陳競(jìng)適++劉靜++任海姣++侯愛(ài)香

摘 要：為篩選肉源高產(chǎn)脂肪酶菌株，本研究以湘西陳年臘肉為樣品，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法分析湘西臘肉的微生物結(jié)構(gòu)，利用產(chǎn)脂肪菌株在羅丹明B篩選平板上形成變色圈的方法進(jìn)行初篩，采用對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯比色法比較初篩菌株脂肪酶活力進(jìn)行復(fù)篩，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定復(fù)篩菌株。結(jié)果表明：湘西陳年臘肉有豐富的微生物群落，是產(chǎn)脂肪酶菌株的良好菌源，酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；臘肉中的微生物經(jīng)羅丹明B平板初篩后得1號(hào)菌株，變色圈最大為2.6 cm，11、12號(hào)菌株次之，為2.4 cm；復(fù)篩得酶活力最高的菌株為1號(hào)菌株達(dá)13.8 U/mL，與初篩預(yù)測(cè)結(jié)果一致，經(jīng)構(gòu)建其16S rDNA區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定1號(hào)目的菌株為寡養(yǎng)單胞菌屬。

關(guān)鍵詞：臘肉；微生物菌群；平板水解圈法；酶活力測(cè)定；高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌

Microbial Flora Analysis of Aged Cured Pork in Western Hunan Province and Screening of

a High-Yield Lipase-Producing Strain

CHEN Jingshi1， LIU Jing1， REN Haijiao1， HOU Aixiang1，2，*

（1.College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；

2.Hunan Provincial Engineering and Technology Research Center for Fermented Food， Changsha 410128， China）

Abstract： To screen a high-yield lipase strain derived from processed meat， the bacterial community structure in aged cured pork in western Hunan province was analyzed by the dilution plate count method and the isolated strains were subjected to two rounds of screening on rhodamine B plates for lipase activity. Lipase activity was colorimetrically determined using p-NPP as a substrate. The screened isolates were identified by morphology and molecular biology techniques. The results showed that abundant microbial communities existed in aged cured pork in western Hunan province， which was a good source of microbial lipase with yeasts， molds and Micrococcus being predominant. Primary screening indicated that strain 1 produced the largest zones （2.6 cm diameter） of discoloration on rhodamine B plates， followed by strains 11 and 12 （2.4 cm）. Secondary screening confirmed strain 1 to have the highest lipase activity of 13.8 U/mL. At last a phylogenetic tree was built for the screened strain to identify it as Stenotrophomonas sp.

Key words： cured pork； microbial flora； plate hydrolysis circle method； enzyme activity assay； high-yield lipase-producing bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）03-0001-06

引文格式：

陳競(jìng)適， 劉靜， 任海姣， 等. 湘西陳年臘肉微生物群落分析及高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的篩選[J]. 肉類研究， 2017， 31（3）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001. http：//www.rlyj.pub

CHEN Jingshi， LIU Jing， REN Haijiao， et al. Microbial flora analysis of aged cured pork in western hunan province and screening of a high-yield lipase-producing strain[J]. Meat Research， 2017， 31（3）： 1-6. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001. http：//www.rlyj.pub

我國(guó)發(fā)酵肉制品有著悠久的歷史，因其顏色、香氣、味道和造型獨(dú)特而著稱于世。湖南是全國(guó)肉類食品生產(chǎn)大省之一，80%以上是傳統(tǒng)腌臘制品，其中又以湘西臘肉最具有代表性，湘西臘肉主要是指在湖南西部地區(qū)的農(nóng)戶在臘月期間將自家喂養(yǎng)的本地豬宰殺，在大缸中加入食鹽、糖、亞硝酸鈉及多種香料進(jìn)行腌制，并在自家柴火或土爐進(jìn)行煙熏而加工成的傳統(tǒng)肉制品[1]。由于高鹽、低水分含量和煙熏的原因，傳統(tǒng)臘肉的保存時(shí)間較長(zhǎng)，一般可達(dá)8～10 個(gè)月[2]。在臘肉的發(fā)酵過(guò)程中，食鹽滲透慢，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，微生物對(duì)臘肉的風(fēng)味產(chǎn)生了很大的影響。有研究[3]表明，臘肉中微生物可以通過(guò)代謝支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）生成支鏈醛、醇、酸，從而形成干腌風(fēng)味，同時(shí)，隨著生產(chǎn)周期的延長(zhǎng)，微生物的生長(zhǎng)繁殖也逐漸增多，增加了臘肉制品的安全風(fēng)險(xiǎn)[4]。湖南傳統(tǒng)臘肉的優(yōu)勢(shì)菌主要是乳酸菌和葡萄球菌[5]；葡萄球菌和乳酸菌的數(shù)量分別

