin 反向：ATC CTT CTG ACC CAT GCC CAC。按 照 10 μL SYBR Green、5 μL 稀 釋 5倍的 cDNA、0.4 μL 正反向引物混合液和 4.6 μL DEPC水配置反應(yīng)體系。按照95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s；60 ℃ 1 min 進 行 40個循環(huán)；95 ℃5 s后，60 ℃ 1 min 的程序在 ABI7500 熒光定量PCR儀進行PCR擴增。

1.3.5 結(jié)果判斷 ⑴ 免疫組化染色結(jié)果判定：EphA2與VEGF-C均為細(xì)胞漿表達的蛋白，因此陽性染色為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色，低倍鏡下觀察整個切片，分散選取5個不同的視野，高倍鏡下觀察細(xì)胞染色情況；綜合陽性細(xì)胞百分率和染色強度進行結(jié)果判定。結(jié)果判定參照文獻[5]報道，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為0分；6%～25%為1分，26～50%為2分；＞50%為3分。染色強弱計分，陰性為0分；淡黃色染色為1分；中度黃色染色為2分；棕黃色染色為3分。按“陽性細(xì)胞+染色強弱”計總分，0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中度陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。陰性和弱陽性為低表達組，中度陽性和強陽性為高表達組。所有染色結(jié)果的判定均采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)和雙盲法，在完全不知樣本臨床資料的情況下，由兩名研究者分別對實驗結(jié)果進行評判、打分，所有評分過程均重復(fù)3次以上。⑵ 淋巴管密度（LVD）計數(shù)：對D2-40染色陽性淋巴管進行LVD計數(shù)。參照MEIDNER計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，每個標(biāo)本先在光鏡低倍視野下（10×4）確定組織中淋巴管最密集區(qū)及熱點，再在高倍鏡下（10×20）下觀察著色腔，以此作為一個淋巴管，計數(shù)5個視野淋巴管數(shù)目并取其均數(shù)為腫瘤LVD的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0版統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。比較EphA2蛋白和VEGF-C蛋白在胃癌、癌旁組織組間差異的顯著性采用χ2檢驗，EphA2蛋白和VEGF-C蛋白在胃癌中表達的免疫組化結(jié)果與臨床病理特征比較采用χ2檢驗，LVD在胃癌、癌旁組織組間以及在EphA2蛋白、VEGF-C蛋白高低表達組之間的差異性采用秩和檢驗，EphA2與VEGF-C蛋白的相關(guān)性檢驗采用Spearman等級相關(guān)分析，VEGF-C mRNA、EphA2 mRNA在癌、癌旁的比較采用秩和檢驗（經(jīng)正態(tài)性檢驗，P＜0.05，不符合正態(tài)分布），相關(guān)性檢驗采用pearson相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EphA2與VEGF-C蛋白在胃癌組織中的表達

EphA2和VEGF-C蛋白在胃癌組織中的陽性表達率分別為65.8%（54/82）和71.9%（59/82）（圖1），而兩者在癌旁組織中陽性表達率分別為42.6%、39%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 EphA2和VEGF-C蛋白高表達與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，EphA2與VEGF-C蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤的大小以及腫瘤分化程度無明顯關(guān)系（均P＞0.05），但兩種蛋白的表達與腫瘤浸潤深度，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期相關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

圖1 胃癌組織EphA2與VEGF-C免疫組化檢測（×400） A：EphA2陽性表達；B：VEGF-C陽性表達；C：EphA2陰性表達；D：VEGF-C陰性表達Figure 1 Immunohistochemical staining for EphA2 and VEGF-C in gastric cancer tissues (×400) A: Positive EphA2 expression;B: Positive VEGF-C expression; C: Negative EphA2 expression; D: Negative VEGF-C expression

表1 EphA2與VEGF-C表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of EphA2 and VEGF-C expression with clinical factors of gastric cancer [n (%)]

2.3 EphA2和VEGF-C蛋白表達與LVD關(guān)系的分析

D2-40標(biāo)記的淋巴管呈褐色染色（圖2），EphA2和VEGF-C蛋白高表達組LVD計數(shù)分別為15.25±5.41、14.87±5.71，分別高于EphA2和V E G F-C蛋白低表達組（1 0.9 5±5.4 1、11.00±5.01）。秩和檢驗顯示兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001、P=0.006）。

