人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3在胃癌組織中的表達及其意義

自加吉1，2，楊勇琴1，2，孫美濤1，梅 雯1，于成和1，張曉娟3，熊 偉1，2

目的分析 hMTERF3 mRNA和蛋白質(zhì)在胃癌組織及正常組織中的表達，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法分別采用半定量RT-PCR和免疫組化SP法，檢測61例胃癌組織及正常組織中hMTERF3 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，分析 hMTERF3表達與胃癌臨床分期、病理分級、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果hMTERF3 mRNA和蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達水平顯著高于正常胃組織。hMTERF3蛋白在正常胃組織陽性率為24.6%（15／61），胃癌組織中的陽性率為86.9%（53／61），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。hMTERF3蛋白的表達與胃癌臨床分期、病理分級、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論hMTERF3蛋白的表達異常可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制之一，可為預(yù)測胃癌的發(fā)生提供可能的生物學(xué)標(biāo)志物，也可為胃癌基因診斷和基因治療提供潛在的靶標(biāo)。

胃腫瘤；人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3；RT-PCR；免疫組織化學(xué)

人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（humanmitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3）屬于負調(diào)控線粒體 DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）基因表達的蛋白因子，主要參與 mtDNA的轉(zhuǎn)錄抑制、DNA復(fù)制及拷貝數(shù)的調(diào)節(jié)［1］。最近研究表明，hMTERF3蛋白還能調(diào)節(jié)線粒體中核糖體大亞基的組裝，影響線粒體核糖體的生成，進而影響細胞的能量代謝［2］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并不僅僅依賴于細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)，也與線粒體基因有一定的關(guān)聯(lián)［3］。目前，已有文獻報道肝癌、胃癌、腎癌和結(jié)腸癌等多種實體瘤及腫瘤細胞株中mtDNA突變率增高、mtDNA拷貝量減少和線粒體呼吸鏈酶活性降低［4］，提示腫瘤中參與線粒體基因表達調(diào)控的蛋白因子可能存在表達異常。胃癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，每年有近 951 000例的新發(fā)病例和 723 000例的死亡病例，且有年輕化的趨勢，病死率高，危害性大［5］。胃癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，其中涉及多種復(fù)雜的機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化［6］；探討胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制，尋找可能的預(yù)測指標(biāo)，對檢測胃癌病程進展、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后估計具有重要的意義。目前，胃癌組織中hMTERF3的表達變化尚未見文獻報道。本文采用半定量RT-PCR和免疫組化SP法檢測正常胃組織和胃癌組織中hMTERF3的表達水平，分析其在胃癌中的表達規(guī)律以及與生物學(xué)行為特性之間的關(guān)系，以期探討 hMTERF3與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集大理州人民醫(yī)院和大理市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科2015年1～12月胃癌標(biāo)本61例，其中男性35例，女性26例。中位年齡52.3歲，低分化腺30例，中分化腺癌18例，高分化腺癌13例；32例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，29例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；浸潤至漿膜層者39例，浸潤至肌層者22例；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟／美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC／AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ＋Ⅱ期 21例，Ⅲ＋Ⅳ期 40例。所有采集的標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)方法制備病理切片，每例標(biāo)本同時取距離胃癌組織約 5 cm外的正常胃組織作對照。所有入選病例術(shù)前均未接受放、化療，全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)證實，臨床病理資料完整。本實驗經(jīng)大理大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑兔抗 hMTERF3多克隆抗體購自美國 Abcam公司；生物素標(biāo)記的二抗 IgG購自北京鼎國昌盛公司；免疫組化 SP染色試劑盒、DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋公司；PBS緩沖液（0.01 mmol／L，pH 7.4）購自上海碧云天公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000、Trizol RNA提取試劑盒、One Step RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0購自大連寶生物公司；核酸染料 DuRed購自北京全式金生物公司，PCR引物由昆明碩擎生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 半定量 RT-PCR 利用半定量 RT-PCR技術(shù)檢測hMTERF3 mRNA在胃癌組織和正常胃組織中的表達。PCR引物序列采用Primer Premier6.0設(shè)計，以β-actin為內(nèi)參，引物序列如下：上游5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′；下游5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；擴 增 片 段 約 200 bp。hMTERF3引物序列如下：上游5′-ACTTACAGGACTTCCTCCTTATG-3；下游5′-GTCTTCAGAGAAAATTGCAT-3′；擴增片段約 450 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 20μL，PCR反應(yīng)體系為 25 μL，循環(huán)條件如下：95℃預(yù)變性 5 min后進入循環(huán)，每個循環(huán)為95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)28次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，50 min，核酸染料 DuRed顯色。采用DL2000 DNA Maker作為分子量對照。紫外分光光度儀下觀察，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One v 4.6.2軟件掃描產(chǎn)物灰度值，以 hMTERF3基因的 PCR擴增片段灰度值與內(nèi)參基因的 PCR擴增片段灰度值的比值作為其 mRNA表達水平的半定量參數(shù)。

