喻永洋

免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)用于結(jié)核病診斷中的價值評價

喻永洋

目的 探究免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)用于結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值,評價其效果。方法 結(jié)核病患者142例作為結(jié)核病組,另選取100例進行健康體檢的志愿者作為健康組。結(jié)核病組患者隨機分為A、B組,各71例,A組進行免疫組化技術(shù)診斷,B組進行原位雜交技術(shù)診斷,觀察兩種方法在顯微鏡下的病變形態(tài),比較兩種診斷方法的檢測陽性率。結(jié)果 A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結(jié)核病的陽性率高于A組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。結(jié)論 免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)都是結(jié)核病診斷較好的手段,但原位雜交技術(shù)診斷結(jié)核病的陽性率高于免疫組化技術(shù),具有臨床推廣價值。

免疫組化技術(shù) ； 原位雜交技術(shù) ；結(jié)核??； 診斷

結(jié)核病主要是由于結(jié)核桿菌侵襲患者機體臟器引起的慢性傳染病,其中以肺部感染最為常見。結(jié)核桿菌感染患者后,使患者機體抵抗力降低,出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、消瘦、呼吸困難等各種疾病,嚴重者會引發(fā)患者發(fā)生肺癌等疾病,影響患者的生命安全和身體健康。有研究表明,早期對患者進行治療,能有效降低患者的感染率,縮短傳染期,降低復(fù)發(fā)率,因此尋找一種準(zhǔn)確可靠的診斷方法具有至關(guān)重要的意義。本次研究對比了免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)在診斷結(jié)核病中的效果,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年12月～2016年3月本院收治的明確診斷為結(jié)核病的患者142例作為結(jié)核病組,另選取100例在本院進行健康體檢的志愿者作為健康組。本次研究經(jīng)過患者及志愿者本人同意并經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)進行。健康組,男56例,女44例,年齡21～73歲,平均年齡(41.29±10.58)歲。142例結(jié)核病組患者隨機分為A、B組,各71例,其中A組：男41例,女30例,年齡23～72歲,平均年齡(48.73±8.76)歲,病程1～6個月,平均病程(3.91±0.72)個月,結(jié)核感染部位：肺結(jié)核37例、淋巴結(jié)核21例、其他13例；B組：男39例,女32例,年齡24～71歲,平均年齡(47.88± 7.93)歲,病程1～5個月,平均病程(3.77±0.48)個月,結(jié)核感染部位：肺結(jié)核39例、淋巴結(jié)核18例、其他14例；A、B兩組患者的性別、年齡及結(jié)核感染部位比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 檢驗方法

1.2.1 A組 行免疫組織化法：①石蠟標(biāo)本制作：將結(jié)核病組和健康組標(biāo)本取樣后立即放入10%福爾馬林中浸泡24 h,之后分別用70%(4 h)、80%(4 h)、90%(3 h)乙醇及無水乙醇(2 h)脫水處理,處理后的標(biāo)本用二甲苯(PX)進行透明處理2 h；最后除雜質(zhì)后,放入純石蠟中,4℃保存待用。②制片：將①中的石蠟切成厚度為4 μm切片,放置于載玻片上滴1 ml蒸餾水,在恒溫水浴鍋上烘干。③組織切片在PX中浸泡10 min,梯度乙醇浸泡5 min脫水后；PX透明處理3 min。④PBS沖洗5 min×3次,將過氧化氫的甲醇溶液滴在標(biāo)本上靜置。12 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；PBS液洗5 min×3次后封閉處理,室溫30 min后傾出多余液體。⑤加入適量一抗,在4℃下過夜,次日PBS洗3次各5 min。⑥加入相應(yīng)的二抗后靜置15 min,PBS洗3次。⑦DAB顯色：在組織標(biāo)本上滴加DBA顯色劑并在顯微鏡下觀察染色程度,PBS沖洗10 min。⑧蘇木精復(fù)燃4 min后用不同濃度酒精脫水后沖洗10 min。⑨PX處理后,XSP-4C光學(xué)顯微鏡下觀察；⑩PBS取代一抗制備的陰性對照。