為106 CFU/g和105 CFU/g[6]。

脂肪酶屬于界面水解酶，在動(dòng)植物體和微生物中普遍存在，可以催化三脂酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類逆向合成，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、化妝品、油脂與食品加工、有機(jī)合成、表面清洗、皮革與造紙工業(yè)等生產(chǎn)實(shí)踐領(lǐng)域[7]。其中微生物脂肪酶因其來(lái)源廣泛，具有更好的溫度以及酸堿度適應(yīng)性而在食品工業(yè)被廣泛應(yīng)用[8]。目前對(duì)微生物脂肪酶的研究較多，但主要集中于細(xì)菌、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、地霉屬、假絲酵母屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬等[9]，少有關(guān)于肉源中對(duì)于高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的鑒定研究。隨著豬油逐漸退出食用油市場(chǎng)，對(duì)豬油的利用慢慢減少，造成豬油資源的浪費(fèi)，高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選與研究可以為動(dòng)物油脂的改性和腌臘制品的風(fēng)味改良提供新途徑。

本實(shí)驗(yàn)以湖南臘肉為原料，對(duì)其所含的微生物種類及其數(shù)量進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)，分析其菌群組成，然后從中篩選出含高產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌，并進(jìn)行菌種鑒定，旨在為臘肉風(fēng)味改進(jìn)提供微生物種類方面的意見(jiàn)，并對(duì)臘肉中的微生物進(jìn)行合理利用，豐富高產(chǎn)脂肪酶微生物的可選擇種類。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖南湘西臘肉 花垣縣和鳳凰縣農(nóng)戶。

NaCl、4-硝基酚、阿拉伯樹膠、聚乙烯醇、葡萄糖、牛肉浸膏、玫瑰紅B 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氯霉素、Triton X-100、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂（manitol salt agar，MSA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、計(jì)數(shù)瓊脂粉、酵母提取粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限

公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-25085-Ⅱ細(xì)菌生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MJX-250B-Z霉菌生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；凈化工作臺(tái) 蚌埠市瑞風(fēng)凈化設(shè)備有限公司；D2S2-LJC080鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XMTD-7000數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DYCP-33B型瓊脂糖水平電泳槽 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及試劑的配制[9]

富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨粉5.0 g、酵母提取粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、水1 L、豬油乳化液10 L，pH 7.0；初篩培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取粉5.0 g、NaCl 10.0 g、瓊脂12.0 g、豬油乳化液10 mL、0.01 g/mL羅丹明B

1 mL；復(fù)篩培養(yǎng)基：蛋白胨4.0 g、酵母粉0.5 g、蔗糖0.5 g、（NH4）2SO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KH2PO4 0.1 g、豬油乳化液4 mL、pH 8.0；Tris-HCl：6.055 g Tris堿定容至1 L，pH 7.0；對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）溶液母液：0.139 1 g p-NP溶于200 mL Tris-HCl，pH7.0；對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-nitrophenol palmitate，p-NPP）：0.037 8 g p-NPP、0.1 g阿拉伯膠、0.4 mL Triton X-100溶于Tris-HCl緩沖液定容于100 mL，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微生物計(jì)數(shù)

細(xì)菌總數(shù)按GB/T 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；酵母菌、霉菌按GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行測(cè)定；乳酸菌按GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定；微球菌參考菌落總數(shù)的測(cè)定方法，通過(guò)涂布平板接種法接種于MSA培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)定；耐熱菌測(cè)定時(shí)先將裝有混合液的錐形瓶放入75 ℃水浴鍋中加熱處理，之后參考菌落總數(shù)的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 高產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選與分離