圖2 D2-40免疫組化染色（×200） A：癌組織中（LVD計數(shù)14）；B：癌旁組織（LVD計數(shù)4）Figure 2 Immunohistochemical staining for D2-40 (×200) A: Gastric cancer tissue (LVD count of 14); B: Adjacent gastric tissue (LVD count of 4)

2.4 EphA2與VEGF-C蛋白表達的相關(guān)性

EphA2蛋白與VEGF-C蛋白同為高表達者47例，同為低表達者16例，EphA2蛋白低表達而VEGF-C蛋白高表達者12例，EphA2蛋白高表達而VEGF-C蛋白低表達者7例，經(jīng)Sperman等級相關(guān)分析顯示EphA2和VEGF-C蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.375，P=0.001），（表2）。

表2 EphA2與VEGF-C蛋白表達的相關(guān)性Table 2 Correlation between EphA2 and VEGF-C protein expressions

2.5 20例胃癌患者中VEGF-C、EphA2 mRNA表達情況及其兩者的相關(guān)性分析

20例胃癌癌組織EphA2 mRNA相對表達量為3.00±1.48，而癌旁組織為1.57±0.70，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）；與EphA2 mRNA表達類似，20例胃癌患者癌組織VEGF-C mRNA相對表達量也明顯高于癌旁組織[（3.33±1.76）vs.(1.86±0.94)，P=0.009]（表3）。采用Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示EphA2 mRNA和VEGF-C mRNA表達量呈正相關(guān)（r=0.559，P=0.01） （圖3）。

表3 EphA2、VEGF-C mRNA癌組織與癌旁組織中的相對表達量（±s，n=20）Table 3 Relative mRNA expression levels of EphA2 and VEGF-C in gastric cancer and adjacent tissues (±s,n=20)

表3 EphA2、VEGF-C mRNA癌組織與癌旁組織中的相對表達量（±s，n=20）Table 3 Relative mRNA expression levels of EphA2 and VEGF-C in gastric cancer and adjacent tissues (±s,n=20)

組織 EphA2 VEGF-C胃癌組織 3.00±1.48 3.33±1.76癌旁組織 1.57±0.70 1.86±0.94 P 0.002 0.008

圖3 20例胃癌組織中EphA2與VEGF-C mRNA相關(guān)性散點圖Figure 3 Scatter plot for correlation between EphA2 and VEGF-C mRNA expressions in 20 specimens of gastric cancer tissue

3 討 論

胃癌是中國發(fā)病率和病死率都位居前三的腫瘤[6]。雖然近年來隨著D2為主的規(guī)范手術(shù)的推廣以及術(shù)后合理的化療，胃癌患者的生存率有所提高，但相較于結(jié)直腸癌這類術(shù)后生存率較高的惡性腫瘤，其治療效果仍不滿意[7]。癌細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因，且大多經(jīng)血道和淋巴道轉(zhuǎn)移，其中胃癌以淋巴道轉(zhuǎn)移為主[8]。新生淋巴管的生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的必然條件，EphA2和VEGF-C是近年來惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的熱點研究分子。

E p h受體酪氨酸激酶通過與糖基磷脂酰肌醇（GPI）樣或跨膜的ephrin配體結(jié)合調(diào)解細(xì)胞的黏附、遷移和血管生成[9]。作為Eph家族的重要成員，ephrin-A1/EphA2已被證實在胃癌、乳腺癌、Kaposi肉瘤、舌癌等多種腫瘤組織中明顯過表達，并且EphA2高表達與胃癌患者腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)，與本文結(jié)果一致[3]。而D2-40作為惡性腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移的重要參考指標(biāo)，本研究中由D2-40所得的LVD計數(shù)與EphA2的高表達存在相關(guān)性，更加進一步提示EphA2的表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)，故考慮EphA2可能通過某個途徑促進胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

