鄭宇，張德進(jìn)，劉俊，殷杰

（江蘇省海安縣人民醫(yī)院 普通外科，江蘇 海安 226600）

血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞是導(dǎo)致結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要原因之一[1-2]。RT-PCR的應(yīng)用為外周血中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)提供了一種具有高度敏感性和特異性的分子生物學(xué)方法[3]。相關(guān)研究[4-7]表明基質(zhì)金屬蛋白酶11（MMP-11）、癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白20（CK-20）、CD44與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)腸癌患者外周血中游離腫瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達(dá)情況，研究其與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為結(jié)腸癌的早期篩查及臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集江蘇省海安縣人民醫(yī)院結(jié)腸癌患者臨床資料（初診結(jié)腸癌患者、晚期結(jié)腸癌患者各20例）及健康體檢者20例血液標(biāo)本。初診結(jié)腸癌患者20例，男13例，女7例；平均年齡（70.8±4.2）歲。晚期結(jié)腸癌患者20例，男14例，女6例；平均年齡（68.3±5.6）歲。初診結(jié)腸癌患者高、中分化癌17例，低分化癌3例。晚期結(jié)腸癌患者高、中分化癌14例，低分化癌6例。初診結(jié)腸癌患者Dukes分期：A期4例，B期15例，C期1例，均行根治性切除。晚期結(jié)腸癌患者根治性切除8例，姑息性切除者12例。同期健康體檢者20例，其中男13例，女7例，平均年齡（67.5±6.2）歲。

1.2 分組

⑴ 試驗(yàn)組（40例）：初診結(jié)腸癌患者（未經(jīng)放化療、未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移）和晚期結(jié)腸癌患者（已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）各20例外周血樣本10 mL。⑵ 對(duì)照組（40例）：陽(yáng)性對(duì)照組為上述20例晚期結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的癌組織樣本；陰性對(duì)照組為健康體檢者20例外周血樣本10 mL，分別提取上述各組樣本的總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達(dá)情況。

1.3 方法

1.3.1 儀器與主要試劑 主要設(shè)備：COBE外周血細(xì)胞分離機(jī)、OLYMPUS倒置顯微鏡、Thermofisher PCR 儀、Thermofisher超低溫冰箱、Thermofisher液 氮儲(chǔ)存箱、Eppendorf臺(tái)式高速離心機(jī)、純水儀等設(shè)備。主要試劑：Power SYBR Green PCR Master Mix（2X）（Life technologies），RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit（Thermo scientific），Trizol Reagent（Life technologies），異丙醇（西隴化工股份有限公司），無(wú)水乙醇（無(wú)錫市晨陽(yáng)化工有限公司），三氯甲烷（宜興市第二化學(xué)試劑廠），碳酸氫鉀（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司），氯化銨（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司），乙二胺四乙酸二鈉（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司），MMP-11、CEA、CK-20、CD44試劑（羅氏公司）。

1.3.2 RT-PCR操作過(guò)程 ⑴ RNA的提?。焊鹘MEDTA 抗凝血 10 mL，Trizol法提取全血 RNA，凍存于-80℃?zhèn)溆?。癌組織塊500 mg，用液氮研磨至粉狀，用Trizol提取總RNA。⑵ 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（反應(yīng)體系：4μL 5× 逆轉(zhuǎn)錄 buffer，0.4 μL 下游引物（10 pmol/μL），0.5 μL dNTPs（10 mM），l μL MMLv（200 U/μL），10.1 μL DEPC 水，4μL RNA模板，總體積 20 μL，加 2 μL RNA 提取液，37℃水 浴 60 min，95 ℃ 3 min。⑶ RT-PCR：MMP-11 mRNA上、下游引物序列分別為5'-GAG AAG ACG GAC CTC ACC TAC A-3'、5'-CTC AGT AAA GGT GAG TGG CGT C-3'；CEA mRNA 上、 下游引物列 5'-TCT AAC CCA TCC CCG CAG TA-3'、5'-TTA TTG CGG CCA GTA GCC AA-3'；CK-20 mRNA 上、下游引物序列 5'-AAG AAC CTT CAA GAG GCC AA-3'、5'-CTA GAG TGT GCT CCA AAG ACT-3'；CD44 mRNA 上、下游引物 列 5'-CAG CAA CCC TAC TGA TGA TGA CG-3'、5'-GCC AAG AGG GAT GCC AAG ATG A-3'。β-actin 上、下游引物序列分別為 5'-AGA AAA TCT GGC ACC ACA CC-3'、5'-AGA GGC GTA CAG GGA TAG CA-3'。每個(gè)反應(yīng)均取PCR反應(yīng)液50 μL、Tag酶2 μL、RT 反應(yīng)產(chǎn)物 5 μL；MMP-11：反應(yīng)條件：94 ℃變性 45 s，60 ℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。CD44反應(yīng)條件：94 ℃變性40 s，60 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 60 s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)。CEA 反應(yīng)條件為：93 ℃變性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，共40循環(huán)；CK20反應(yīng)條件為：95 ℃變性 40 s，58 ℃退火 50 s，70 ℃延伸 40 s，共38循環(huán)。

1.4 RT-PCR定量檢測(cè)與相對(duì)定量

定量檢測(cè)MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達(dá)水平，通過(guò)MMP-11、CEA、CK-20、CD44的Ct值與β-actin的Ct值得到△Ct值。通過(guò)△Ct計(jì)算2-△△Ct比較各組MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達(dá)

