丁麗紅,呂林莉,王德光,郝 麗
蛋白尿是許多腎小球疾病的共同臨床表現(xiàn),也是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化及慢性腎功能衰竭的一種重要致病因素[1]。已有研究表明蛋白尿可以直接或間接損傷腎小管上皮細胞,介導(dǎo)間質(zhì)慢性炎癥的發(fā)生。本組之前體內(nèi)[2]和體外[3]的實驗發(fā)現(xiàn)尿中白蛋白可以通過激活腎小管上皮細胞內(nèi)的NLRP3炎性體,活化Caspase 1,釋放IL-1β和IL-18引起腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng),但是白蛋白激活NLRP3炎性體的機制尚不明確。NLRP3炎性體是目前研究最為深入的炎性體,各種體內(nèi)外的刺激因素可以通過細胞內(nèi)鉀離子外流、溶酶體膜破裂后組織蛋白酶B(Cathepsin B)釋放和活性氧(ROS)產(chǎn)生這三種模式激活NLRP3炎性體[4]。本實驗擬觀察不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中Cathepsin B的表達,并用高濃度的BSA體外刺激HK-2細胞,再分別用高濃度KCl、Cathepsin B的抑制劑CA 074 Me以及ROS的抑制劑二苯基氯化碘(diphenyliodonium chloride, DPI)作用于HK-2細胞,通過檢測促炎因子IL-1β和IL-18生成的情況,探討白蛋白激活NLRP3炎性體的可能途徑和機制。
1.1臨床資料選擇30例經(jīng)臨床和腎穿刺活檢確診為原發(fā)性膜性腎病的患者,排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝相關(guān)性腎炎、腫瘤等繼發(fā)性膜性腎病[5]。根據(jù)不同水平的24 h尿蛋白定量分為三組,其中低蛋白尿組(<1 g/24 h)、中蛋白尿組(1~3.5 g/24 h)和高蛋白尿組(>3.5 g/24 h)各10例。所選30例患者在腎穿刺活檢前均未接受激素和(或)免疫抑制劑治療。
1.2HK-2細胞的培養(yǎng)和干預(yù)于37 ℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞,每3天更換新鮮含5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液1次。干預(yù)前將HK-2細胞接種在6孔培養(yǎng)板,加入細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)至部分融合或全部融合時,用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次后,去血清培養(yǎng)24 h,再給予20 mg/mL的BSA培養(yǎng)24 h。
1.3細胞藥物干預(yù)HK-2細胞按0.5×106/mL種植于6孔板,細胞融合80%時加入不同的干預(yù)藥,分別為:對照組、BSA干預(yù)組、高濃度KCl干預(yù)組、高濃度NaCl干預(yù)組、CA 074 Me干預(yù)組、DPI干預(yù)組和二甲基亞砜組(DMSO組)(溶劑對照)。加入KCl、NaCl和CA 074 Me時,同時加入BSA共同培養(yǎng)24 h,而DPI先單獨干預(yù)HK-2細胞2 h后,再加入BSA共同刺激24 h。
1.4Westernblot將6孔板中細胞去除培養(yǎng)基,加入裂解液,離心取上清液檢測蛋白濃度。取等量組織蛋白樣本變性后凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h,加入以封閉液稀釋的Cathepsin B(1 ∶1 000,美國Santa Cruz公司),IL-1β(1 ∶1 000,美國Santa Cruz公司)和IL-18(1 ∶1 000,美國Santa Cruz公司)一抗,4 ℃過夜,洗膜,加入TBST稀釋的二抗 (1 ∶5 000),室溫孵育2 h,洗膜,ECL(美國GE Healthcare)化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin(1 ∶1 000,美國Santa Cruz公司)作為內(nèi)參照。
1.5實時熒光定量PCR6孔板細胞每孔加入Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA,取樣品對總RNA進行純度、濃度及完整性的測定。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。10 μL反應(yīng)體系,條件為37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。實時熒光定量反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環(huán)。以雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對照。本實驗所用引物由南京金斯瑞公司設(shè)計及合成,引物序列為:IL-1β上游5′-CCATGCAATTTGTGTCTTCC-3′,下游5′-ACAACAGGAAA GTCCAGGCT-3′,長度135 bp。IL-18上游5′-AGCTT GCTGAGCCCTTTG-3′,下游5′-TGTGTAGACTGCAG CAGGTG-3′,長度131 bp。GADPH上游5′-TGGT ATCGTGGAAGGACTCA-3′,下游5′-CCAGTAGAGGC AGGGATGAT-3′,長度132 bp。
1.6免疫組化法免疫組化采用SP法。將腎組織石蠟塊連續(xù)3~4 μm厚切片,常規(guī)脫蠟至水,枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)后,采用免疫組化(SP試劑盒,福州邁新公司)檢測Cathepsin B(1 ∶100,美國Santa Cruz公司)的表達。PBS緩沖液作為陰性對照。每張切片隨機選取10個200倍視野,用Image-pro plus 6.0軟件分析,以累計吸光度(A值)表示Cathepsin B陽性表達的相對含量。
