劉 治，潘大慶，徐從云，陶 陶，吳 奎，肖 峻

目前，前列腺癌已經(jīng)成為男性最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤之一，我國(guó)前列腺癌患者的人數(shù)也有逐年增加的趨勢(shì)，防治前列腺癌的發(fā)生和提高前列腺癌患者生存率已迫在眉睫。因此，對(duì)于前列腺腫瘤細(xì)胞分子機(jī)制的探討也是目前臨床研究的重點(diǎn)方向。LKB1/STK11(liver kinase B1/serine-threonine kinase 11)基因編碼433個(gè)氨基酸，其中包括N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域。LKB1廣泛表達(dá)于人多個(gè)器官以及組織中，如胰腺、腎、肺、結(jié)腸等，且參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及細(xì)胞極性。目前，大多數(shù)研究表明LKB1作為抑癌基因在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等。在常染色體顯性遺傳黑斑息肉綜合征(peutzJeghers syndrome, PJS)患者中也發(fā)現(xiàn)存在LKB1基因突變的現(xiàn)象，而且PJS綜合征患者的癌癥如消化道惡性腫瘤的概率也明顯增加[1-4]。本實(shí)驗(yàn)以高表達(dá)LKB1蛋白的前列腺癌細(xì)胞系(PC-3)為研究對(duì)象，針對(duì)LKB1基因過(guò)表達(dá)后探討PC-3的生物學(xué)行為改變，為進(jìn)一步探討列腺癌的發(fā)病機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1一般資料PC-3、pLV-EGFP(2A)Puro載體由上海拜科生物公司提供；Flag抗體、β-actin均購(gòu)于Abcam 公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Cell Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生物公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自于Thermo Scientific公司，ECL發(fā)光試劑盒由上海天能科技公司提供，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)人LKB1全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)出一對(duì)PCR引物，上游引物包含EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物含Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)并且攜帶Flag標(biāo)簽。上游引物序列：5′-CCGGAATTCATGGAGGTGGTGGACCCGCA-3′，下游引物序列5′-CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGC TTGCAGGCCGACAGC-3′，引物均由上海生物公司合成。根據(jù)以上設(shè)計(jì)合成的引物應(yīng)用KOD酶擴(kuò)增LKB1序列，反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸。反應(yīng)所得PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠回收試劑盒回收并純化PCR產(chǎn)物，-20 ℃保存。

用EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶對(duì)載體pLV-EGFP(2A)Puro以及PCR膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后將酶切回收得到的目的基因片段和載體進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)后的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株，并涂板于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，于次日挑克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并將陽(yáng)性克隆送檢進(jìn)行測(cè)序比對(duì)(測(cè)序在上海生物工程公司完成)。

1.2.2重組慢病毒的包裝 待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，將重組慢病毒載體質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-LKB1-Flag和包裝質(zhì)粒，按照Lipofectamine 2000使用說(shuō)明書(shū)共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后20 h更換為完全培養(yǎng)基，24 h之后，鏡下可觀測(cè)到細(xì)胞融合現(xiàn)象(提示病毒包裝成功并開(kāi)始產(chǎn)生病毒顆粒)。轉(zhuǎn)染48、72 h后分別收集細(xì)胞上清液，1 500 r/min×10 min離心，0.45 μm濾過(guò)膜過(guò)濾，分裝至離心管，12 000 r/min×30 min、4 ℃離心濃縮病毒，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。存放于液氮中更佳?/p>

1.2.3重組慢病毒感染以及穩(wěn)定株篩選 將PC-3細(xì)胞稀釋成1×105/mL細(xì)胞懸液，再以1×104/孔的密度接種于6孔板，然后加入重組慢病毒濾液，感染24 h后棄去含病毒的培養(yǎng)基，更換新鮮的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度2 μg /mL嘌呤霉素，每隔2天左右更換1次含嘌呤霉素(終濃度2 μg/mL)的培養(yǎng)基。2周后收集細(xì)胞，采用qPCR/Western blot法檢測(cè)LKB1的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4Western blot法檢測(cè)LKB1蛋白的表達(dá)水平 棄去空白對(duì)照組(Blank組)、陰性對(duì)照組(NC組)以及LKB1過(guò)表達(dá)組(LKB1組)PC-3細(xì)胞中的培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞1遍，收取各組細(xì)胞，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解3組PC-3細(xì)胞，然后提取細(xì)胞總蛋白；按BCA蛋白濃度測(cè)定法檢測(cè)3組PC-3細(xì)胞總蛋白濃度；平衡各組上樣濃度，然后使用SDS-PAGE凝膠電泳，隨后5%牛奶封閉1 h，分別用Flag、β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜(Flag、β-actin抗體稀釋比分別為1 ∶1 000，1 ∶200，HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，最后ECL發(fā)光顯色。

