楊 勇，王瑞琳，徐 瑾，尹海波

血管球瘤是一種少見的軟組織腫瘤，是由位于真皮網(wǎng)狀層的微動(dòng)靜脈吻合管(Suequet-hoyer管)周圍的與平滑肌類似的細(xì)胞構(gòu)成的間葉性腫瘤。文獻(xiàn)報(bào)道，免疫組化標(biāo)記h-caldesmon和collagen Ⅳ對(duì)診斷血管球瘤有幫助。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)35例血管球瘤中h-caldesmon及collagen Ⅳ的表達(dá)，觀察具體陽(yáng)性部位，此外將Friend白血病集成轉(zhuǎn)錄因子-1(FLi-1)作為血管內(nèi)皮的標(biāo)志物同時(shí)也進(jìn)行了檢測(cè)并觀察，并同h-caldesmon及collagen Ⅳ進(jìn)行分析比較，旨在進(jìn)一步提高對(duì)該腫瘤的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集天津市天津醫(yī)院病理科2014年12月～2016年3月存檔的血管球瘤患者蠟塊標(biāo)本35例，全部位于手部，其中男性8例，女性27例，年齡15～67歲，平均41歲。

1.2方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組化采用EnVision法，h-caldesmon、collagen Ⅳ及FLi-1單克隆抗體均購(gòu)自Dako公司，4 μm厚連續(xù)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化以及0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，h-caldesmon經(jīng)0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)微波沸煮修復(fù)，F(xiàn)Li-1經(jīng)EDTA高壓沸煮修復(fù)，collagen Ⅳ經(jīng)胃酶37 ℃孵育30 min。然后分別加h-caldesmon、FLi-1及collagen Ⅳ的Ⅰ抗標(biāo)志物，4 ℃冰箱過夜，后加HRP過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠試劑，最后用含0.15%過氧化氫的DAB顯色，蘇木精復(fù)染后樹脂封固。每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

此外，由于血管球瘤的形態(tài)學(xué)易與其他腫瘤有相似之處，一抗還選用了vimentin、SMA、CD34、EMA、CgA、desmin、S-100、CD99及CD68對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫組化標(biāo)記用以鑒別診斷，抗體均購(gòu)自Dako公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定參照血管球瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核出現(xiàn)明顯棕黃色顯色顆粒為陽(yáng)性，h-caldesmon陽(yáng)性定位于胞質(zhì)，collagen Ⅳ陽(yáng)性定位于細(xì)胞周圍基膜，F(xiàn)Li-1陽(yáng)性定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(血管內(nèi)皮定位于細(xì)胞核)。在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，以陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)為陽(yáng)性強(qiáng)度：<10%為陰性；10%～30%為弱陽(yáng)性；31%～60%為中等陽(yáng)性；>60%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鏡檢腫瘤由形態(tài)一致的圓形細(xì)胞組成，呈片狀分布在血管之間或呈環(huán)狀圍繞在血管周圍(圖1)，這些小血管如毛細(xì)血管大小，腔窄而彎曲。瘤細(xì)胞呈圓形或多邊形，邊界清晰，外形規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)淡嗜雙色或嗜酸，細(xì)胞核圓形，位于中央，核膜清楚，有時(shí)見瘤細(xì)胞與梭形平滑肌細(xì)胞移行過渡。

2.2免疫表型35例血管球瘤中h-caldesmon均陽(yáng)性，其中強(qiáng)陽(yáng)性者占57.1%，(表1)。h-caldesmon在腫瘤細(xì)胞中彌漫分布(圖2)，無(wú)背景著色，與collagen Ⅳ和FLi-1相比，主間質(zhì)區(qū)分更明顯(圖3)。34例表達(dá)collagen Ⅳ，陽(yáng)性率為97.1%，鏡下觀察陽(yáng)性部位集中在細(xì)胞邊緣的基膜位置，使腫瘤細(xì)胞呈棋格狀分布(圖4)，相比HE染色更能清楚的顯示細(xì)胞邊界(圖5)，實(shí)性型尤為明顯。collagen Ⅳ抗原修復(fù)強(qiáng)烈建議使用胃酶修復(fù)，實(shí)驗(yàn)曾嘗試不同的修復(fù)方法，選擇經(jīng)0.01 mmol/L pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液微波沸煮修復(fù)時(shí)僅1例達(dá)滿意效果。24例表達(dá)FLi-1，陽(yáng)性率為68.6%，與以往FLi-1表達(dá)在血管內(nèi)皮的細(xì)胞核部位不同，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FLi-1同時(shí)表達(dá)在血管球瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖6)，但是細(xì)胞核陽(yáng)性強(qiáng)度相比其中的血管內(nèi)皮細(xì)胞染色強(qiáng)度為弱(圖7)。FLi-1在血管瘤型的血管球瘤中陽(yáng)性率最高，在其他兩個(gè)亞型中的陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性(表2)。相比手工操作，F(xiàn)Li-1經(jīng)全自動(dòng)免疫組化儀染色后，細(xì)胞質(zhì)的陽(yáng)性顆粒會(huì)更明顯。其他免疫組化結(jié)果：35例血管球瘤中vimentin和SMA均呈(+)，2例CD34呈局灶(+)，1例desmin呈(+)，EMA、S-100、CgA、CD68及CD99均呈(-)。

