顧建青湯 蕊王瑞琦周俊雄尹 佳王良錄支玉香孫勁旅李 宏文利平關(guān) 凱李麗莎王子熹徐 濤

[中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài) (過敏)反應(yīng)科過敏性疾病精準(zhǔn)診療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院臨床免疫研究中心，北京100730]

樺樹主要分布于北溫帶，在歐洲國(guó)家，樺樹花粉是全年中最重要的致敏花粉，數(shù)量達(dá)到禾本科花粉的2倍以上[1]。我國(guó)北方地區(qū)樺樹同樣也廣泛分布，北京城區(qū)空氣中花粉分析顯示，樺樹花粉的含量占全年花粉總量的5.99%，是我國(guó)北方地區(qū)重要的春季致敏花粉，僅次于白蠟樹、柏科和楊屬花粉[2]。對(duì)20萬項(xiàng)次過敏原特異性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)檢測(cè)結(jié)果顯示，樺樹花粉sIgE的陽性檢出率為45.1%，致敏率高[3]。

皮膚試驗(yàn)是診斷過敏性疾病最常用的體內(nèi)診斷方法，主要包括皮內(nèi)試驗(yàn)和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn) (skin prick test，SPT)。1959年，Ebruster首次報(bào)道了 SPT用于過敏性疾病的診斷，與皮內(nèi)試驗(yàn)相比，SPT具有操作簡(jiǎn)便、患者耐受性好、特異度高、重復(fù)性好、與臨床相關(guān)性好、不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，因此被歐洲變態(tài)反應(yīng)和臨床免疫學(xué)會(huì) (European Academy of Allergy and Clinical Immunology，EAACI)推薦為診斷過敏性疾病的首選檢查方法[4-5]。但在國(guó)內(nèi)，目前仍主要以皮內(nèi)試驗(yàn)的方法診斷包括花粉在內(nèi)的吸入性變應(yīng)原，而部分已開展花粉變應(yīng)原點(diǎn)刺試驗(yàn)進(jìn)行過敏性疾病診斷時(shí)采取的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同[6-8]。本研究旨在以變應(yīng)原sIgE檢測(cè)值作為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)北京協(xié)和醫(yī)院樺樹花粉變應(yīng)原 (簡(jiǎn)稱協(xié)和樺樹花粉變應(yīng)原)SPT診斷樺樹花粉過敏癥的有效性和安全性，并確定SPT最佳診斷界值。

資料與方法

對(duì)象

選擇2015年8月10日至2016年10月20日在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài) (過敏)反應(yīng)科就診，患有過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性結(jié)膜炎、過敏性皮炎、蕁麻疹等過敏性疾病的門診患者。本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署書面知情同意書。

入選標(biāo)準(zhǔn):年齡4～70歲；男女不限；已完成樺樹花粉皮內(nèi)試驗(yàn)和 (或)sIgE檢測(cè)。

排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠期及哺乳期婦女；試驗(yàn)前未停用抗組胺藥物或停藥時(shí)間小于藥物5個(gè)半衰期；正在服用全身糖皮質(zhì)激素；皮膚劃痕征陽性；試驗(yàn)部位有皮膚感染、皮炎或外傷、瘢痕等病理變化；銀屑病；過敏性疾病急性發(fā)作期 (如過敏性哮喘急性發(fā)作)；有嚴(yán)重影響全身狀態(tài)的疾病 (包括嚴(yán)重的高血壓、冠心病等)；目前正在應(yīng)用β受體阻滯劑治療 (包括局部應(yīng)用)；3個(gè)月內(nèi)參加過其他藥物臨床試驗(yàn)；研究者認(rèn)為不適合參加試驗(yàn)的其他情況。

剔除標(biāo)準(zhǔn):不符合入選標(biāo)準(zhǔn)或符合排除標(biāo)準(zhǔn)；樺樹花粉血清sIgE結(jié)果缺失；SPT陽性或陰性對(duì)照數(shù)據(jù)缺失；SPT陽性對(duì)照出現(xiàn)陰性反應(yīng) [平均風(fēng)團(tuán)直徑(mean wheal diameter，MWD) ＜3 mm]，或陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性反應(yīng)者 (MWD≥3 mm)。

