熊紅梅，郭榮年，邱曉明

近幾年，彈力纖維染色被廣泛應用于病理診斷中，如腫瘤靜脈浸潤、漿膜浸潤的判斷，腫瘤早期浸潤的確定、皮膚彈力纖維增生癥等常常用到彈力纖維染色。皮膚組織HE染色中，彈力纖維與膠原纖維相似，均著染深淺不一的紅色，兩者較難區(qū)分，只有通過彈力纖維特殊染色才將兩者顯示出來。顯示彈力纖維的方法很多，常用的有Gomori醛品紅法、Weigert間苯二酚堿性品紅法、維多利亞藍法、Uana地衣紅法等[1]，后三種方法染色時間均長，有些甚至要過夜。在常規(guī)病理檢查工作中常用Gomori醛品紅法，作者通過工作實踐和摸索，對Gomori醛品紅法進行了改良，效果良好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1標本收集2014～2016年福建醫(yī)科大學附屬龍巖市第一醫(yī)院皮膚科取材活檢的皮膚組織30例，5例肺癌緊鄰胸膜組織，3例腸癌標本中的動脈組織，每例標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片、普通載玻片撈片、恒溫箱(55 ℃)烤片過夜。其中每個蠟塊均切5張，傳統(tǒng)法切片3 μm厚，改良法切片5 μm厚，分5組。

1.2設備Tissue-Tik Vip6組織脫水機，Leica2245切片機，Olympus BX41普通光學顯微鏡

1.3試劑(1)醛品紅染液：堿性品紅0.5 g+70%乙醇100 mL+濃鹽酸1 mL+三聚乙醛1 mL。先把堿性品紅溶解于70%乙醇，然后加入濃鹽酸和三聚乙醛，塞緊瓶蓋，輕輕搖動使均勻混合，于室溫下放3～4天(冬天時所需時間更長)，待轉變?yōu)樯钭仙礊槌墒炜捎茫? ℃冰箱保存。(2)Lugol碘液：碘片1 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾水100 mL，先將碘化鉀溶解于10 mL蒸餾水，加入碘片，輕輕搖動使之完全溶解后再加入其余蒸餾水，置4 ℃冰箱保存。(3)5%硫代硫酸鈉液：硫代硫酸鈉5 g+蒸餾水100 mL溶解混合，置4℃冰箱保存。(4)桔黃G液：桔黃G 2 g+磷鎢酸5 g+蒸餾水100 mL，室溫保存，取上清液使用。(5)0.5%高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5 g+蒸餾水100 mL混勻溶解棕色瓶裝，置4 ℃冰箱保存。(6)酸性高錳酸鉀溶液：0.5%高錳酸鉀溶液與0.5%硫酸臨用前等量混合。(7)2%過碘酸：過碘酸2 g+蒸餾水100 mL混勻溶解，置4 ℃冰箱保存。(8)3%過氧化氫溶液：為醫(yī)用雙氧水，本院藥劑科提供。(9)70%乙醇：70 mL無水乙醇+30 mL蒸餾水配成，室溫保存。(10)2.5%草酸溶液：2.5 g草酸+蒸餾水100 mL混合溶解，室溫保存?zhèn)溆?。所用試劑均為國產分析純。

1.4染色方法(1)組：傳統(tǒng)Gomori醛品紅法[1]；(2)組：改良酸性高錳酸鉀法；(3)組：改良0.5%高錳酸鉀法；(4)組：改良2%過碘酸法；(5)組：改良3%過氧化氫法。5種具體染色方法見表1。

1.5觀察方法顯微鏡觀察染色切片，參照中華醫(yī)學會編著《臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊》常規(guī)石蠟切片質量評分標準[2]，省略其它項目的分值，僅對“染色清晰、對比度好”該項10分，應用于彈力纖維著色清晰度、對比度進行評分。用10×物鏡觀察彈力纖維，皮膚組織再用40×物鏡觀察耐酸纖維、前彈力纖維，>90%彈力纖維清晰著色鮮艷為9～10分，80%～90%為8～9分，70%～80%為7～8分，60%～70%為6～7分，依此類推，不著色為0分。

2 結果

38例組織5種方法染色質量平均分：傳統(tǒng)法(1)組為4.20±1.19，改良法(2)組為9.43±0.50，(3)組為9.03±0.61，(4)組為8.80±0.84，(5)組為4.80±1.69，改良法(2)(3)(4)與傳統(tǒng)法(1)比較差異有顯著性(P<0.05)，改良法(5)與傳統(tǒng)法(1)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，傳統(tǒng)法與改良法染色結果比較見表2(圖1～10)。