1.3.3.1 菌株的富集培養(yǎng)

稱取10.0 g臘肉加入到90 mL富集培養(yǎng)基中，置于37 ℃的搖床內(nèi)以200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.3.2 菌株的初篩及純化培養(yǎng)

參照黃斌[9]與洪琨[10]等的方法，將富集培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，各取0.1 mL 10-6、10-7和10-8

3 個(gè)梯度的稀釋液涂布于含有羅丹明B的初篩培養(yǎng)基上，置于37 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，于380 nm紫外光下觀察，挑選菌落周圍有明顯黃色熒光圈的菌落，利用平板劃線法接種到新的初篩平板上，同樣條件下培養(yǎng)2 d，挑取有黃色熒光圈的單菌落接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下以200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

1.3.4 脂肪酶活力的測(cè)定[9]

采用p-NPP比色法進(jìn)行脂肪酶酶活力的測(cè)定。

1.3.4.1 對(duì)硝基苯酚（p-NP）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用5 mmol/L的p-NP母液分別配制成10， 20，…， 80， 90， 100 μmol/L 10 個(gè)不同濃度的工作液，分別取各濃度的p-NP溶液在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，并用蒸餾水進(jìn)行空白對(duì)照。以A410 nm為縱坐標(biāo)，p-NP的濃度為橫坐標(biāo)，得到p-NP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 樣品酶活力的測(cè)定[9]

取5 mmoL/L p-NPP溶液0.3 mL，待測(cè)菌菌液0.2 mL，兩者充分混合后在37 ℃條件下，以200 r/min搖床培養(yǎng)15 min，立即取出加入0.5 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。以置于80 ℃水浴鍋中加熱5 min進(jìn)行滅活處理后的酶液為對(duì)照，以只加入0.3 mL 5 mmoL/L p-NPP溶液與0.5 mL無(wú)水乙醇為空白組。各組分別取200 μL反應(yīng)液加入

96孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定水解產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚在410 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算p-NP的濃度c，

并換算成酶活力單位，一個(gè)酶活力單位定義為：在37 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘水解生成1 μmol p-NP所需的酶量。

1.3.5 高產(chǎn)脂肪酶目的菌株的鑒定

通過(guò)對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行初步分離篩選、搖瓶復(fù)篩、酶活力測(cè)定后，選定酶活力最高的目的菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.5.1 菌落形態(tài)觀察

分別用平板劃線法和斜面劃線法將目的菌株接種于初篩平板、PCA平板和PCA斜面培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d，觀察記錄菌落形態(tài)。

1.3.5.2 菌株形態(tài)觀察

將PCA斜面培養(yǎng)基上的菌種采用革蘭氏染色法進(jìn)行鏡檢，在顯微鏡下直接觀察菌株的形態(tài)特征。

1.3.5.3 菌株的16S rDNA分子鑒定

基因組DNA的提取：選用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，參照其方法提取出基因組DNA，將提取出的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，觀察是否提取出基因組DNA。

16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析：提取細(xì)菌總DNA，將DNA送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行堿基測(cè)序，然后將得到的16S rDNA測(cè)序結(jié)果提交到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行BLAST對(duì)比，找到并下載典型的菌株序列與實(shí)驗(yàn)菌株的序列用Lasergene軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 臘肉中菌相組成及數(shù)量

由表1可知，細(xì)菌和酵母菌、霉菌數(shù)量最多，為本實(shí)驗(yàn)所用臘肉材料中的優(yōu)勢(shì)菌，微球菌、葡萄球菌和乳酸菌數(shù)量也較多，耐熱菌的數(shù)量最少，其中細(xì)菌、霉菌成為優(yōu)勢(shì)菌可能是因?yàn)樽鞣皇郊庸さ南嫖髋D肉在其保藏上存在缺陷，沒(méi)有避免高濕的環(huán)境，導(dǎo)致了霉菌的大量增生，可以通過(guò)在貯藏過(guò)程中保持較低的水分活度和較低的溫度或是低氧等手段避免臘肉的霉變，從而延長(zhǎng)其保存期。

