饒 鵬，劉智華，花 榮

胰腺導(dǎo)管腺癌中SFRP4的表達(dá)及其臨床意義

饒 鵬1，劉智華1，花 榮2

目的探討分泌型卷曲相關(guān)蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）在胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中的表達(dá)及其臨床意義。方法在30組配對(duì)的 PDAC腫瘤組織和癌旁正常組織中，利用 RT-PCR檢測(cè) SFRP4 mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)205例 PDAC組織芯片中 SFRP4蛋白表達(dá)水平，并分析 SFRP4的表達(dá)與PDAC臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果在 PDAC組織中，SFRP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于配對(duì)相鄰癌旁正常組織。RT-PCR檢測(cè)顯示，SFRP4 mRNA表達(dá)水平在90%（27／30）的PDAC組織中顯著增加（P＝0.007 2）。免疫組化染色結(jié)果顯示，SFRP4蛋白表達(dá)水平在56.5%（116／205）的癌組織中升高，但僅在28.8%（59／205）的癌旁組織中高表達(dá)。此外，SFRP4蛋白表達(dá)與PDAC臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析顯示 SFRP4高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)（χ2＝3.467，P＝0.024）。結(jié)論SFRP4有望成為 PDAC新的預(yù)后標(biāo)志物。

胰腺腫瘤；導(dǎo)管腺癌；分泌型卷曲相關(guān)蛋白4；預(yù)后

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）惡性程度高，預(yù)后差，據(jù)統(tǒng)計(jì)在美國(guó)的5年生存率約6%；據(jù)預(yù)測(cè)2030年P(guān)DAC將躍居常見(jiàn)癌癥相關(guān)死亡原因的第二位［1－2］。早期診斷困難和療效不佳是 PDAC預(yù)后不良的主要原因，因此需新型生物學(xué)標(biāo)志物準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。分泌型卷曲相 關(guān) 蛋 白 4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）過(guò)去常被認(rèn)為是 Wnt信號(hào)通路的拮抗劑，有腫瘤抑制作用。一般來(lái)說(shuō)，Wnt家族通過(guò)將共激活因子 β-catenin從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核來(lái)調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和身體內(nèi)代謝平衡，這是經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路或者β-catenin依賴的信號(hào)通路［3－4］。在腫瘤微環(huán)境中，SFRP家族以及 SFRP4自身?yè)碛信c Wnt配體和卷曲蛋白受體結(jié)合的能力從而防止Wnt信號(hào)激活，由此阻礙腫瘤發(fā)生、發(fā)展［5］。隨著對(duì) SFRP家族的深入分析，越來(lái)越多的證據(jù)表明SFRP4在某些腫瘤中可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展，并且失去原本的抑癌功能［6－7］。本實(shí)驗(yàn)著重探討 SFRP4 mRNA和蛋白水平在PDAC中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2002年1月～2014年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科收治的具有完整臨床資料，并經(jīng)病理證實(shí)的205例PDAC手術(shù)切除標(biāo)本，另收集30例配對(duì)的新鮮手術(shù)標(biāo)本癌旁組織制作組織芯片。所有患者術(shù)前均未行放療、化療、激素治療或其他相關(guān)抗腫瘤治療。所有患者提供書(shū)面知情同意，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。

1．2 RT-PCR檢測(cè) 腫瘤和癌旁組織中總 RNA提取使用Trizol試劑和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本 Takara公司，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Appiled Biosystem公司。

1.3 免疫組化免疫組化采用 SP法［8］，購(gòu)自北京中杉金橋公司。用已知的陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。室溫下操作：切片脫蠟、水化；0.5 mol／L EDTA（pH 8.0）隔水高壓修復(fù)；3%H2O2溶液室溫處理10 min；非免疫血清作用10 min；加一抗（1∶50，SFRP4抗體購(gòu)于 Abcam公司）37℃濕盒孵育 2 h后轉(zhuǎn)至4℃過(guò)夜；生物素標(biāo)記二抗孵育30 min；鏈霉菌抗生物素蛋白氧化酶孵育30 min；用PBS工作液洗3次 ×5 min；DAB顯色5 min，自來(lái)水終止；蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