1.3.2 免疫組化 采用免疫組化 SP法檢測胃癌組織和正常胃組織中 hMTERF3的表達。手術(shù)切除的組織經(jīng) 10%中性福爾馬林固定后，石蠟包埋，4μm厚切片，枸櫞酸熱抗原修復(fù)。一抗使用兔抗hMTERF3多克隆抗體（工作液濃度為1∶100），4℃孵育過夜。以 PBS緩沖液（0.01 mmol／L，pH 7.4）代替一抗作為陰性對照。生物素標(biāo)記的二抗 IgG 37℃孵育30 min，最后以 DAB法顯色。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判斷采用雙盲法閱片，hMTERF3陽性表達定位于細胞質(zhì)，陽性判定以染色強度及陽性細胞數(shù)綜合判定。鏡下隨機選取5個視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)細胞著色強度及陽性細胞數(shù)綜合進行。按標(biāo)準(zhǔn)細胞著色強度評分：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按顯色細胞的比例評分：無顯色細胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75% 為4分。每例積分≤2分為陰性（－），3～4分為弱陽性（＋），5～8分為中度陽性（?），9～12分及以上為強陽性（?）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用 t檢驗或 ANOVA方差分析；計數(shù)資料比較使用 χ2檢驗。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 hMTERF3 mRNA在正常胃組織和胃癌組織中的表達

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，hMTERF3mRNA在胃癌組織中的表達顯著高于正常胃組織，差異有顯著性（P＜0.05）。Quantity One v4.6.2軟件掃描產(chǎn)物灰度值，以 hMTERF3基因的 PCR擴增片段灰度值與內(nèi)參基因的 PCR擴增片段灰度值的比值作為其 mRNA表達水平的半定量參數(shù)，結(jié)果表明胃癌組織中hMTERF3 mRNA表達水平約為正常胃組織中表達水平的2.029倍（圖1）。

2．2 hMTERF3蛋白在正常胃組織和胃癌組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，hMTERF3蛋白定位表達于細胞質(zhì)，在胃癌組織中 hMTERF3蛋白表達水平明顯高于正常胃組織（圖2）。此外，hMTERF3蛋白在正常胃組織陽性率為 24.6%（15／61），胃癌組織中的陽性率為86.9%（53／61），hMTERF3蛋白在胃癌組織中的陽性率顯著高于正常胃癌組織中的表達，且差異有顯著性 （χ2＝47.976，P＝0.001，表 1）。hMTERF3蛋白的表達與患者性別及年齡無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。hMTERF3蛋白的表達與胃癌的臨床分期、病理分級、肌層轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。hMTERF3蛋白的表達量隨組織學(xué)分級增高和浸潤深度加深而增加，差異具有顯著性（P＜0.05）。hMTERF3蛋白在低分化組表達量顯著高于高、中分化組（χ2＝4.957，P＝0.026）；在胃癌 TNM分期的Ⅲ、Ⅳ期的表達量顯著高于Ⅰ、Ⅱ期（χ2＝6.715，P＝0.010）；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中表達量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例（χ2＝4.533，P＝0.033）。