2.2 臘肉中高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的篩選

2.2.1 高產(chǎn)脂肪酶菌株初篩結(jié)果

通過(guò)采用羅丹明B培養(yǎng)基篩選出12 株可在其中形成明顯黃色透明圈的菌株，測(cè)定其菌落大小以及透明圈大小，結(jié)果如表2所示。

一般情況下，透明圈大的菌株產(chǎn)酶能力也會(huì)越大。由表2可知，1號(hào)菌株透明圈直徑為2.6 cm，為12 組菌株中透明圈直徑最大，4號(hào)菌株水解圈直徑最小，僅為1.4 cm，實(shí)驗(yàn)組中有一半菌株的透明圈直徑基本保持在2.0～2.4 cm左右。但不能僅由透明圈直徑對(duì)產(chǎn)酶能力進(jìn)行判斷，因?yàn)?號(hào)菌株雖然透明圈直徑大，但是其菌落直徑也為最大，不能真實(shí)反映細(xì)菌的產(chǎn)酶能力強(qiáng)弱，因此需要進(jìn)行進(jìn)一步的酶活力測(cè)定來(lái)驗(yàn)證初篩的初步判斷，初篩結(jié)果可以作為酶活力測(cè)定的參考結(jié)果。

2.2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株復(fù)篩及酶活測(cè)定結(jié)果

采用p-NPP比色法對(duì)初篩得到的12 株待測(cè)菌株的酶活力進(jìn)行檢驗(yàn)復(fù)篩。由研究可得，p-NP濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.006x+0.056 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，相關(guān)性較好，可以根據(jù)該方程用吸光度來(lái)判斷p-NP的濃度。利用酶標(biāo)儀測(cè)定所得結(jié)果為p-NP的吸光度，根據(jù)已測(cè)得的p-NP濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各組菌株所對(duì)應(yīng)的p-NP濃度，換算成酶活力大小如表3所示。

由表3可知，通過(guò)比較分析，可以得出12 組菌株中，1號(hào)菌株的酶活力最高，達(dá)13.8 U/mL，10號(hào)次之，

2號(hào)最低僅為1.4 U/mL。1號(hào)組的酶活力約為2號(hào)組酶活力的9.8 倍，其余普通產(chǎn)脂肪酶菌株酶活力基本在

5～6 U/mL之間，為高產(chǎn)菌株的1/2，由酶活力測(cè)定結(jié)果結(jié)合初篩結(jié)果可知：初篩利用透明圈和菌落直徑對(duì)產(chǎn)酶能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，僅為參考意見(jiàn)，表觀特征可能受環(huán)境條件等其他因素的影響，而酶活力測(cè)定是在同等條件下從酶解產(chǎn)物濃度對(duì)產(chǎn)酶能力進(jìn)行判斷，比初篩結(jié)果更為可靠。由酶活力大小可知，1號(hào)菌株因其產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，宜作為目的菌株進(jìn)行研究。

2.3 臘肉中高產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

2.3.1 菌種的形態(tài)觀察

將1號(hào)菌種接種于羅丹明B培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)（48±2） h后形成明顯的透明圈，菌落形態(tài)呈不規(guī)則狀，邊緣為鋸齒狀，表面較黏稠，有菌膜。

2.3.2 菌種的形態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)目的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡下放大100 倍，觀察個(gè)體形態(tài)，如圖1所示。

由圖1可知，目的菌株1號(hào)菌經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性菌。細(xì)菌呈直桿狀，兩端鈍圓，長(zhǎng)度較短，為短桿菌。

2.3.3 目的菌株的16S rDNA分子鑒定結(jié)果

2.3.3.1 基因組DNA的提取結(jié)果

將基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳條帶如圖2所示，說(shuō)明基因組DNA已被提取。

2.3.3.2 目標(biāo)菌株的堿基測(cè)序結(jié)果

將DNA提取物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到1號(hào)細(xì)菌的1 447 個(gè)堿基序列，其基因堿基測(cè)序結(jié)果如下：