方法

本研究采用單中心、平行分組的設(shè)計(jì)方法。

所有入選的受試者同時(shí)接受包括圓柏、樺樹、梧桐、洋白蠟4種春季花粉變應(yīng)原點(diǎn)刺液以及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照在內(nèi)的SPT，SPT后留觀1 h。本研究所用點(diǎn)刺液均由北京協(xié)和醫(yī)院變應(yīng)原制劑室生產(chǎn):樺樹花粉變應(yīng)原點(diǎn)刺液批號(hào)為201508D002，于2～8℃保存。陰性對(duì)照為緩沖鹽水甘油溶液，陽性對(duì)照為5 mg/ml磷酸組胺緩沖鹽水甘油溶液。點(diǎn)刺針選用施萊TM一次性使用采血針 (片式點(diǎn)刺針)，由淮安藍(lán)星塑料器械開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

SPT在受試者前臂屈側(cè)皮膚進(jìn)行，方法參照歐洲標(biāo)準(zhǔn)[5]，點(diǎn)刺后15 min觀察結(jié)果。以皮膚點(diǎn)刺后出現(xiàn)的風(fēng)團(tuán)大小為判斷標(biāo)準(zhǔn)，用MWD表示。先測(cè)量風(fēng)團(tuán)的最長(zhǎng)徑為風(fēng)團(tuán)長(zhǎng)軸 (D)，于長(zhǎng)軸的中點(diǎn)做長(zhǎng)軸的垂線，以垂線形成的直徑為風(fēng)團(tuán)短軸 (d)。MWD＝(D＋d)/2。同時(shí)觀察并記錄受試者在SPT后15 min、1 h以及6 h后出現(xiàn)的不良事件。

SPT后采集受試者血清進(jìn)行樺樹花粉變應(yīng)原sIgE檢測(cè)，應(yīng)用ImmunoCAP?系統(tǒng) (Phadia AB)的全自動(dòng)熒光免疫分析儀Phadia?1000及配套試劑。

研究流程見表1。

表1 研究流程Table 1 Research process

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以樺樹花粉變應(yīng)原sIgE檢測(cè)結(jié)果為過敏原特異度診斷的相對(duì)金標(biāo)準(zhǔn):sIgE≥0.35 kUA/L為陽性組，sIgE＜0.35 kUA/L為陰性組。

進(jìn)行受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC曲線)分析，計(jì)算ROC曲線下面積 (area under curve，AUC)，估算SPT最佳診斷界值及特異度達(dá)95%時(shí)的診斷界值。分析樺樹花粉SPT的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。對(duì)不良事件的表現(xiàn)、嚴(yán)重程度、轉(zhuǎn)歸以及與SPT的關(guān)系等進(jìn)行總結(jié)。

結(jié) 果

一般情況

本研究共計(jì)入組1 029例，無脫落病例，其中22例受試者的樺樹花粉變應(yīng)原sIgE結(jié)果缺失，不進(jìn)入全分析集 (full analysis set，F(xiàn)AS)，F(xiàn)AS共1 007例。另有不符合入選標(biāo)準(zhǔn)72例，陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性反應(yīng)104例，陽性對(duì)照出現(xiàn)陰性反應(yīng)86例，無陰性、陽性對(duì)照1例。共剔除264例，剔除率25.66%，符合方案集 (per protocol set，PPS)765例。

FAS受試者的平均年齡為 (32.14±13.69)歲，最小5.68歲，最大65.28歲；男509例 (50.55%)，女498例 (49.45%)。PPS受試者平均年齡為(32.55±13.62)歲，最小5.68歲，最大65.28歲；男392例 (51.24%)，女373例 (48.76%)。

PPS的SPT組胺陽性對(duì)照MWD為 (4.74±1.38)mm，最小值3.00 mm，最大值25.50 mm。

所有受試者均有安全性評(píng)估記錄，安全數(shù)據(jù)集(save set，SS) 為1 029例。

有效性評(píng)價(jià)

以樺樹花粉變應(yīng)原sIgE檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，采用SPT診斷樺樹花粉過敏的ROC曲線:FAS的AUC為0.909，95%可信區(qū)間為0.891～0.928；PPS的 ROC曲線AUC為0.919，95%可信區(qū)間為0.898～0.939(圖1)。由FAS的ROC曲線確定最佳診斷界值為4.25mm，特異度達(dá)95%時(shí)的診斷界值為5.75 mm。由PPS的ROC曲線確定最佳診斷界值為4.25 mm，特異度達(dá)95%時(shí)的診斷界值為5.25mm。