圖1 半定量 RT-PCR檢測 hM TERF3 m RNA在正常胃組織和胃癌組織中的表達：A.電泳圖；B.直方圖

圖2 hMTERF3蛋白的表達，SP法：A.正常胃組織；B.胃癌組織

表1 hM TERF3蛋白在胃癌組織及正常胃組織中的表達

表2 hMTERF3蛋白在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

糖的有氧代謝減弱而無氧酵解顯著增強是腫瘤細胞能量代謝的一個共同特點，對于缺氧條件的適應(yīng)是腫瘤進一步發(fā)展非常關(guān)鍵的步驟［7］。在大多數(shù)實體性腫瘤中，這種能量代謝的異常和 mtDNA拷貝數(shù)以及氧化磷酸化相關(guān)酶活性的降低有密切的關(guān)系［8－9］。近年來國內(nèi)外學(xué)者對 m tDNA與腫瘤之間的關(guān)聯(lián)提出一些假說，已有的研究資料提示腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的mtDNA有一定的關(guān)系。mtDNA是環(huán)境致癌物作用的重要靶標(biāo)，其損傷程度和突變率顯著高于核內(nèi) DNA。

hMTERF3是一個哺乳動物線粒體基因轉(zhuǎn)錄和能量代謝的負調(diào)控因子，它可結(jié)合至 mtDNA的重鏈和輕鏈啟動子上的序列元件，抑制 mtDNA基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低線粒體呼吸鏈酶活性和氧化磷酸化產(chǎn)能［10］。在前期實驗中，我們成功在大腸桿菌中原核表達和純化hMTERF3蛋白，并制備鼠抗人多克隆抗體。采用細胞免疫熒光法證實，hMTERF3定位于人胚腎 HEK293細胞線粒體中［11］。Hyv?rinen等［12］用二維瓊脂糖凝膠電泳法對 mtDNA復(fù)制中間體的實驗發(fā)現(xiàn)，在人胚腎 HEK293細胞中過量表達 hMTERF3蛋白能顯著抑制mtDNA復(fù)制，造成細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)的下降。目前，已有文獻報道胃癌組織及胃癌細胞株中mtDNA突變率增高、mtDNA含量減少和線粒體呼吸鏈酶活性降低［13］。提示 hMTERF3作為在腫瘤細胞中參與線粒體基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄負調(diào)控的重要蛋白因子，其表達水平可能存在異常。

近年來，腫瘤分子水平的研究成為熱點，但是人們對胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制仍亟待深入理解。胃癌的癌變是一個多因素、多步驟、多階段發(fā)展過程，涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等的改變，而基因改變的形式也是多種多樣的［14］。胃癌發(fā)病隱匿，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)已經(jīng)浸潤、轉(zhuǎn)移［15］。因此，找到一種早期診斷胃癌的指標(biāo)具有重要意義。本實驗表明，hMTERF3 mRNA和蛋白質(zhì)在正常胃組織和胃癌組織中均有表達，但在胃癌組織中，hMTERF3蛋白陽性率顯著高于正常胃組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示hMTERF3可能參與胃癌的發(fā)生。在浸潤程度較深、TNM分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度較低的胃癌組織中，hMTERF3呈高表達，推測hMTERF3的過量表達與癌組織的侵襲與分化有密切的關(guān)系。同時，在已發(fā)生癌變的組織中hMTERF3可能繼續(xù)參與胃癌的演進和侵襲，由于本組樣本量有限，實驗結(jié)果仍需大樣本進一步分析證實。初步結(jié)果顯示，hMTERF3可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。闡明 hMTERF3在胃癌組織中的表達水平和分布情況，有利于從基因角度分析胃癌發(fā)生、侵襲及演進的機制，以進一步尋找胃癌基因診斷和基因治療的靶標(biāo)。

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R 735.2

：B

1001－7399（2017）01－0084－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.021

接受日期：2016－11－22

國家自然科學(xué)基金（81560458、31601155）、云南省教育廳科學(xué)研 究基 金 重點 項 目（2014Z126、2016ZDX101、2016ZDX105）、大理大學(xué)博 士科 研 啟動 基 金（BSKY2012018）、大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（CXCYX-2016-18）

1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，大理 6710002云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，大理 6710003云南省大理市第一人民醫(yī)院呼吸科，大理 671000

自加吉，男，碩士，講師。E-mail：zjjdlxyjc＠163.com 熊 偉，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。

E-mail：791372366＠qq.com