表1 35例血管球瘤免疫組化結(jié)果[n(%)]

2.3血管球瘤組織學(xué)類型與臨床特征的關(guān)系患者性別及腫物的體積與血管球瘤的不同組織學(xué)類型之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而患者年齡與血管球瘤的組織學(xué)類型之間有顯著相關(guān)性(P=0.01，表3)。

3 討論

血管球是一個(gè)神經(jīng)動(dòng)脈化學(xué)感受器，分布在微動(dòng)靜脈吻合管周圍，可以敏感的調(diào)節(jié)體溫和小動(dòng)脈的血流量。血管球瘤最早于1812年由Wood首先描述，當(dāng)時(shí)稱之為“痛性皮下結(jié)節(jié)”，隨之有一些類似的報(bào)道，直至1924年Masson認(rèn)為該種腫瘤來(lái)源于神經(jīng)肌動(dòng)脈球(血管球)，并命名為“血管球瘤”。后來(lái)通過對(duì)血管球瘤的電鏡下特征進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示血管球瘤有平滑肌分化特點(diǎn)，胞質(zhì)含有微肌絲、梭形致密體，相鄰細(xì)胞間有連結(jié)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周圍有基膜。目前WHO定義瘤細(xì)胞是一種與正常血管球細(xì)胞體中修飾的平滑肌細(xì)胞非常類似的細(xì)胞，WHO(2002)軟組織腫瘤分類將其列入血管周細(xì)胞性腫瘤。

①②③④⑤⑥⑦

圖1鏡下見腫瘤細(xì)胞成片分布于血管之間，瘤細(xì)胞呈規(guī)則圓形，細(xì)胞質(zhì)淡染圖2h-caldesmon在腫瘤細(xì)胞中呈彌漫陽(yáng)性，EnVision法

圖3h-caldesmon表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)成分中界限清晰，EnVision法圖4collagen Ⅳ在腫瘤細(xì)胞中呈陽(yáng)性，EnVision法圖5腫瘤細(xì)胞周圍collagen Ⅳ呈強(qiáng)陽(yáng)性，但間質(zhì)成分同樣呈陽(yáng)性，使主間質(zhì)分界不夠清晰，EnVision法圖6FLi-1同時(shí)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核，EnVision法圖7間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞FLi-1的表達(dá)強(qiáng)于腫瘤細(xì)胞，EnVision法

表2 FLi-1在血管球瘤不同組織學(xué)分型中的表達(dá)[n(%)]

表3 血管球瘤組織學(xué)類型與臨床病理特征的關(guān)系

血管球瘤比較少見，占軟組織腫瘤的2%，好發(fā)于20～40歲，女性多于男性，身體的大部分組織器官均可發(fā)生，最好發(fā)于手部甲下，約占全身的75%。90%的血管球瘤為單發(fā)，多發(fā)性血管球瘤常發(fā)生于青年男性，且多無(wú)疼痛[1]，多發(fā)性血管球瘤常具有遺傳性，與常染色體1p21.1不全外顯有關(guān)[2]。

關(guān)于血管球瘤的組織學(xué)分類目前并不完全一致，WHO(2002)軟組織腫瘤將其分為實(shí)體型血管球瘤、球血管瘤和球血管肌瘤3個(gè)類型，也有其他文獻(xiàn)將其分為實(shí)性型、黏液樣型和血管瘤型[3]。根據(jù)日常工作的體會(huì)，作者認(rèn)為采用后一種分類方法更便于掌握，另外，作者觀察無(wú)論哪種分型均只是從組織學(xué)觀察上的區(qū)分，對(duì)腫瘤的免疫組化表達(dá)和預(yù)后無(wú)顯著差異，但是如果按照后一種分類方法，其中的黏液樣型患者平均年齡比其余兩種類型較大，推測(cè)可能是該類患者的病史較長(zhǎng)，腫瘤發(fā)生黏液變性所致。