SFRP4表達(dá)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分：0～5%為0分；6%～35%為1分；36%～70%為2分；＞70%為3分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為 0分；淡黃色為1分；黃色為2分和棕黃色為 3分。兩者結(jié)果相乘的乘積：0～1分為（－），2～3分為（＋），4～6分為（?），＞6分為（?）；＜4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。免疫組化結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0和 Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SFRP4的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析采用 χ2檢驗(yàn)；SFRP4的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系采用 Kaplan-Meier法并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SFRP4 mRNA在PDAC中的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)30組配對(duì)PDAC組織標(biāo)本和癌旁正常組織中SFRP4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與配對(duì)癌旁正常組織相比，SFRP4 mRNA表達(dá)水平在 90%（27／30）的PDAC組織中顯著增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.007 2，圖1）。此外，2個(gè)來(lái)源于Oncomine獨(dú)立數(shù)據(jù)庫(kù)均顯示相對(duì)于癌旁正常組織，PDAC組織中的SFRP4 mRNA表達(dá)水平均顯著增高。

圖1 30組配對(duì)樣本PDAC中SFRP4 m RNA的表達(dá)

2．2 SFRP4蛋白在 PDAC中的表達(dá)免疫組化SP法染色檢測(cè) SFRP4蛋白在 205例配對(duì)的PDAC組織芯片中的表達(dá)，染色結(jié)果顯示：SFRP4蛋白在56.5%（116／205）的癌組織樣本中高表達(dá)，僅在28.8%（59／205）的癌旁組織中高表達(dá)（圖2）。SFRP4蛋白在 PDAC組織和癌旁組織中蛋白表達(dá)差異有顯著性（P＜0.001）。

2．3 SFRP4蛋白表達(dá)與 PDAC臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析SFRP4蛋白表達(dá)與PDAC臨床病理特征的關(guān)系。分析結(jié)果表明，SFRP4蛋白表達(dá)與PDAC臨床病理特征無(wú)相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

表1 SFRP4蛋白表達(dá)與 PDAC臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖2 A.SFRP4蛋白在PDAC中呈強(qiáng)陽(yáng)性，SP法；B.SFRP4蛋白在癌旁組織中呈陰性，SP法

2．4 SFRP4蛋白表達(dá)與 PDAC患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析和 Log-rank檢驗(yàn)顯示 SFRP4高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)（χ2＝3.467，P＝0.024，圖3）。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還分析SFRP4在不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵襲患者中的表達(dá)與生存期的關(guān)系。分析結(jié)果顯示，SFRP4高表達(dá)的PDAC患者不良預(yù)后與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵襲相關(guān)（圖4）。此外，在單因素分析中，SFRP4蛋白表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移與患者生存期密切相關(guān)。多因素 Cox回歸分析證實(shí)，上述因素可以作為PDAC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

圖3 SFRP4的表達(dá)與PDAC患者生存期的相關(guān)性分析

圖4 SFRP4表達(dá)和生存期在PDAC中與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯相關(guān)性分析 A.臨床分期（Ⅰ-Ⅱ）；B.臨床分期（Ⅲ-Ⅳ）；C.有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；D.無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；E.有血管侵襲；F.有血管侵襲

表2 單因素、多因素分析 PDAC患者生存預(yù)后因素

3 討論

目前，關(guān)于胰腺癌早期診斷標(biāo)志物的尋找仍未取得 實(shí) 質(zhì) 性進(jìn) 展［9－11］。有些 文 獻(xiàn)報(bào) 道［12－13］SFRP家族在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑制腫瘤的作用，然而 SFRP家族成員在表達(dá)水平和生物學(xué)功能方面細(xì)微的差異還有待確定［14－15］。SFRP4作為一個(gè)獨(dú)特的、具有多功能潛力的 Wnt信號(hào)分子在各種疾病及癌癥中成為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SFRP4在 PDAC中的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行全面分析。首先檢測(cè)SFRP4在 PDAC組織中的 mRNA和蛋白表達(dá)水平，本組檢測(cè)結(jié)果和 2個(gè)獨(dú)立的來(lái)自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)均證明 SFRP4 mRNA表達(dá)水平在胰腺癌組織中高于相鄰癌旁組織。免疫組化染色顯示205例 PDAC的 SFRP4蛋白水平顯著高表達(dá)；免疫組化染色結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)一致。提示 SFRP4 在PDAC癌組織中顯著高表達(dá)，其在 PDAC中可能發(fā)揮致癌基因的功能。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析 SFRP4蛋白表達(dá)和 PDAC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。以往的研究顯示，結(jié)腸癌中 SFRP4蛋白表達(dá)下調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)［16］，本實(shí)驗(yàn)得出與之相反的結(jié)果。SFRP4蛋白表達(dá)上調(diào)與 PDAC患者不良預(yù)后相關(guān)；與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵襲無(wú)關(guān)。此外，單因素、多因素回歸分析證實(shí) SFRP4蛋白表達(dá)可以作為 PDAC患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