圖1 協(xié)和樺樹花粉變應(yīng)原用于診斷樺樹花粉過敏的受試者工作特征曲線Fig 1 Receiver operating characteristic curve of birch allergen used to diagnose birch pollen allergy FAS:全分析集；PPS:符合方案集

分別以樺樹花粉點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果MWD 3.00、4.25及5.75mm為診斷界值，SPT診斷樺樹花粉過敏癥的準(zhǔn)確性見表2、3。

安全性分析

SS共納入1 029例受試者，在整個(gè)研究過程中共6例出現(xiàn)了7次不良事件，不良事件發(fā)生率0.58%(6/1 029)，這些不良反應(yīng)均被認(rèn)為與受試者接受的變應(yīng)原SPT相關(guān)。本研究不良事件表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、流涕、鼻塞、眼癢以及點(diǎn)刺局部皮膚出現(xiàn)較大風(fēng)團(tuán)反應(yīng)等 (表4)。所有不良事件均為輕度，無需特殊處理，且均可自行緩解。本研究過程未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。

表2 以SPT不同界值診斷樺樹花粉過敏癥的病例分布 (FAS)Table 2 Diagnosis of birch pollen allergy with different boundary values of skin prick test(FAS)(n)

表3 以SPT不同界值診斷樺樹花粉過敏癥的的準(zhǔn)確性 (FAS)Table 3 Accuracy of diagnosis of birch pollen allergy by different skin prick tests(FAS)

表4 不良事件分類及其發(fā)生率Tab le 4 Classification and incidence rate of adverse events

討 論

在大多數(shù)情況下，過敏性疾病的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法是基于詳細(xì)的臨床病史以及通過皮膚試驗(yàn)或體外測(cè)試明確的與臨床病史一致的相關(guān)過敏原。過敏原激發(fā)試驗(yàn)作為診斷過敏性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)期以來一直作為研究過敏性疾病發(fā)病機(jī)制或者抗過敏藥物療效的研究手段，由于激發(fā)試驗(yàn)可能誘發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)等安全問題同時(shí)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程，而且隨著目前體外檢測(cè)方法的進(jìn)步以及高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化變應(yīng)原用于皮膚試驗(yàn)，激發(fā)試驗(yàn)已很少用于變態(tài)反應(yīng)臨床工作[9]。

20世紀(jì)70年代以來，過敏原體外診斷得到飛速發(fā)展。瑞典Pharmacia公司率先使用熒光酶聯(lián)免疫法 (ImmunoCAP?系統(tǒng))進(jìn)行過敏原sIgE檢測(cè)，目前該方法是國(guó)際上應(yīng)用最為廣泛的過敏原sIgE檢測(cè)方法，具有很好的重復(fù)性與臨床相關(guān)性[10]。北京協(xié)和醫(yī)院于1992年將該檢測(cè)方法引入國(guó)內(nèi)以來，該檢測(cè)系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，多年來的臨床資料顯示，ImmunoCAP?系統(tǒng)用于過敏性疾病的特異性診斷準(zhǔn)確可靠[11]。國(guó)外很多研究資料也表明，SPT與ImmunoCAP?血清 sIgE檢測(cè)結(jié)果一致性好[12-15]。EAACI推薦，對(duì)于常見花粉和寵物過敏原，依據(jù)臨床病史，輔以SPT和 (或)sIgE檢測(cè)結(jié)果，即可做出過敏原特異性診斷[4]。本研究以血清sIgE檢測(cè)為相對(duì)金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)SPT用于樺樹花粉過敏原特異性診斷的有效性。

點(diǎn)刺針的種類多樣，用不同的點(diǎn)刺針進(jìn)行SPT的比較研究顯示，針尖1.0 mm長(zhǎng)的單頭Lancet鋼針的重復(fù)性最好，假陰性和假陽性少，受試者疼痛感輕[16-17]。但由于目前國(guó)內(nèi)尚無變應(yīng)原點(diǎn)刺試驗(yàn)的專用點(diǎn)刺針，故本研究選用由淮安藍(lán)星塑料器械開發(fā)有限公司生產(chǎn)的一次性鋼片式點(diǎn)刺針。