1.2.2 B組 行原位雜交診斷法：①根據(jù)結(jié)核桿菌設(shè)計特異結(jié)核探針,由上海納昂達生物科技有限公司合成。②制作石蠟切片標(biāo)本,并浸泡在0.8%鹽酸胃蛋白酶液中,37℃消化10～15 min［1］。③TBS洗3次,5 min/次,依次用100%～70%梯度乙醇浸泡5 min脫水后,室溫晾干。④滴加步驟：設(shè)計的探針,98℃變性10 min,在冰水混合物中退火,在37℃孵育1 h,TBS洗3次,滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體,室溫放置0.5 h,專用染液洗3次。⑤滴加NBT/BCIP的堿性磷酸酶的底物緩沖液避光顯色,核快紅襯染5 min,中性樹膠封片鏡檢［2］。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩種診斷方法的標(biāo)本鏡檢下的形態(tài),并計算陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)制片后在顯微鏡下觀察到標(biāo)本的病變部位的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結(jié)核病的陽性率高于A組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。見表1。

表1 兩種診斷方法陽性率結(jié)果(n,%)

3 討論

結(jié)核病是WHO和我國重點防治的重大傳染病,目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬,占全球發(fā)病的14.3%,位居世界第二［3］。該病傳播途徑廣泛,可通過空氣、食物、垂直傳播等途徑進行傳播,危害較大且持續(xù)時間長,給患者造成巨大的心理和生理負擔(dān)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,抗結(jié)核藥物—利福平、異煙肼相繼合成,全球結(jié)核病患者大幅減少。但自20世紀(jì)80年代以來,人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者不斷增多及抗藥性結(jié)核病菌株的產(chǎn)生,結(jié)核病已被WHO列為人類的主要殺手［4］。結(jié)核分枝桿菌細長略彎曲,聚集呈分枝狀排列繁殖,細胞壁含有大量脂質(zhì)(占菌體干重的40%～60%),在細胞壁中最多,大量的脂質(zhì)使一般的消毒劑難以滲入胞內(nèi),表現(xiàn)為對外界環(huán)境有超常的抵抗力,對酸、堿、自然環(huán)境和干燥環(huán)境有抵抗力,對濕熱、酒精、紫外線敏感；此外,結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)、菌落、毒力及耐藥性均可發(fā)生變異,導(dǎo)致耐藥性增強出現(xiàn)耐藥菌株及耐多藥菌株,給治療帶來困難。目前對于結(jié)核病的治療,臨床上主張早期診斷,及時確診并制定治療措施,以防結(jié)核桿菌造成機體其他臟器的破壞［5-8］。臨床上診斷結(jié)核病使用X線、病理切片、抗酸染色等方法。但X線影像儀器復(fù)雜,成本高,且準(zhǔn)確率不高,常會出現(xiàn)誤診或漏診?？顾崛旧?具有病理特征檢測準(zhǔn)確等優(yōu)勢,但檢測時間長,特異性低,會出現(xiàn)假陰性等狀況,限制了其在臨床上的應(yīng)用［9,10］。隨機分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因工程和蛋白工程在疾病診斷方面的影響日益擴大,本次研采用的免疫組化技術(shù)利用特異性抗體與結(jié)核桿菌中的相關(guān)蛋白結(jié)合進行檢測,而原位雜交技術(shù)通過設(shè)計特異性探針,通過堿基互補原理與結(jié)核桿菌特異性結(jié)合進行檢測,兩種方法較傳統(tǒng)的診斷方法特性性更高。

本次研究結(jié)果顯示：免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)制片后在顯微鏡下觀察到標(biāo)本的病變部位的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結(jié)核病的陽性率高于A組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。

綜上所述,兩種方法都是結(jié)核病診斷較好的手段,原位雜交技術(shù)診斷結(jié)核病的陽性率高于免疫組化技術(shù),具有臨床推廣價值。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.03.023

2016-08-23］

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