張成娟，董鳳梅，徐本玲，袁 鵬

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴增表達與蒽環(huán)類藥物療效關系的研究

張成娟1，董鳳梅2，徐本玲1，袁 鵬1

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

目的 探討Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴增表達與蒽環(huán)類藥物療效的關系。方法 207例經病理證實的乳腺癌患者均接受FEC方案新輔助化療，并測定其Ki-67、Her-2及Top2A基因的表達。結果 207例乳腺癌患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)。Ki-67分級與Her-2基因、Top2A基因擴增無關 (P>0.05)。Her-2、Top2A的擴增與化療療效均呈正相關(r=0.59、0.58,P<0.05)。結論 Her-2、Top2A的表達對乳腺癌患者化療藥物的選擇及預后的判斷具有重要的指導價值。

Ki-67；Her-2；DNA拓撲異構酶Ⅱα；乳腺癌；蒽環(huán)類藥物

近年來，乳腺癌已成為全世界威脅女性健康的第一大惡性腫瘤，其發(fā)病率正以每年5%的速度呈增長狀態(tài)，且年輕、低齡化的趨勢越來越明顯[1-3]。在乳腺癌各種治療中，化療的地位較為重要，而腫瘤細胞存在的多藥耐藥現象是化療失敗的主要因素。蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌化療較為傳統(tǒng)的一類藥物，近年來關于其急性不良反應的報道較多，且有少數患者出現了復發(fā)，提示部分蒽環(huán)類藥物選擇性不高的現狀[4]。因此，尋找能夠準確預測蒽環(huán)類藥物敏感性的新的生物學標志物質，對臨床個體化治療手段的選擇尤為重要。目前人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)、DNA拓撲異構酶Ⅱα(DNA topoisomerase Ⅱα，Top2A)及Ki-67在乳腺癌中的擴增表達研究較少。因此本文通過對接受新輔助化療的乳腺癌患者中Ki-67、Her-2及Top2A的擴增表達及其與蒽環(huán)類藥物療效的關系進行研究，探討其能否成為預測蒽環(huán)類化療藥物療效的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2008年1月至2013年12月收治的207例接受新輔助化療的經病理證實的乳腺癌患者，均為女性，年齡23～56(40±16)歲，參照TNM標準分期為Ⅱ期71例，Ⅲ期136例?；颊呷榉可暇嬖诳蓽y量的病灶，腫瘤直徑3～12 cm。化療前行常規(guī)血及心、肝、腎功能檢查，排除化療禁忌證者、年齡>56歲者以及不配合研究者。

1.2 化療方案的選擇 所有患者均采用FEC方案進行化療：5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，環(huán)磷酰胺500 mg·m-2，表阿霉素100 mg·m-2，均采取靜脈滴注，化療結束后3 d給予患者行療效評估。

1.3 Ki-67的檢測 采用Envision二步法，石蠟切片并脫蠟，放入乙二胺四乙酸修復液行修復5 min；行PBS沖洗，加入一抗過夜(4 ℃)。重復PBS沖洗，加入二抗40 min(37 ℃)；重復PBS沖洗，二氨基聯苯胺液顯色，蘇木素-尹紅復染后封片行鏡下觀察。其中每張切片中選擇5個高倍視野，根據切片中所選視野的陽性細胞占全部細胞的比例進行結果判定，其中<5%為陰性(-)、5%～<25%為弱陽性(+)、25%～50%為陽性(++)、>50%為強陽性(+++)。

1.4 Her-2及Top2A基因表達的檢測 采用熒光原位雜交(FISH)檢測Her-2、Top2A的基因表達。具體過程為：石蠟切片脫蠟，放入預處理液中10 min(95 ℃),胃蛋白酶孵育10 min(25 ℃)，雜交儀中變性5 min(80 ℃)后45 ℃雜交過夜，DAPI中顯色。100高倍鏡下觀察FISH結果并對腫瘤細胞核的信號進行計數。結果紅色信號的總數/綠色信號的總數比值≥2.2時，即為Her-2基因、Top2A基因擴增;不超過1.8時為無擴增; 1.8～2.2時，則需要再計數20個細胞核中的信號。

1.5 療效評估 療效按WHO制定的統(tǒng)一標準評估，完全緩解(CR)：所有病灶均完全消失；部分緩解(PR)：靶病灶最大徑之和減少≥50%，至少維持30 d；疾病進展(PD)：靶病灶最大徑之和至少增加≥25%，或出現新病灶。疾病穩(wěn)定(SD) 靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或增大未達PD。以CR+PR為有效，以PD+SD為無效。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行數據分析，等級計數資料比較采用Fisher確切概率法，相關性分析采用Spearman相關檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 Ki-67分級及其與Top2A、Her-2基因擴增的關系 207例患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例。Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Ki-67分級與Top2A基因、Her-2基因擴增無關(χ2=1.28、1.33，P>0.05)。見表1、圖1。