2.3.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果

根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果，將得到的堿基序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由圖3可知，發(fā)育樹結(jié)果可判定1號(hào)菌株為寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）。

3 討 論

3.1 臘肉中菌相和優(yōu)勢(shì)菌的分析及應(yīng)用

臘肉中的微生物種類及數(shù)量對(duì)臘肉的發(fā)酵和呈味作用有著較大的影響[11]，為了優(yōu)化臘肉發(fā)酵工藝、改善臘肉風(fēng)味，國(guó)內(nèi)外已有多位學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究，如陳美春等[12]對(duì)四川臘肉在腌制和貯存過(guò)程中微生物的變化情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在腌制中期乳酸菌為最主要的優(yōu)勢(shì)菌，其次為葡萄球菌，乳酸菌數(shù)1.0×105 CFU/g，葡萄球菌數(shù)4.3×104 CFU/g，在成熟貯藏過(guò)程中，臘肉中各菌群的數(shù)量不斷變化，霉菌和酵母菌繼續(xù)生長(zhǎng)。劉洋[13]通過(guò)對(duì)2 種臘肉產(chǎn)品中的葡萄球菌和芽抱桿菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)臘肉中優(yōu)勢(shì)菌株為肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；低鹽臘肉中的葡萄球菌和芽孢桿菌構(gòu)成復(fù)雜，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)菌株。通過(guò)對(duì)臘肉的菌相進(jìn)行分析，可以為臘肉的風(fēng)味改良[14]

提供一定的思路，現(xiàn)大多數(shù)研究主要集中在臘肉的添加物或是臘肉自身所含化學(xué)物質(zhì)的變化對(duì)其風(fēng)味的影響，如在臘肉中添加木瓜蛋白酶[15]、胰蛋白酶[16]，以及臘肉加工過(guò)程中脂肪氧化分解與呈味作用之間的關(guān)系[17]，而少有從微生物組成角度對(duì)風(fēng)味進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)。在對(duì)臘肉進(jìn)行菌相分析時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)菌株主要為酵母菌、霉菌、微球菌，霉菌成為優(yōu)勢(shì)菌可能是湖南臘肉風(fēng)味的重要組成因素，也可能是貯藏過(guò)程中水分含量較高而臘肉品種為陳年臘肉，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致霉菌大量生長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌[18]?？梢哉J(rèn)為，臘肉中的優(yōu)勢(shì)菌除了受臘肉本身的影響外，還可能與環(huán)境條件、地域和存放時(shí)間有關(guān)，因此在菌相組成上與其他地區(qū)的臘肉有些許差異[19]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)湖南陳年臘肉微生物菌群進(jìn)行了研究，并對(duì)其中的高產(chǎn)脂肪酶菌株進(jìn)行了篩選，可以對(duì)湖南地區(qū)陳年臘肉的防腐措施[20]提供建議，并對(duì)發(fā)酵菌株的選育提供一定的指導(dǎo)，有利于指導(dǎo)湖南特色風(fēng)味臘肉發(fā)酵劑的研發(fā)，從而進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。微生物發(fā)酵劑的應(yīng)用有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，控制產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)中一般用乳酸菌與微球菌或霉菌或酵母的混合菌種進(jìn)行發(fā)酵[21]，如劉洋等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以戊糖片球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、清酒乳桿菌和漢遜德巴利酵母菌組合微生物發(fā)酵劑SM-194對(duì)四川臘肉的理化及微生物特性有顯著影響，可在一定程度上改善產(chǎn)品品質(zhì)，保障產(chǎn)品的安全性。