血管球瘤需與以下腫瘤鑒別：(1)肌周皮細(xì)胞瘤(myopericytoma)：多發(fā)生于皮下，常累及肢體遠(yuǎn)端，表現(xiàn)為皮下緩慢生長(zhǎng)的無(wú)痛性結(jié)節(jié)，組織學(xué)形態(tài)由相對(duì)一致的卵圓形及短梭形肌樣細(xì)胞分布于大小不一的血管周圍，局部可見多層肌樣細(xì)胞圍繞血管呈同心圓狀或漩渦狀生長(zhǎng)，有時(shí)與血管球瘤難以區(qū)分[4]，鑒別診斷主要依靠病理形態(tài)和臨床資料綜合分析。(2)孤立性纖維性腫瘤(solitary fibrous tumor, SFT)：可發(fā)生于軀體多個(gè)部位，經(jīng)典的SFT瘤細(xì)胞多呈無(wú)結(jié)構(gòu)性或無(wú)模式性生長(zhǎng)(patternless pattern)，可見特征性“鹿角”狀分支血管，免疫組化表達(dá)CD99和CD34，血管球瘤一般不表達(dá)。(3)血管瘤樣纖維組織細(xì)胞瘤(angiomatoid fibrous histiocytoma, AnFH)：好發(fā)于兒童和青少年四肢淺表部位的間葉性腫瘤，由結(jié)節(jié)狀、不規(guī)則成片或呈巢的梭形至卵圓形組織細(xì)胞樣細(xì)胞組成，腫瘤內(nèi)含有多灶性出假血性腔隙，腫瘤主要表達(dá)EMA、CD99和desmin[5]，CD68主要標(biāo)記腫瘤內(nèi)的組織細(xì)胞，借此可與血管球瘤鑒別。(4)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤：好發(fā)于胃腸道，腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性巢片狀，由纖細(xì)的纖維血管分隔，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸性顆粒狀，免疫組化表達(dá)CgA及Syn等神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物，不表達(dá)SMA，血管球瘤偶可表達(dá)Syn[6]，但不表達(dá)其他神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物。

FLi-1是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，最早由Ben-David等在Friend病毒誘導(dǎo)的紅白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。正常生理?xiàng)l件下，F(xiàn)Li-1主要在造血干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，參與調(diào)控定向造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖與分化[7]，其過表達(dá)能夠促進(jìn)血液性腫瘤和實(shí)體性腫瘤的發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤和乳腺髓樣癌中，過表達(dá)的FLi-1能促進(jìn)以上腫瘤的發(fā)展，證實(shí)了FLi-1不僅在血細(xì)胞和血管生成中起重要作用，而且還具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

鈣結(jié)合蛋白(caldesmon)是一種與平衡肌收縮調(diào)節(jié)相關(guān)的特異蛋白，分為低分子量鈣結(jié)合蛋白和高分子量鈣結(jié)合蛋白兩種亞型。h-caldesmon只存在于內(nèi)臟和脈管的平滑肌細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞中，研究表明，h-caldesmon可以結(jié)合肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和降鈣素，通過這種結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)肌肉收縮[9]。主要用于肌源性腫瘤及肌纖維母細(xì)胞瘤的鑒別診斷。

collagen Ⅳ是基膜的主要網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，以往偏重于對(duì)其物理結(jié)構(gòu)的研究及其對(duì)組織的支撐分隔作用，后來(lái)發(fā)現(xiàn)collagen Ⅳ分子結(jié)構(gòu)中也存在重復(fù)序列及復(fù)雜的多功能位點(diǎn)機(jī)構(gòu)，可以控制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖和遷徙過程。

有研究結(jié)果表明,在血管球瘤免疫表型中雖然存在變異性，但均有h-caldesmon的表達(dá)；腫瘤細(xì)胞周圍有豐富的基膜，有collagen Ⅳ的表達(dá)，對(duì)診斷和鑒別診斷有一定的價(jià)值[10]。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)35例血管球瘤進(jìn)行h-caldesmon免疫組化染色，均呈陽(yáng)性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，而collagen Ⅳ免疫組化染色，除1例以外，其他病例腫瘤細(xì)胞周圍均出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性，顯示出細(xì)胞周圍的基膜結(jié)構(gòu)。FLi-1在血管球瘤中的表達(dá)存在差異性，從無(wú)表達(dá)到強(qiáng)陽(yáng)性。

