王盛 陳莉 馮藝戎 蔡敏

摘要：目的 改進(jìn)熱毒清口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)方中的甘草、射干、黃芩進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定熱毒清口服液中黃芩苷的含量。結(jié)果 薄層色譜法能夠鑒別出甘草、射干、黃芩的特征斑點(diǎn)；黃芩苷在53.60～536.00 ?g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 99），平均加樣回收率為99.85%，RSD=0.63%（n=6）。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，可有效控制熱毒清口服液的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：熱毒清口服液；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）03-0075-03

Improvement of Quality Standard of Reduqing Oral Liquid WANG Sheng1，2， CHEN Li1，2， FENG Yi-rong1，2， CAI Min1 （1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China； 2. State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China）

Abstract： Objective To improve the quality standard of Reduqing Oral Liquid. Methods TLC was used to identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； HPLC method was usded to detect the contents of Baicalin in Reduqing Oral Liquid. Results TLC could identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； Baicalin was detected in range of 53.60–536.00 ?g/mL with good linear relationship （r=0.999 99）， the average recovery rate was 99.85%， and RSD was 0.63% （n=6）. Conclusion The method is simple， accurate and reliable， which can be applied to the quality control of Reduqing Oral Liquid.

Key words： Reduqing Oral Liquid； TLC； HPLC； quality control

熱毒清口服液為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床專家，依據(jù)中醫(yī)學(xué)家姜春華的“截?cái)嗯まD(zhuǎn)”學(xué)術(shù)理論，以“清熱解毒涼血，疏風(fēng)散結(jié)消瘀”為治法，創(chuàng)制的在江淮地區(qū)具有廣泛影響的新安名方制劑。該制劑處方由重樓、黃芩、板藍(lán)根等7味藥組成，具有抗病毒、抗菌、解熱鎮(zhèn)痛等作用[1]，用于治療流行性感冒，在醫(yī)院臨床應(yīng)用已近30年。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床使用的安全性和穩(wěn)定性，本研究對(duì)熱毒清口服液的質(zhì)量控制方法進(jìn)行改進(jìn)，增加甘草、黃芩和射干的薄層鑒別，同時(shí)采用HPLC測(cè)定黃芩中黃芩苷的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD紫外檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器），安捷倫公司；CAMAG熒光燈，瑞士CAMAG公司；定量毛細(xì)管，瑞士CAMAG公司；Sartorius BP211D十

基金項(xiàng)目：安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研課題（2012ZY20）

通訊作者：馮藝戎，E-mail：18655182623@163.com

萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)塞多利斯公司；HH-S型水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠。

甘草對(duì)照藥材（批號(hào)120904-201117）、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)120955-200406）、重樓對(duì)照藥材（批號(hào)121060-201007），中國(guó)食品藥品檢定研究院；熱毒清口服液（批號(hào)20131227、20140312、20140402），安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心；色譜甲醇和乙腈，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 甘草 取本品10 mL，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[2]80。取甘草藥材l.103 g，加乙醚40 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，按供試品溶液制備方法制得對(duì)照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺甘草的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液各0.5 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板（用1%NaOH溶液浸漬晾干，105 ℃活化15 min）上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.2 黃芩 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加鹽酸調(diào)pH值為1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取黃芩對(duì)照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制得對(duì)照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺黃芩的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液4 ?L、對(duì)照藥材溶液2 ?L、陰性對(duì)照溶液4 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵試液，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾[3]。

2.1.3 射干 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加鹽酸調(diào)pH值1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取射干對(duì)照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺射干的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各4 ?L、陰性對(duì)照溶液5 ?L，分別點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇（10∶5∶1）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾[2]267。

2.2 黃芩苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Analytical C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水（47∶53），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 ?L[2]282。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于2500。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL，加乙醇定容至10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率135 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品5.36 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按熱毒清口服液處方，稱取1/10處方量（缺黃芩）的藥材，按工藝制得陰性溶液。精密吸取陰性溶液1 mL，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各5 ?L，注入色譜儀中，測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，供試品色譜圖在與黃芩苷峰相應(yīng)的出峰時(shí)間上，有對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液（0.536 mg/mL）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5 ?L，依次注入色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，以黃芩苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2714.828 48X+4.555 6，r=0.999 99（n=6）。黃芩苷在0.268～2.680 ?g范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液5 ?L，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果平均峰面積為7254.4，RSD=0.77%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 ?L，每隔2 h進(jìn)樣1次，依法測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果黃芩苷峰面積RSD=0.20%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取樣品（批號(hào)20131216）1 mL，平行6份，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芩苷的平均峰面積為1448.516 7，RSD=0.1795%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取樣品（批號(hào)20131216）0.5 mL，平行9份，分別加入黃芩苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進(jìn)樣，依法測(cè)定。結(jié)果平均回收率為99.85%，RSD=0.63%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取6個(gè)批樣品，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

熱毒清口服液為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜。為了更好地保證該制劑的藥品質(zhì)量、提高臨床療效，本試驗(yàn)對(duì)該制劑處方藥味進(jìn)行了定性鑒別研究，在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了方中甘草、黃芩、射干的薄層色譜鑒別，結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，無(wú)干擾，斑點(diǎn)清晰；采用HPLC對(duì)該制劑中主要有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定研究，增加了在該制劑中含量較高的黃芩苷含量測(cè)定指標(biāo)，方法學(xué)考察結(jié)果表明，本方法精密度高，重復(fù)性好。

由于板藍(lán)根與大青葉的成分相似[4]，因此，本試驗(yàn)對(duì)板藍(lán)根與大青葉進(jìn)行合并鑒別研究，采用藥典中板藍(lán)根項(xiàng)下薄層鑒別方法，結(jié)果雙缺陰性試驗(yàn)有干擾，故放棄該制劑中板藍(lán)根與大青葉的薄層鑒別。在重樓的薄層鑒色譜鑒別中，首先采用藥典中重樓項(xiàng)下薄層鑒別方法，供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置沒(méi)有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)；采用文獻(xiàn)[5]方法，陰性試驗(yàn)結(jié)果有干擾，考慮原因?yàn)槠渌煞值母蓴_，故放棄該制劑中重樓的薄層鑒別。

HPLC測(cè)定熱毒清口服液中黃芩苷的含量試驗(yàn)中，對(duì)流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）與乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）進(jìn)行了考察[6-7]。結(jié)果以乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）為流動(dòng)相時(shí)，黃芩苷分離度較差，且降低流速后（0.8 mL/ min）黃芩苷分離度R<1.5，對(duì)稱因子T>1.05，仍然較差；以甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）為流動(dòng)相，當(dāng)進(jìn)樣量為10 ?L時(shí)，黃芩苷分離度較好，但峰的對(duì)稱因子T>1.05，調(diào)整進(jìn)樣量為5 ?L時(shí)，黃芩苷分離度R>1.5，對(duì)稱因子T在0.95～1.05范圍內(nèi)，符合要求。故最后選用以甲醇- 0.4%磷酸水（47∶53）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為5 ?L，作為黃芩苷的含量測(cè)定條件。

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（收稿日期：2016-01-06）

（修回日期：2016-05-17；編輯：陳靜）