1.2.5qPCR檢測(cè)LKB1 mRNA的表達(dá) 提取Blank組、NC組、LKB1組PC-3細(xì)胞的總RNA，隨后分別以3組PC-3細(xì)胞總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后分別用LKB1，內(nèi)參的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中LKB1 mRNA的表達(dá)，LKB1引物序列：正向5′-TGGTTCCGGAAGAAACATCCC-3′，反向5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TCAACGACCCCTTCATTGAC-3′，反向5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的增殖能力 取密度長(zhǎng)到約90%的未處理的Blank組PC-3細(xì)胞，以及NC組和LKB1組的PC-3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)孔每孔為3×103/mL細(xì)胞，96孔板邊緣預(yù)留空白孔并加入等量滅菌PBS溶液，同時(shí)3組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在鋪細(xì)胞后0、24、48、72 h時(shí)每孔中加入一定量的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)孔吸收光值，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)、計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Westernblot法檢測(cè)LKB1蛋白的表達(dá)利用Western blot法檢測(cè)Blank組、NC組、LKB1組PC-3細(xì)胞中LKB1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示LKB1組PC-3細(xì)胞過(guò)表達(dá)LKB1(圖1)。

2.2qPCR法檢測(cè)LKB1的表達(dá)利用qPCR法檢測(cè)Blank組、NC組、LKB1組PC-3細(xì)胞中LKB1 mRNA的表達(dá)，相對(duì)于Blank組、NC組，LKB1組PC-3細(xì)胞中LKB1 mRNA的表達(dá)顯著升高(圖2)。

圖1 PC-3細(xì)胞中LKB1蛋白的表達(dá)

圖2 PC-3細(xì)胞中LKB1 mRNA的表達(dá)

2.3CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的增殖能力CCK-8法檢測(cè)Blank組、NC組、LKB1組PC-3細(xì)胞0、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示LKB1組PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)活力于鋪細(xì)胞24 h后開(kāi)始，明顯低于Blank組及NC組PC-3細(xì)胞；但Blank組以及NC組PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)活力差異無(wú)顯著性(表1)。3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖顯示，LKB1組PC-3細(xì)胞與Blank組PC-3細(xì)胞相比，生長(zhǎng)速度受到明顯抑制，而B(niǎo)lank組和NC組PC-3細(xì)胞相比生長(zhǎng)速度差異無(wú)顯著性(圖3)。

圖3 LKB1對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響

分組0h24h48h72hBlank組0.1321±0.0250.2407±0.0290.4351±0.0340.7775±0.047NC組0.1297±0.0160.2398±0.0310.4317±0.0240.7801±0.029LKB1組0.0835±0.0290.1568±0.0280.2340±0.0410.3750±0.026

3 討論

前列腺癌是多因素、多步驟、多基因共同作用的結(jié)果，涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲、遷移等一系列生物學(xué)過(guò)程。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為L(zhǎng)KB1可以通過(guò)激活A(yù)MPK和抑制mTOR進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，在能量不足的情況下，AMPK通路上游基因LKB1能夠磷酸化AMPK，從而激活A(yù)MPK，負(fù)性調(diào)控下游mTOR活性，并進(jìn)一步影響腫瘤的進(jìn)展。大量研究表明，LKB1在多種腫瘤，如子宮頸腫瘤卵巢癌、腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)甚至缺失，而且這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也與LKB1基因密切相關(guān)[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌、鱗癌以及大細(xì)胞癌等不同亞型的肺癌中，發(fā)現(xiàn)均存在LKB1基因的突變[9-11]。相關(guān)研究表明，在LKB1基因敲除后的腫瘤細(xì)胞中，相比于正常未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞，AMPK的表達(dá)降低，而且LKB1基因敲除后的腫瘤細(xì)胞的增殖活性及侵襲能力會(huì)明顯增強(qiáng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示我們LKB1是重要的抑癌基因，抑制LKB1會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及侵襲。

現(xiàn)有研究中，病毒已經(jīng)成為常見(jiàn)的DNA或RNA有效載體。利用病毒為載體可以大大提高DNA或RNA進(jìn)入細(xì)胞的效率，因此在基因傳遞載體中最為高效[12]。慢病毒載體具有以下特征：(1)能夠?qū)⒛康幕蛘现了拗骰蚪M中，穩(wěn)定表達(dá)；(2)具有感染分裂和非分裂細(xì)胞的能力；(3)具有廣泛性[13]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了LKB1過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染LKB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照空載質(zhì)粒于前列腺癌PC-3細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選得到NC組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系、LKB1過(guò)表達(dá)組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。并且利用CCK-8法檢測(cè)了LKB1對(duì)不同組細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與Blank組、NC組比較，LKB1組的LKB1 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均明顯升高；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Blank組和NC組相比，LKB1組PC-3細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，表明LKB1基因表達(dá)增強(qiáng)后，會(huì)明顯抑制PC-3細(xì)胞的增殖能力。提示我們LKB1基因在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，LKB1可作為研究前列腺癌細(xì)胞增殖分子機(jī)制的新靶點(diǎn)。

細(xì)胞持續(xù)旺盛的增殖是腫瘤細(xì)胞重要的特征之一，如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖是目前腫瘤治療的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。由于現(xiàn)在對(duì)LKB1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中所發(fā)揮的功能尚未完全清楚，LKB1所涉及的信號(hào)通路和其在相關(guān)信號(hào)通路中所參與的機(jī)制也沒(méi)有完全清楚。本實(shí)驗(yàn)初步探討了過(guò)表達(dá)LKB1后對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為進(jìn)一步觀察LKB1的分子機(jī)制和深入探討LKB1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究前列腺癌細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制提供潛在的重要靶點(diǎn)。

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