進(jìn)行點(diǎn)刺試驗(yàn)時(shí)，點(diǎn)刺針穿過液滴垂直刺入皮膚，需停留至少1 s，點(diǎn)刺壓力適中，如果壓力過輕針尖沒有刺入上皮，會(huì)造成假陰性反應(yīng)；如果刺入過深引起出血，會(huì)造成假陽性反應(yīng)。由于本研究所用的點(diǎn)刺針是原本用于采集指血的采血針，針尖稍大，容易刺入表皮，造成出血或假陽性反應(yīng)，或者操作護(hù)士為了避免出血，用力過輕，造成假陰性反應(yīng)，因此本研究的剔除病例數(shù)較多。但剔除后的PPS研究結(jié)果與FAS的分析結(jié)果一致。

SPT除了受點(diǎn)刺針、操作者手法的影響外，還受到受試者皮膚條件、用藥史等多方面的影響，為了保證點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需同時(shí)加做陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。陰性對(duì)照通常選用過敏原制劑提取緩沖液。陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性反應(yīng)的可能原因包括:受試者皮膚劃痕征陽性，或操作者點(diǎn)刺時(shí)用力過度。為避免過敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果解釋困難，本研究剔除了陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性反應(yīng)者。陽性對(duì)照通常選用組胺溶液，目前歐洲推薦使用的是10 mg/ml鹽酸組胺，引起皮膚反應(yīng)的 MWD約7 mm(5.4～8.5 mm)[18]。因鹽酸組胺的藥用制劑在國(guó)內(nèi)不易獲得，故本研究選用的是5mg/ml磷酸組胺，組胺基質(zhì)濃度約相當(dāng)于3 mg/ml的鹽酸組胺。結(jié)果顯示，5 mg/ml磷酸組胺陽性對(duì)照引起皮膚反應(yīng)的MWD為 (4.74±1.38)mm(3.0～25.5mm)。

陽性對(duì)照出現(xiàn)陰性反應(yīng)的主要原因是合并用藥對(duì)皮膚反應(yīng)的抑制作用，常見對(duì)皮膚反應(yīng)有抑制作用的藥物，包括抗組胺藥、皮質(zhì)激素全身大劑量應(yīng)用或試驗(yàn)部位局部應(yīng)用、抗抑郁藥、奧馬珠單抗等[5]，研究者在篩選期應(yīng)仔細(xì)詢問受試者合并用藥種類和停用時(shí)間等，對(duì)有相關(guān)合并用藥者予以排除。為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究剔除了陽性對(duì)照出現(xiàn)陰性結(jié)果者。

SPT后15 min觀察和記錄結(jié)果。本研究用記號(hào)筆沿風(fēng)團(tuán)和紅暈的外緣描繪出其形狀，然后用透明膠帶平貼在風(fēng)團(tuán)與紅暈上，使記號(hào)筆描繪的顏色轉(zhuǎn)印至膠帶上，揭起膠帶貼于研究記錄紙上。統(tǒng)一量取記錄紙上的內(nèi)緣直徑作為測(cè)量依據(jù)。

風(fēng)團(tuán)大小可以用掃描面積、MWD或D表示，有研究顯示，掃描面積可以最準(zhǔn)確地反映風(fēng)團(tuán)大小[19-20]，但量取方法比較復(fù)雜，不宜臨床常規(guī)使用；當(dāng)風(fēng)團(tuán)面積＞17 mm2時(shí)，D能更好地反映風(fēng)團(tuán)大小，而且更易于量??；但MWD仍然最常用，MWD≥3 mm為SPT陽性。雖然皮膚對(duì)組胺的反應(yīng)有個(gè)體差異，但這種差異與過敏原引起的皮膚反應(yīng)無關(guān)[21]，所以SPT結(jié)果的判讀無需以組胺陽性對(duì)照的反應(yīng)大小為標(biāo)準(zhǔn)。紅暈反應(yīng)的重復(fù)性差，不能作為SPT結(jié)果判讀的參考指標(biāo)。

ROC曲線是對(duì)所有可能的閾值作計(jì)算顯示敏感度和特異度之間的相互關(guān)系，能動(dòng)態(tài)、客觀地反映診斷系統(tǒng)的效能。以敏感度為縱坐標(biāo)，以 (1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制曲線，AUC越大，診斷準(zhǔn)確度越高。ROC曲線AUC為0.5～1.0，AUC越接近于1.0，說明診斷效果越好。通過ROC曲線能確定檢測(cè)系統(tǒng)的最佳工作點(diǎn)，通常以陽性似然比、Youden指數(shù)、敏感度與特異度之和或平方和最大的一點(diǎn)的數(shù)據(jù)定為診斷臨界值，此時(shí)準(zhǔn)確率最大；但在實(shí)際應(yīng)用中，需要考慮臨床、經(jīng)濟(jì)等多種因素，明確誤診、漏診帶來的后果，有無補(bǔ)救措施等情況綜合考慮，最終確定一個(gè)診斷臨界值[22]。