結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平高于健康體檢者（P＜0.05）；晚期結(jié)腸癌患者癌組織中各腫瘤標(biāo)志物水平均高于其外周血中的腫瘤標(biāo)志物水平（均P＜0.05）；Dukes C-D期結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物含量均高于Dukes A-B期患者（均P＜0.05）；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物含量均高于高、中分化結(jié)腸癌患者（均P＜0.05）（表1）。

2.2 相對(duì)定量分析

通過(guò)△Ct計(jì)算2-△△Ct比較以上各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量顯示：結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物水平明顯高于健康體檢者；晚期結(jié)腸癌患者癌組織中各腫瘤標(biāo)志物水平明顯高于其外周血腫瘤標(biāo)志物水平；Dukes C-D期結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物水平明顯高于Dukes A-B期患者；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物明顯高于高、中分化結(jié)腸癌患者（表2）。

表1 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA比較（△Ct，±s）

表1 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA比較（△Ct，±s）

注：1）與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與晚期結(jié)腸癌癌組織比較，P＜0.05；3）與Dukes C-D期比較，P＜0.05；4）與低分化者比較，P＜0.05

標(biāo)本 MMP-11 CEA CK-20 CD44試驗(yàn)組外周血 12.79±0.791) 11.95±1.981) 14.99±1.671) 4.20±0.701)陰性對(duì)照組外周血 13.28±0.89 13.12±1.55 15.94±1.46 4.94±0.56晚期結(jié)腸癌外周血 12.50±0.672) 11.22±1.992) 14.37±1.802) 3.96±0.592)晚期結(jié)腸癌癌組織 4.82±2.06 2.42±2.75 3.31±3.14 2.15±0.90 Dukes A-B 外周血 13.08±0.833) 12.69±1.723) 15.60±1.293) 4.43±0.743)Dukes C-D 外周血 12.50±0.67 11.22±1.99 14.37±1.80 3.96±0.59高、中分化外周血 12.89±0.564) 12.30±1.774) 15.26±1.564) 4.32±0.664)低分化外周血 12.05±0.78 9.49±1.76 13.09±1.11 3.35±0.22

表2 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量關(guān)系（2-△△Ct）

3 討 論

腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞合成、釋放或者是宿主對(duì)癌類(lèi)反應(yīng)性的一類(lèi)物質(zhì)，它們的存在或在血液中水平的變化可以提示腫瘤的性質(zhì)，同時(shí)有助于了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化及細(xì)胞功能[8]。MMP-11是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的成員之一，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡的失調(diào)，從而引發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在人體不同實(shí)體瘤中MMP-11有不同程度的增高，與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[9-10]。CEA是一種糖蛋白抗原，是常見(jiàn)的大腸癌腫瘤標(biāo)志物，正常情況下CEA經(jīng)胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時(shí)CEA則進(jìn)入血和淋巴循環(huán)，引起血清CEA異常增高[11-13]。細(xì)胞角蛋白20（CK-20）具有嚴(yán)格的上皮組織特異性，它非常局限于胃腸上皮細(xì)胞，在腫瘤組織及其血液中表達(dá)升高[14-15]。CD44是一種分布廣泛的跨膜糖蛋白分子，具有激活淋巴細(xì)胞、參與信號(hào)傳遞、促進(jìn)細(xì)胞間黏附等多種生物學(xué)功能，許多類(lèi)型的惡性腫瘤存在不同程度CD44分子表達(dá)，高表達(dá)CD44分子的腫瘤細(xì)胞通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中透明質(zhì)酸、血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏著，賦予腫瘤細(xì)胞很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，與腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[16-17]。

本研究結(jié)果顯示：結(jié)腸癌患者外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 4種腫瘤標(biāo)志物水平明顯高于健康體檢者（P＜0.05）；結(jié)腸癌Dukes C-D期患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物含量明顯高于Dukes A-B期患者（P＜0.05）；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標(biāo)志物明顯高于高、中分化結(jié)腸癌患者（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MMP-11、CEA、CK-20、CD44可作為結(jié)腸癌診斷的腫瘤標(biāo)志物，且隨著結(jié)腸癌惡性程度的增高和Dukes分期的進(jìn)展，結(jié)腸癌患者外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達(dá)水平也增加，從而提示外周血中腫瘤標(biāo)志物水平也逐漸增高，可為結(jié)腸癌患者的早期診斷、惡性程度的判斷、及疾病分期提供有價(jià)值的信息。腫瘤標(biāo)志物均存在敏感性和特異性較低的局限性，特別是單一的標(biāo)志物對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷意義有限，而多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)有助于提高診斷的敏感性和準(zhǔn)確性，目前多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)已成為結(jié)腸癌早期診斷、手術(shù)方式選擇、判斷預(yù)后的一種重要手段[18]。聯(lián)合檢測(cè)上述四種腫瘤標(biāo)志物可提高結(jié)腸癌診斷的敏感性和準(zhǔn)確性，但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道聯(lián)合檢測(cè)外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達(dá)以早期篩查、診斷結(jié)腸癌。今后可進(jìn)一步行聯(lián)合檢測(cè)結(jié)腸癌患者外周血MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達(dá)及其相關(guān)性的研究。

總之，外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達(dá)水平的變化對(duì)于結(jié)腸癌的診斷及臨床分期很有價(jià)值，為結(jié)腸癌的早期篩查提供了較準(zhǔn)確的檢查方案。

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