目前研究[10-11]表明ephrin-A1/EphA2復(fù)合體可通過參與E-cadherin、β-catenin、VEGF[12]、Ras和MAPK信號通路[13]、RAF/MEK/ERK[14]等信號通道調(diào)控腫瘤細(xì)胞之間黏附性，破壞細(xì)胞間連接以及誘導(dǎo)EMT（上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）發(fā)生，進而導(dǎo)致腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移。本研究中real time-PCR結(jié)果顯示癌組織中EphA2 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，表明EphA2蛋白的高表達是受到轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。目前研究表明EphA2表達與乳腺癌[15]、非小細(xì)胞肺癌[16]、腦膠質(zhì)瘤[4]等患者的預(yù)后相關(guān)。Yuan等[17]有研究提示高表達EphA2蛋白的胃癌患者預(yù)后較低表達者差，故可推測EphA2或可成為與預(yù)后有價值的判斷指標(biāo)。但是僅有EphA2單個指標(biāo)，缺乏足夠的特異性和敏感性，不足以評估胃癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險。有必要進一步尋找特異性的促淋巴管生成因子及與EphA2的關(guān)系，為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供特異性的檢測指標(biāo)。

VEGF-C是淋巴管生成特異性因子，能與位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體VEGFR-3結(jié)合，通過激活一系列反應(yīng)，促進淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并抑制其凋亡，誘導(dǎo)毛細(xì)淋巴管的生成及發(fā)展，進而促進腫瘤內(nèi)及腫瘤周圍淋巴管生成，從而促使惡性腫瘤細(xì)胞進入淋巴系統(tǒng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響癌癥患者的預(yù)后[18]。此外，實驗中所見高表達VEGF-C蛋白的胃癌腫瘤組織中心區(qū)域較少看到開放性的淋巴管，但腫瘤邊緣的組織中存在增生、擴張的淋巴管，與先前Saharinen等[19]研究結(jié)果基本一致，表明癌組織邊緣新的淋巴管和毛細(xì)淋巴管形成對于惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移具有更加重要的意義和作用。RT-PCR結(jié)果表明胃癌組織VEGF-C的mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，進一步提示了胃癌與VEGF-C的mRNA表達相關(guān)。目前對VEGF-C參與腫瘤淋巴管生成機制的研究表明除腫瘤細(xì)胞本身能夠分泌VEGF-C使癌組織中的VEGF-C水平升高外[20]，VEGF-C還可通過胰島素樣生長因子受體（IGFIR）[21]、纖連蛋白1（FN1）[22]等多種途徑上調(diào)其表達。當(dāng)VEGF-C結(jié)合并激活其受體VEGFR-3，隨后VEGFR-3胞內(nèi)區(qū)與磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）形成復(fù)合物并活化PI3K和Akt，引起下游分子Erk1/2磷酸化，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)淋巴管生成的作用[18]。有研究[23]提示高水平的VEGF-C不僅可以增加了腫瘤附近淋巴管的生成，也增強腫瘤細(xì)胞的遷徙運動功能。VEGF-C通過多種途徑來促進腫瘤的侵潤及轉(zhuǎn)移，從而促進腫瘤進展，縮短患者的生存時間。但VEGF-C目前還有許多調(diào)節(jié)機制不清，需要進一步研究。

本研究中EphA2與VEGF-C兩種蛋白的相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者無論在蛋白水平還是mRNA表達水平都存在正相關(guān)趨勢，提示在胃癌細(xì)胞中EphA2與VEGF-C在蛋白和mRNA水平上可能共同協(xié)調(diào)新生淋巴管生成，從而導(dǎo)致腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移。有研究[24]表明，EphA2可能通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)VEGF-C表達。EphA2缺陷的小鼠中重新表達EphA2后，后者可通過激活下游信號分子PI3K恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞重塑脈管的能力。而腫瘤細(xì)胞中的EphA2可引起下游PI3K磷酸化和Akt的473位絲氨酸磷酸化，通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡來促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[25]，提示Akt是EphA2下游的重要分子。與此同時，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Fibronectin的裂解體EDA可PI3K/Akt信號通路促進VEGF-C表達，而抑制PI3K/Akt信號通路后VEGF-C表達明顯降低[5]，說明VEGF-C也是PI3K/Akt信號通路的靶分子之一。

值得肯定的是，在胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移中，EphA2與VEGF-C相互介導(dǎo)，促進胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。但是具體的介導(dǎo)通路機制，待進一步研究證實。

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