3 討論

彈力纖維廣泛分布于身體各處，特別在皮膚、血管壁、韌帶、氣管、支氣管、肺泡、耳廓和腺體的導管處最為豐富，它由兩種成分組成，即集合束的彈力微纖維(由糖蛋白形成)和均質狀的彈力蛋白，彈力蛋白提供彈力纖維的彈性，彈力纖維在新鮮標本上呈黃色發(fā)亮的細線條狀，在HE染色下，呈深淺不一的粉紅色，與膠原纖維不易區(qū)別，為了更好地顯示彈力纖維的病變，作者在傳統(tǒng)法的基礎上做了如下幾個方面的改良：(1)氧化劑的改良：酸性高錳酸鉀、高錳酸鉀、過碘酸、過氧化氫均為氧化劑，彈力纖維的主要成分含有豐富的二硫鍵糖蛋白又稱彈性蛋白，切片經上述氧化劑氧化后，彈力纖維內糖蛋白中已糖羥基轉變?yōu)槿┗c成熟的呈深紫色的醛品紅染液具有較強的親和力，與彈力纖維結合很緊。傳統(tǒng)法Lugol碘液是碘和碘化鉀的混合溶液，作為氧化劑，其氧化能力不強，只能顯示部分彈力纖維，對較細的耐酸纖維、前彈力纖維未能顯示，染色淡，不鮮艷清晰，對比度差，而且配制麻煩，需稱取兩種化學粉劑。經實踐證明，其失效快，4 ℃冰箱保存僅3個月，超過3個月染色質量明顯減弱。改良法中高錳酸鉀是最強的氧化劑之一，深紫色結晶，光有催化分解作用，宜用棕色瓶室溫保存。作為氧化劑受pH值影響很大，在酸性溶液中氧化能力最強，可明顯提高其氧化作用，在病理實驗室常用的濃度為0.25%～0.5%，作者用0.5%的高錳酸鉀溶液，具有強烈的氧化作用，酸性高錳酸鉀改良法中臨用前在0.5%的高錳酸鉀溶液中加入等量的0.5%硫酸，其氧化作用更強，能將彈力纖維系統(tǒng)的三種纖維成分均清晰顯示出來，染色鮮艷，質量穩(wěn)定，效果最佳，與傳統(tǒng)氧化法相比，差異有顯著性(P<0.05)。過碘酸也稱高碘酸，白色結晶，無臭，有潮解性，粉劑宜置冰箱保存，屬無機氧化劑，性質穩(wěn)定，常用濃度0.5%～5%，作者用2%的過碘酸作用20 min，無需漂白的步驟，其染色質量穩(wěn)定，效果也很理想，與傳統(tǒng)法比較差異有顯著性(P<0.05)。過氧化氫溶液為無色透明溶液，由于其性質活潑且容易分解，保存時應該盡量使用密閉容器，防止日光照射，而且不宜長時間儲存，雙氧水的工作性質是新生態(tài)氧，其有較強的氧化作用，又有漂白作用，市售濃度30%，醫(yī)用濃度3%，本組實驗采用3%過氧化氫溶液作用20 min，彈力纖維清晰，但由于其性質不穩(wěn)定，不易儲存，染色效果也不夠穩(wěn)定，塑料瓶裝，剛開封使用，染色效果很好，著色鮮艷、清晰，隨著放置時間的延長，氧化能力下降，即使在有效期內，染色效果也越來越差，特別在皮膚組織中彈力纖維不夠清晰，對比度較差，但在胸膜、動脈中染色清晰，對比度好，這可能是由于彈力纖維在不同組織中的結構形式不同有關，如在皮膚組織中，彈力纖維呈單條出現(xiàn)；在胸膜、動脈中呈膜樣結構[3]，鏡下容易觀察辨認。因此，與傳統(tǒng)法比較差異無顯著性(P>0.05)。(2)醛品紅染液儲存方式的改良：配好成熟后，用裝免疫組化抗體的小塑料瓶分裝，可以延長試劑有效期，減少三聚乙醛和乙醇的揮發(fā)，導致染液失效快，造成浪費，本實驗室4 ℃冰箱保存可以10個月，甚至1年仍然有效。(3)染色方式的改良：由于染液中含乙醇易揮發(fā)，傳統(tǒng)法采用立式染缸浸染，但浸染所用染液量多，造成浪費，而且對后面切片的染色不能保證試劑新鮮，容易污染。作者經改良采用滴染用孵育盒加蓋的方式染色，可以保證試劑新鮮，且不致污染。為了不影響效果，避免染色過程中染液彌散，染色時70%乙醇浸洗完，用吸水紙擦干或讓其自然涼干，再用固體石蠟在組織周邊5 mm處劃粗線條的圈，并且中途往切片上補滴染液1～2次，防止乙醇揮發(fā)導致干片。(4)醛品紅染色時間延長到20 min，可使染色更加鮮艷、清晰。(5)分化是染色的關鍵，分化過久，已經染上的彈力纖維退色，分化不夠，切片底色不干凈，對比度不好，傳統(tǒng)法分化用2次，每次30 s，筆者認為，時間太長，容易使彈力纖維退色，改良法分化時，左右振蕩浸洗8～10 s比較適宜。(6)切片厚度的改良：作者切5 μm厚的切片比傳統(tǒng)法常規(guī)3 μm、4 μm厚切片更容易觀察彈力纖維的變化，染色清晰易辨。另外，在染色過程中還須注意：(1)桔黃G液要淡染，若過染則會掩蓋彈力纖維的紫色，因此，滴入桔黃G液1 s后即水洗，如過染，水洗時間可長一些，如過淡，再染1 s后水洗。(2)皮膚組織必須切片完整[4]，更容易觀察彈力纖維的連續(xù)性，完整性。但由于其表層細胞層次多，纖維組織與脂肪組織豐富，切片不易切全，易產生破碎，組織松散或切片厚薄不均等現(xiàn)象，為了切片完整，皮膚組織脫水、透明、浸蠟必須充分，切片時粗修完的蠟塊必須充分冷凍，30～60 min，5 μm厚，另外，展片的水溫不能過熱，約40 ℃，以避免蠟帶熔化造成組織分離或形成裂隙等假象。