表1 Ki-67分級及其與Top2A、Her-2基因擴增的關系

2.2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關系 Her-2基因擴增26例中有效為10例(38.5%)，無擴增的118例患者中無有效病例出現，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Top2A基因擴增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無擴增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且Her-2、Top2A的擴增與化療療效均呈正相關(r=0.59、0.58，P<0.05)。見表2。

圖1 Her-2及Top2A基因在乳腺癌患者中的擴增情況

A:Her-2基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Her-2基因與綠色信號的CEN17比值<1.8；B:Her-2基因在乳腺癌上擴增，紅色信號的Her-2基因與綠色信號的CEN17比值≥2.2；C:Top2A基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Top2A基因與綠色信號的CEN17比值<1.8；D: Top2A基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Top2A基因與綠色信號的CEN17比值不低于2.2

表2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關系

3 討論

乳腺癌新輔助化療針對腫瘤，可有效縮小其病灶范圍，提高保乳治療的效果及概率，針對化療后的腫瘤變化，能夠及時調整方案，使得該病的治療更有選擇及針對性，效果較為明顯。含蒽環(huán)類藥物的治療方案是目前最為常用的方案之一。

Top2A作為調節(jié)核酸空間結構動態(tài)變化、控制核酸生理功能的一種關鍵酶，在多種細胞的酶類中均有存在，且在增殖細胞中呈現有周期特異性表達。Top2A在腫瘤增殖的不同細胞周期中表達各異，一般表現為在DNA復制后期及有絲分裂期延長，有絲分裂期結束后表達有所下降，提示腫瘤增殖受Top2A表達的影響[5]。目前較為一致的觀點認為，Her-2蛋白的過表達與基因擴增存在一定的相關性，且Her-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關系較為密切[6]。

有學者認為位于17q12-21基因座的基因，可能在調節(jié)乳腺癌對藥物的反應性中起作用[7-8]。作為蒽環(huán)類藥物重要的作用靶點之一，Top2A基因的擴增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應及其藥效。Top2A陽性表達可提示患者的預后不良，對患者的預后評估比較重要[9-11]。另外，Her-2基因突變可導致基因擴增表達過度，引起Top2A基因出現異常，Her-2狀態(tài)對預測蒽環(huán)類化療藥物的化療效果尚無統(tǒng)一定論。Ki-67在臨床監(jiān)測中也較為重要，其高水平的表達可提示細胞增殖活動較為活躍，表明此類患者的預后不良。新輔助化療后Ki-67表達的下降可反映腫瘤細胞的減少及對化療的敏感程度，并有利于乳腺癌的預后[12-13]。有學者通過對385例化療前核心穿刺標本、新輔助化療后手術標本的Ki-67檢測發(fā)現新輔助化療前后Ki-67的陽性細胞百分比的改變可作為影響預后的因素[14-17]。而本研究中Ki-67的表達未發(fā)現相關性，提示Ki-67蛋白表達與預后相關性不明顯，可能與本研究的研究例數、治療時間有關。本研究結果顯示，207例患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)，Ki-67分級與Top2A基因、Her-2基因擴增無關(P>0.05)。另外，HER-2基因擴增26例中有效為10例(38.5%)，無擴增的118例患者中無有效病例出現，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Top2A基因擴增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無擴增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且Her-2的擴增、Top2A的擴增與化療效果均呈正相關(r=0.59、0.58，P<0.05)，可見Top2A對療效影響的相關系數高于Her-2對療效影響的相關系數，提示Top2A擴增時，對含蒽環(huán)類化療藥物敏感性較高，化療獲益較大，蒽環(huán)類化療藥物的療效更好，Top2A可能比Her-2對蒽環(huán)類藥物更有預測作用?？赡艿脑蚍治鰹椋篐er-2可能并不能直接預測蒽環(huán)類藥物的反應性，Her-2和蒽環(huán)類藥物效能的關系可能依賴于Top2A的同時擴增，并且Her-2激活可以直接增加Top2A的活性。

綜上所述，通過對乳腺癌中Ki-67、Her-2基因、Top2A基因表達的研究發(fā)現，Her-2、Top2A基因不僅可以對乳腺癌患者進行較為準確的個體化分析和評價，Ki-67的表達較不明顯?？蓪er-2基因、Top2A基因作為準確預測蒽環(huán)類藥物敏感性的生物學標志物，對于降低腫瘤對蒽環(huán)類藥物耐藥性，提高化療藥物的敏感性，最終達到提高乳腺癌患者無病生存期和總生存期的目的有一定作用。

[1]SIEGEL R,NAISHADHAM D,JEMAL A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1): 11-30.

[2]WEISS JR,MOYSICH KB,SWEDE H.Epidemiology of male breast cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(1): 20-26.

[3]DEB S,JENE N,FOX SB.Genotypic and phenotypic analysis of familial male breast cancer shows under representation of the HER2 and basal subtypes in BRCA-associated carcinomas[J].BMC Cancer,2012,12:510.

[4]JI M,TANG J,ZHAO J,et al.Polymorphisms in genes involved in drug detoxification and clinical outcomes of anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy in Chinese Han breast cancer patients[J].Cancer Biol Ther,2012,13(5):264-271.