對(duì)于SPT的MWD這一連續(xù)性資料，本研究采用了ROC曲線分析。ROC曲線AUC為0.909(95%可信區(qū)間0.891～0.928)，因此可認(rèn)為協(xié)和樺樹花粉變應(yīng)原用于樺樹花粉過敏癥的特異性診斷的準(zhǔn)確度較高。

由ROC曲線分析推算最佳閾值為4.25 mm，特異度達(dá)95%時(shí)的閾值為5.25 mm。以國(guó)際推薦的MWD 3mm作診斷界值時(shí)，試驗(yàn)敏感度為0.906 1(95%可信區(qū)間0.884 0～0.928 2)；以4.25mm作診斷界值時(shí)，試驗(yàn)敏感度為0.797 3(95%可信區(qū)間0.766 9～0.827 7)。因?yàn)镾PT操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，常用于過敏原的初步篩查，需要保證較高的敏感度，減少漏診率，所以選擇3 mm作為協(xié)和樺樹花粉變應(yīng)原點(diǎn)刺試驗(yàn)的診斷界值為宜。以5.25 mm作診斷界值時(shí)，試驗(yàn)特異度為0.952 4(95%可信區(qū)間0.929 6～0.975 2)，陽性預(yù)測(cè)值為0.965 7(95%可信區(qū)間0.949 1～0.982 2)，即樺樹花粉點(diǎn)刺試驗(yàn)MWD達(dá)5.25 mm的受試者中，有95%以上過敏原sIgE檢測(cè)陽性，誤診率＜5%。以上結(jié)果提示在結(jié)合臨床病史的前提下，樺樹花粉變應(yīng)原SPT MWD＞5.25 mm時(shí)，基本無需進(jìn)行過敏原sIgE檢測(cè)，即可做出過敏原特異性診斷；當(dāng)5.25mm＞MWD≥3mm時(shí)，過敏可能性大，需進(jìn)行sIgE檢測(cè)以明確診斷；當(dāng) MWD＜3 mm時(shí)，如無春季花粉過敏的相關(guān)病史，則可基本排除樺樹花粉過敏的診斷。Kanceljak-Macan等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同的螨類變應(yīng)原SPT也存在不同的最佳診斷界值。

點(diǎn)刺試驗(yàn)的不良反應(yīng)有皮膚局部反應(yīng)、遲發(fā)反應(yīng)、全身性皮疹、鼻炎、哮喘和過敏性休克等全身反應(yīng)。本試驗(yàn)1 029例共發(fā)生6例與變應(yīng)原點(diǎn)刺試驗(yàn)有關(guān)的不良事件，表現(xiàn)為注射部位大風(fēng)團(tuán)或多個(gè)風(fēng)團(tuán)，鼻癢、流涕、噴嚏、鼻塞、眼癢。所有不良反應(yīng)癥狀輕微，無需處理。試驗(yàn)中未出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng) (如過敏性休克等)，說明該診斷試劑的安全性高。

Liccardi等[24]對(duì)皮膚試驗(yàn)進(jìn)行的一項(xiàng)回顧性研究指出，1985至2005年皮膚試驗(yàn)共發(fā)生致死性事件7例，其中SPT未發(fā)生一例。其他歐洲的研究報(bào)道也顯示，SPT引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)為0.005%～0.008%[25]。盡管點(diǎn)刺試驗(yàn)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的概率很低，但因?yàn)榭赡艹霈F(xiàn)一些致死性的嚴(yán)重不良反應(yīng)(如過敏性休克)，因此需要經(jīng)由專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員實(shí)施SPT，并至少觀察30 min，進(jìn)一步提高SPT的安全性。

綜上所述，采用協(xié)和樺樹花粉變應(yīng)原進(jìn)行SPT，操作簡(jiǎn)便，安全性好，用于樺樹花粉過敏癥特異性診斷的價(jià)值較高，可作為臨床輔助檢查方法。

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