表1 傳統(tǒng)法與改良法的比較

表2 傳統(tǒng)法與改良法的染色結果比較

①②③④⑤⑥⑦⑧

圖1傳統(tǒng)法：真皮深層見部分與表皮平行走向的粗彈力纖維，呈纖細的極淡紫色圖2傳統(tǒng)法：真皮乳頭淺層未見耐酸纖維、前彈力纖維

圖3改良酸性高錳酸鉀法：真皮中見大量與表皮平行走向的紫色粗彈力纖維圖4改良酸性高錳酸鉀法：真皮淺層見細的淡紫色的前彈力纖維及與表皮基膜相連的耐酸纖維圖5改良過碘酸法：真皮深層見大量與表皮平行走向的紫色粗彈力纖維圖6改良過碘酸法：真皮淺層見細的淡紫色的前彈力纖維及與表皮基膜相連的耐酸纖維圖7傳統(tǒng)法：胸膜彈力纖維呈纖細的極淡的紫色圖8改良高錳酸鉀法：胸膜彈力纖維呈明顯的深紫色

⑨⑩

圖9傳統(tǒng)法：動脈中的彈力纖維呈纖細的淡紫色圖10改良過氧化氫法：動脈中的彈力纖維呈明顯的深紫色

4種改良法與傳統(tǒng)法相比，酸性高錳酸鉀組、高錳酸鉀組節(jié)約了漂白時間，僅用草酸1 min漂白，過碘酸及過氧化氫組均只須一步氧化，不需漂白，簡化了染色步驟，而且傳統(tǒng)法所需化學試劑品種多，配制麻煩，四種改良法氧化劑均單一，價廉，易得，是實驗室常用的試劑。作者認為，對皮膚組織的彈力纖維染色時，選用改良的酸性高錳酸鉀法、高錳酸鉀法及2%過碘酸法較好，對漿膜、血管組織的彈力纖維染色，選用改良的4種方法均可，但是酸性高錳酸鉀是值得推薦的最好的方法。

(本文經南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科馬恒輝指導，特此致謝！)

[1] 龔志錦, 詹榕洲. 病理組織制片和染色技術[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1994:82-87.

[2] 中華醫(yī)學會. 臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2004:6.

[3] 梁英杰, 凌啟波, 張 威. 臨床病理學技術[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011:102-103.

[4] 馬恒輝, 周曉軍. 組織切片常見問題與對策[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2009,25(2):211-214.