通過觀察比較，h-caldesmon在血管球瘤中表達(dá)令人滿意，細(xì)胞表達(dá)的分布有一定的特點(diǎn)，在靠近血管周圍的腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性最強(qiáng)，而后向外陽(yáng)性強(qiáng)度逐漸減弱，在距離血管較遠(yuǎn)位置的細(xì)胞甚至出現(xiàn)失表達(dá)；除此以外，h-caldesmon在體積較大的腫瘤細(xì)胞相比體積較小的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性更強(qiáng)。collagen Ⅳ因?yàn)楸磉_(dá)在腫瘤細(xì)胞周圍的基膜，因而更能清楚地顯示出腫瘤細(xì)胞的邊界，因間質(zhì)中以及血管周圍也有基膜成分存在，可能會(huì)在腫瘤細(xì)胞的實(shí)際觀察中造成干擾，不如h-caldesmon主間質(zhì)明顯區(qū)分，這一點(diǎn)略有欠缺。另外在觀察中發(fā)現(xiàn)，在某些血管球瘤內(nèi)的部分細(xì)胞出現(xiàn)一定的異型性，表現(xiàn)為細(xì)胞核增大，輕度深染，形狀多樣，但無(wú)核分裂和壞死，在這些細(xì)胞周圍collagen Ⅳ表達(dá)明顯減弱，提示細(xì)胞周圍的基膜成分顯著減少，推測(cè)這一現(xiàn)象是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞退變所致，關(guān)于這一問題還有待進(jìn)一步的研究。在血管球瘤的三種亞型中FLi-1的陽(yáng)性標(biāo)記更強(qiáng)，因?yàn)槠浔旧頌檠軆?nèi)皮的標(biāo)志物，因此更能顯示出腫瘤血管的分布?？傮w而言，collagen Ⅳ染色效果最好，h-caldesmon在主間質(zhì)中分布更加清晰，F(xiàn)Li-1在血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)中更清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)了血管球瘤中FLi-1、h-caldesmon和collagen Ⅳ的表達(dá)，觀察三種抗體各自染色的特點(diǎn)，旨在比較這些抗體在血管球瘤中表達(dá)的差異，探討其在血管球瘤診斷中的作用。結(jié)果提示，h-caldesmon和collagen Ⅳ均是可靠的血管球瘤診斷的標(biāo)志物，F(xiàn)Li-1可作為一種輔助參考標(biāo)志物，有助于血管球瘤的診斷。

[1] Sammaniego E, Crespo A, Sanz A. Key diagnostic features and treatment of subungual glomus tumor[J]. Actas Dermosifiliogr, 2009,100(10):875-882.

[2] Perry A W, Sosin M, Weissler J M,etal. Multiple glomus tumors presenting as an aesthetic abnormality[J].Aesthetic Plast Surg, 2015,39(2):236-239.

[3] 施作霖, 黃良祥, 唐秀如. 13例血管球瘤光鏡和免疫組織化學(xué)觀察[J]. 中華病理學(xué)雜志, 1994,23(4):241.

[4] 張宏圖, 陳素萍, 郭 蕾, 等. 血管球腫瘤8例臨床病理學(xué)觀察[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2008,24(1):54-57.

[5] 武彤彤, 胡維維, 楊清緒, 賴日權(quán). 血管瘤樣纖維組織細(xì)胞瘤6例臨床病理分析[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2013,29(7):761-764.

[6] Miettinen M, Paal E, Lasota J,etal. Gastrointestinal glomus tumors: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 32 cases[J]. Am J Surg Pathol, 2002,26(3):301-311.

[7] Li Y, Luo H, Liu T,etal. The ets transcription factor Fli-1 in development, cancer and disease[J]. Oncogene, 2015,34(16):2202-2231.

[8] Gao P, Yuan M, Ma X,etal. Transcription factor Fli-1 positiverly regulats lipopolysaccharide-induced interleukin-27 production in macrophages[J]. Mol Immunol, 2016,71:184-191.

[9] Walther S, Strittmatter F, Roosen A,etal. Expression and alpha1-adrenoceptor regulation of caldesmon in human prostate smooth muscle[J]. Urology, 2012,79(3):745.e5-12.

[10] Gombos Z, Zhang P J. Glomus tumor[J]. Arch Pathol Lab Med, 2008,132(9):1448-1452.