SFRP4蛋白在不同文獻(xiàn)報(bào)道中存在差異表達(dá)及作用，可能存在下列原因。（1）與其他SFRP家族成員相比，SFRP4表現(xiàn)出與卷曲蛋白受體的結(jié)構(gòu)最少同源有相關(guān)性［6］。除了眾所周知的富集半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domain，CRD），位于 SFRP4 C端的神經(jīng)生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域（netrin-like domain，NLD）可能也參與介導(dǎo)Wnt／β-catenin的信號(hào)通路激活［17］。（2）Suzuki等［18］通過(guò) 實(shí) 驗(yàn)發(fā) 現(xiàn) 過(guò)表 達(dá)SFRP4對(duì)細(xì)胞質(zhì)和核 β-catenin含量幾乎無(wú)影響。同時(shí)，He等［19］報(bào)道 SFRP4可能主導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)不僅通過(guò)經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路，還可能通過(guò)β-catenin不依賴的非經(jīng)典通路。

基因啟動(dòng)子甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)基因沉默機(jī)制，目前也已被確定在各種癌癥中存在于SFRP家族啟動(dòng)子區(qū)域［20－21］。有趣的是，相比于其他 SFRP成員，SFRP4往往顯示較低的啟動(dòng)子甲基化頻率［7，22］；但在胰腺癌中 SFRP4的精準(zhǔn)表達(dá)水平和明確的生物學(xué)功能仍未被證實(shí)，確切的分子機(jī)制還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中SFRP4 mRNA和蛋白在PDAC組中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與PDAC患者的不良預(yù)后相關(guān)。SFRP4表達(dá)可能作為新的PDAC患者預(yù)后標(biāo)志物，有望成為治療 PDAC的新靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significance of SFRP4 in pancreatic ductal adenocarcinoma

RAO Peng1，LIU Zhi-hua1，HUA Rong2
（1Department of Hepatobiliary Surgery，Yingtan People’s Hospital，Yingtan 335000，China；2Department of Billary-Pancreatic Surgery，Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China）

PurposeTo investigate the expression of secreted frizzled-related protein 4（SFRP4）and to evaluate its clinical significance in pancreatic ductal adenocarcinoma（PDAC）.M ethodsRT-PCR was performed to analyze SFRP4 mRNA expression level in 30 paired PDAC lesion and matched adjacent non-tumor tissue.Immunohistochemistry staining detection of 205 matched cases tissue microarray was conducted to explore SFRP4 protein expression pattern.The correlation between SFRP4 and clinical characteristics was also analyzed，including overall survival.ResultsSFRP4 expression pattern both at mRNA and protein level in PDAC lesion was higher than that in matched adjacent non-tumor tissue.AtmRNA level，to found that expression of SFRP4 was elevated in 90% （27／30）of PDAC tissues（P＝0.007 2）.To found that high expression of SFRP4 was detected in 56.5% （116／205）of PDAC tissue，while only 28.8% （59／205）in the adjacent non-tumor tissue. Moreover，no significant association was observed between SFRP4 expression and clinical characteristics.Kaplan-Meier survival analysis showed high level of SFRP4 expression was correlated with poor overall survival（χ2＝3.467，P＝0.024）.ConclusionSFRP4 can be a novel prognostic biomarker in PDAC.

pancreatic neoplasm；dutcal adenocarcinoma；secreted frizzled-related protein 4；prognosis

R 735.9

：A

1001－7399（2017）01－0073－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.018

接受日期：2016－11－28

1江西省鷹潭市人民醫(yī)院普外科 3350002上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，上海200127

饒 鵬，男，碩士研究生。E-mail：16274196＠qq.com 花 榮，男，博士，副主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：

18817821432＠126.com