2.1CathepsinB在不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示,Cathepsin B陽性信號表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì),且低蛋白尿組膜性腎病患者腎小管上皮細胞中僅有少量表達,而高蛋白尿組腎小管上皮細胞中的表達顯著增強,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1)。
圖1 不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中Cathepsin B的表達
與低蛋白尿組相比,*P<0.05;與中蛋白尿組相比,#P<0.05
2.2BSA刺激HK-2細胞后CathepsinB蛋白的表達在體外實驗中,用20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細胞24 h后收集細胞,Western blot法檢測HK-2細胞中Cathepsin B蛋白的表達,結(jié)果顯示,BSA刺激后的HK-2細胞中,Cathepsin B蛋白明顯高于對照組(圖2)。
圖2 Western blot法檢測BSA刺激HK-2細胞后Cathepsin B蛋白的表達
Control: 對照組;AO: 白蛋白負荷組
2.3高濃度鉀離子對BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18表達的影響為了驗證鉀離子外流是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑,實驗用20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細胞,同時加入高濃度的KCl(150 mmol/L)、NaCl(150 mmol/L)共同刺激HK-2細胞,培養(yǎng)24 h后用Western blot和實時熒光定量PCR法檢測IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,AO組、高濃度KCl組和NaCl組均可使IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05),但高濃度KCl組與AO組及高濃度NaCl組相比,高濃度KCl并未影響IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的表達水平,其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖3)。
圖3 高濃度鉀離子對BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表達的影響
與對照組相比,*P<0.05
2.4CathepsinB的抑制劑CA074Me對BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18表達的影響為了驗證Cathepsin B釋放是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑,用20 mg/mL濃度的BSA體外刺激HK-2細胞時,同時加入CA 074 Me(10 μmol/L)和DMSO共同作用于HK-2細胞,培養(yǎng)24 h后收集細胞,Western blot和實時熒光定量PCR法檢測IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,AO組及DMSO組IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05);但與AO組相比,DMSO組IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平無明顯變化,而CA 074 Me組的Cathepsin B釋放被抑制后,IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的水平明顯降低,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)。
圖4 CA 074 Me對BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表達的影響
與對照組相比,*P<0.05;與AO組相比,#P<0.05
2.5ROS的抑制劑DPI對BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18表達的影響為了驗證ROS生成增多是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑,實驗先用DPI(10 μmol/L)和DMSO作用于HK-2細胞2 h后,再加入20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細胞,培養(yǎng)24 h后收集細胞,Western blot和實時熒光定量PCR法檢測IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表達的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,AO組及DMSO組IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05),但與AO組相比,DMSO組IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平無明顯變化,而DPI組的ROS生成被抑制后,IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA的水平明顯降低,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5)。