3.2 臘肉中高產(chǎn)脂肪酶的篩選和鑒定

以前的研究大多集中在動(dòng)植物中，如從萌發(fā)的油菜種子中制備脂肪酶[23]。細(xì)菌和真菌中脂肪酶的發(fā)現(xiàn)，帶動(dòng)了微生物資源的發(fā)展[24]，微生物脂肪酶相較于動(dòng)植物脂肪酶，具有生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高和繁殖速度快等特點(diǎn)[25]，因此在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛運(yùn)用，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。符小燕等[26]從廣式臘腸中篩選出的葡萄球菌經(jīng)誘變后酶活力為5.26 U/mL，為初始酶活力的8 倍，在特定的優(yōu)化培養(yǎng)基中測(cè)得最高酶活力為17.54 U/mL。實(shí)驗(yàn)對(duì)臘肉中存在的高產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行了篩選分離、酶活力測(cè)定、堿基測(cè)序與定性分析，從臘肉中篩選出了實(shí)驗(yàn)條件下最高酶活力為13.8 U/mL的革蘭氏陰性寡養(yǎng)單胞菌。

國(guó)內(nèi)有許多學(xué)者對(duì)微生物中脂肪酶的應(yīng)用進(jìn)行了研究，如利用微乳凝膠固定化皺落假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipases，CRL）在有機(jī)溶劑中催化戊酸和乙醇合成食品領(lǐng)域、化妝領(lǐng)域重要香味劑——戊酸乙酯[27]。張權(quán)等[28]利用殼聚糖固定化海洋微生物YS2071脂肪酶，發(fā)現(xiàn)脂肪酶經(jīng)固定化處理之后，其酸堿耐受性增強(qiáng)，酶活力保留率比游離脂肪酶要高，為微生物脂肪酶的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在生物柴油的合成方面，微生物脂肪酶也有著重要的應(yīng)用。通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，霉菌X-28的紫外線突變株X-281產(chǎn)生的脂肪酶對(duì)催化生物柴油的合成有著重要的影響。以大豆油為原料，發(fā)現(xiàn)在5 mL正乙烷作為溶劑，使用20%的固定化脂肪酶用量，反應(yīng)溫度為40 ℃，采用每5 h流加油醇-甲醇（物質(zhì)的量比1∶1）3 次時(shí)，大豆油的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)91%[29]。

本研究對(duì)臘肉中高產(chǎn)脂肪酶菌株進(jìn)行篩選、分離和鑒定，國(guó)內(nèi)研究少有，同時(shí)臘肉中的高產(chǎn)脂肪酶對(duì)臘肉的風(fēng)味以及油脂含量也有著較大的影響[30]，可以此作為改善臘肉風(fēng)味的后續(xù)研究方向。經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)脂肪酶菌株豐富了微生物脂肪酶的種類，對(duì)其進(jìn)行堿基定序和發(fā)育樹定性操作，進(jìn)一步確定了高產(chǎn)脂肪酶菌株的種屬，有利于其后續(xù)的開發(fā)利用。但由于并未對(duì)篩選出來(lái)的高產(chǎn)酶菌株進(jìn)行不同底物的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，因此對(duì)于其在實(shí)際生產(chǎn)生活中的運(yùn)用還較為局限。

4 結(jié) 論

本研究主要對(duì)臘肉中的菌相組成和數(shù)量進(jìn)行了分析，并篩選鑒定出了臘肉中所含的高產(chǎn)脂肪酶菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：臘肉中的主要菌種為酵母菌、霉菌和微球菌，高產(chǎn)脂肪酶菌株為寡養(yǎng)單胞菌，且在實(shí)驗(yàn)條件下，最高酶活力可達(dá)13.8 U/mL。湖南臘肉的菌相構(gòu)成對(duì)湖南臘肉的工業(yè)化生產(chǎn)有著一定的參考作用[31]，高產(chǎn)脂肪酶的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提升了臘肉中微生物的利用價(jià)值。但實(shí)驗(yàn)對(duì)影響臘肉風(fēng)味的優(yōu)勢(shì)菌株并未進(jìn)行研究，僅分析了種類和數(shù)目，下一步可以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臘肉的微生物發(fā)酵劑配方進(jìn)行研究[32]，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)中篩選出來(lái)的高產(chǎn)脂肪酶菌株進(jìn)行應(yīng)用研究，觀察在不同底物條件下或不同實(shí)驗(yàn)條件下，其產(chǎn)酶能力的變化，從而確定其最適底物和最適作用條件[33]，將其合理運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)。

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