[5]ROMERO A,CALDéS T,DíAZ-RUBIO E,et al.Topoisomerase 2 alpha: a real predictor of anthracycline efficacy[J].Clin Transl Oncol,2012，14(3):163-168.

[6]KüMLER I,TUXEN MK,NIELSEN DL.A systematic review of dual targeting in HER-2-positive breast cancer[J].Cancer Treat Rev,2014,40(2):259-270.

[7]WATANABE N,OTSUKA S,SASAKI Y,et al.Cardiac tolerability of concurrent administration of trastuzumab and anthracycline-based regimen as adjuvant chemotherapy for breast cancer[J].Breast Care (Basel)，2014，9(1):46-51.

[8]RECCHIA F,CANDELORO G,CESTA A,et al.Anthracycline-based induction chemotherapy followed by concurrent cyclophosphamide,methotrexate and 5-fluorouracil and radiation therapy in surgically resected axillary node-positive breast cancer[J].Mol Clin Oncol，2014，2(3):473-478.

[9]BARINOFF J,TRAUT A,BAUERSCHLAG D,et al.Chemotherapy for 70-year-old women with breast cancer in Germany: A survey by the German breast group[J].Geburtshilfe Frauenheilkd，2013,73(5):433-439.

[10]GOGIA A,RAINA V,DEO SV,et al.Taxane and anthracycline based neoadjuvant chemotherapy for locally advanced breast cancer: institutional experience[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014,15(5):1989-1992.

[11]SOLIMAN AA,CSORBA R,ULLRICH A,et al.Antiphopholipid antibodies and functional activated protein C resistance in patients with breast cancer during anthracycline-based chemotherapy administered through an intravenous port-catheter device[J].Clin Appl Thromb Hemost，2014，20(3):338-340.

[12]ANDERSON K,WILLIAMS EM,KAPLAN J,et al.Utility of Immunohistochemical Markers in Irradiated Breast Tissue: An Analysis of the Role of Myoepithelial Markers,p53,and Ki-67[J].Am J Surg Pathol，2014,38(8):1128-1137.

[13]ZHANG G,XIE W,LIU Z,et al.Prognostic function of Ki-67 for pathological complete response rate of neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer[J].Tumori，2014，100(2):136-142.

[14]STATHOPOULOS GP,MALAMOS NA,MARKOPOULOS C,et al.The role of Ki-67 in the proliferation and prognosis of breast cancer molecular classification subtypes[J].Anticancer Drugs，2014，25(8):950-957.

[15]KIM KI,LEE KH,KIM TR,et al.Ki-67 as a predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients[J].J Breast Cancer，2014，17(1):40-46.

[16]CHANTZI NI,PALAIOLOGOU M,STYLIANIDOU A,et al.Estrogen receptor β2 is inversely correlated with Ki-67 in hyperplastic and noninvasive neoplastic breast lesions[J].J Cancer Res Clin Oncol，2014，140(6):1057-1066.

[17]LIN Q,LIU Y,CHEN H,et al.Survivin,Ki-67 and tumor grade as predictors of response to docetaxel-based neoadjuvant chemotherapy in locally advanced breast cancer[J].Mol Clin Oncol，2013，1(5):839-844.

Relationship Between Ki-67,Her-2 and Top2A Amplification in the Breast Cancer and Efficacy of Anthracycline-based Regimen

ZHANG Chengjuan1,DONG Fengmei2,XU Benling1,YUAN Peng1

(1.HenanProvincialTumorHospital,Zhengzhou450008,China;2.ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007,China)

Objective To explore the relationship of Ki-67,Her-2 and Top2A amplification in the breast cancer and efficacy of anthracycline-based regimen.Methods The 207 patients with breast cancer confirmed by pathology underwent the FCC regimen neoadjuvant chemotherapy,and the Ki-67,Her-2,Top2A gene expressions were detected.Results Among the 207 patients,Ki-67 classification of (-) were 32 patients,58 patients were (+),95 patients were (++),22 patients were (+++).Her-2 gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Top2A gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Ki-67 classification was unrelated with the amplification of Her-2 and Top2A genes (P>0.05).Her-2 and Top2A amplification were positive correlated with the effect of chemotherapy (r=0.59,0.58;P<0.05).Conclusion The expression of Her-2 and Top2A has important guiding value in the selection of chemotherapy drugs and prognosis of patients with breast cancer.

Ki-67; human epidermal growth factor receptor 2; DNA topoisomerase Ⅱα; breast cancer; augmentation; anthracycline-based drugs

國家自然科學基金青年基金資助項目(編號：81602637)；河南省科技攻關計劃項目(編號：162102410046)

張成娟(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療相關基因檢測及其臨床應用的研究工作。E-mail：zcj2016@126.com

袁鵬(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺癌的診治及其分子靶點研究工作。E-mail：yuanpeng117@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.003

R737.9；R730.53

A

1673-5412(2017)01-0011-04

2016-10-21)