與對照組相比,*P<0.05;與AO組相比,#P<0.05
研究表明,NLRP3炎性體可以被多種外源性病原相關(guān)分子模式(PAMPs)如細菌、病毒和真菌等,及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs),如胞外ATP、UA等通過不同的途徑激活,但其激活機制尚不清楚[6]。目前的研究大多數(shù)認為,細胞內(nèi)鉀離子外流、溶酶體膜破裂導(dǎo)致其內(nèi)的Cathepsin B釋放和ROS產(chǎn)生這三種模式[7]是NLRP3炎性體激活的主要方式,并且對這三種模式的研究較多。
鉀離子外流相關(guān)活化通路:研究認為,上皮細胞和內(nèi)皮細胞受損或者應(yīng)激時ATP釋放到胞外,胞外ATP或穿孔素可激活細胞膜上P2X7受體離子門控通道及pannexin-1通道開放,導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流,鉀離子外流,刺激物可以通過該微孔直接活化NLRP3炎性體[8]。另外,能通過介導(dǎo)該微孔結(jié)構(gòu)活化的微生物毒素酶類(如尼日利亞菌素、氣單胞菌溶素)均可由此激活NLRP3炎性體。還有研究表明,一些不能被細胞吞噬的晶體物質(zhì)(如MSU)和某些毒素介導(dǎo)的微孔結(jié)構(gòu)活化也能引起鉀離子外流,最終導(dǎo)致NLRP3炎性體的活化。
Cathepsin B活化通路:細胞吞噬某些微粒樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)或晶體類后,如MSU[9]、二氧化硅、石棉等,可導(dǎo)致溶酶體損傷甚至破裂,溶酶體破裂后可釋放Cathepsin B至胞質(zhì)內(nèi),Cathepsin B通過某些方式激活NLRP3炎性體。研究表明,抑制溶酶體的破裂或減少Cathepsin B的釋放可以阻斷NLRP3炎性體的激活。其他類型的激活劑是否如晶體類或微粒樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)一樣,通過影響溶酶體及Cathepsin B激活NLRP3炎性體,目前還不明確。
ROS介導(dǎo)的活化通路:根據(jù)文獻報道可以發(fā)現(xiàn),目前已知的多種NLRP3炎性體活化信號均能通過促進ROS生成而激活NLRP3炎性體,而且應(yīng)用ROS清除劑或抑制劑后可以明顯抑制NLRP3炎性體的活化。Zhou等[10]研究發(fā)現(xiàn)線粒體來源的ROS是引起NLRP3炎性體激活的關(guān)鍵信號,提示NLRP3炎性體激活與線粒體的功能密切相關(guān)。Tsehopp等[11]研究證實,使用ROS的抑制劑可以阻斷NLRP3炎性體的激活,進而明顯抑制IL-1β的生成,而且他認為在上述三種激活模式中,起最關(guān)鍵作用的是ROS的生產(chǎn)增多。本組前期實驗也發(fā)現(xiàn)高濃度的白蛋白長期刺激可導(dǎo)致腎小管上皮細胞內(nèi)線粒體的功能受損,引起ROS的生成增多,最終導(dǎo)致NLRP3炎性體的激活[12]。
在本組實驗中,用高濃度KCl的目的是用較高的細胞外鉀離子濃度抑制HK-2細胞的鉀離子外流,為了排除高濃度導(dǎo)致的高滲狀態(tài)對細胞可能產(chǎn)生的影響,用同樣濃度的NaCl作為濃度對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制鉀離子外流后并沒有引起B(yǎng)SA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18表達減少。用CA 074 Me的目的是抑制溶酶體破裂而釋放的Cathepsin B,用DPI的目的是抑制ROS的產(chǎn)生,用DMSO作為溶劑對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA 074 Me以及DPI分別抑制Cathepsin B的釋放和ROS的生成后,均可引起IL-1β和IL-18的表達明顯減少,這表明白蛋白引起的腎小管上皮細胞NLRP3炎性體的激活可能與鉀離子外流無關(guān),而與Cathepsin B的釋放和ROS的生成有關(guān)。
眾所周知,尿中的蛋白成分經(jīng)過腎小球過濾進入腎小管后,可以被腎小管重吸收,已有研究表明,絕大部分腎小管腔內(nèi)的蛋白是與近端腎小管上皮細胞刷狀緣上的Cubilin和Megalin受體蛋白結(jié)合后,再被轉(zhuǎn)運至溶酶體內(nèi)進行分解、利用[13],所以健康人每日尿中蛋白質(zhì)的含量小于150 mg。但當進入近端腎小管內(nèi)的蛋白量超出其重吸收能力時,尿中就會出現(xiàn)較多的蛋白,從而形成蛋白尿。因此,我們推測當大量尿蛋白進入小管腔時,腎小管重吸收蛋白系統(tǒng)的負荷也會明顯增加,一方面重吸收的蛋白使上皮細胞的溶酶體活性增加,導(dǎo)致溶酶體破裂后,其內(nèi)的Cathepsin B釋放入胞質(zhì)內(nèi),從而激活NLRP3炎性體;另一方面小管上皮細胞對蛋白的重吸收和處理需要消耗的能量也增加,除了導(dǎo)致小管細胞缺氧損傷外,生成的ROS也增多,最終激活NLRP3炎性體。此外,大量的蛋白尿滯留在小管腔內(nèi)還可以形成蛋白管型,堵塞管腔,使小管上皮細胞缺氧加重,最終導(dǎo)致小管萎縮及纖維化。上述這些因素可能是大量白蛋白長期作用,導(dǎo)致腎小管上皮細胞內(nèi)NLRP3炎性體激活,并造成小管間質(zhì)炎癥及纖維化的機制。
綜上所述,白蛋白可能是通過腎小管上皮細胞中Cathepsin B釋放和ROS生成增多這兩條途徑激活NLRP3炎性體,這為研究蛋白尿?qū)е履I小管間質(zhì)炎癥和纖維化的機制提供新的理論和實驗依據(jù),也為延緩慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展及治療提供新方向。
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