錢(qián) 萍，高寶蓮

子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Lgr5的表達(dá)及其臨床意義

錢(qián) 萍，高寶蓮

目的探討富含酪氨酸重復(fù)序列 G蛋白偶聯(lián)受體（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化 EnVision兩步法檢測(cè)83例CSCC組織、56例癌旁正常組織及32例子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織中 Lgr5蛋白表達(dá)，并應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè)13例 CSCC及癌旁組織中 Lgr5 mRNA的表達(dá)，分析 Lgr5表達(dá)與CSCC臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果Lgr5在CSCC中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）及CIN（P＜0.05）。Lgr5表達(dá)與腫瘤分化程度（P＜0.01）和浸潤(rùn)深度（P＜0.05）有關(guān)，與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，Lgr5高表達(dá)者 5年生存率顯著低于 Lgr5低表達(dá)者（P＜0.01）。多因素 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，Lgr5的表達(dá)（P＝0.027）可以作為判斷CSCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論Lgr5的表達(dá)與腫瘤分化程度和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，可能參與CSCC的發(fā)生、發(fā)展，可作為 CSCC患者預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)。

子宮頸腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；Lgr5；臨床病理學(xué)

Lgr5是G蛋白耦聯(lián)受體的一種，廣泛分布于人體組織中，在胃腸道、乳腺、大腦、脊髓、毛囊及生殖系統(tǒng)等均有表達(dá)［1－2］。研究表明，Lgr5是腸道干細(xì)胞［3］和毛囊干細(xì)胞［4］的標(biāo)志物，并參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5－6］。目前，有關(guān) Lgr5在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）中的表達(dá)及臨床意義鮮有報(bào)道。本文采用免疫組化 En-Vision兩步法和 RT-PCR檢測(cè) Lgr5在 CSCC及癌旁正常組織中的表達(dá)，分析 Lgr5表達(dá)與 CSCC臨床病理特征的關(guān)系，為臨床治療及預(yù)后判斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集我院2005～2010年手術(shù)切除CSCC組織83例及癌旁正常組織56例，并收集同時(shí)期子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）標(biāo)本32例，其中低級(jí)別CIN 19例，高級(jí)別CIN 13例。CSCC患者年齡 26～78歲，平均 48.6歲，＜50歲者51例，≥50歲者32例。腫瘤直徑＜3 cm者49例，≥3 cm者34例；根據(jù)2009年國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱa期46例，Ⅱb～Ⅳ期37例；分化程度：高分化19例，中分化 31例，低分化33例；83例均行盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51例；浸潤(rùn)程度以腫瘤浸潤(rùn)子宮頸肌層≤1／2為淺浸潤(rùn)，＞1／2為深浸潤(rùn)，其中淺浸潤(rùn)38例，深浸潤(rùn)45例。所有病例術(shù)前均未行放、化療及免疫治療，具有完整的臨床病理及隨訪資料。另選取 CSCC及新鮮正常子宮頸組織各13例，用于RT-PCR檢測(cè)。兔抗人Lgr5多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；RT-PCR實(shí)驗(yàn)所需的 RNAiso Plus、RT及 PCR試劑盒均購(gòu)自 Takara公司，引物序列由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色采用EnVision兩步法（DAKO公司），Lgr5蛋白工作液濃度為1∶100，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用公司提供的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。依據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比判斷結(jié)果［7］。染色強(qiáng)度按著色細(xì)胞判斷：無(wú)陽(yáng)性染色、淺黃色、棕黃色、黃褐色依次計(jì)為0、1、2、3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜5% 為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分；將上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≥6分為陽(yáng)性。

1.2.2 RT-PCR 用 Trizol RNA提取試劑盒提取組織 RNA并檢測(cè)其濃度，OD260／OD280在 1.8～2.0之間。在37℃孵育15 min，85℃孵育5 s條件下將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成 RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，60℃延伸 30 s，合計(jì) 40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用相對(duì)定量用2－ΔΔCt法計(jì)算，Lgr5引物上游序列：5′-GATGTTGCTCAGGGTGGACT-3′，下游序列：5′-GGGAGCAGCTGACTGATGTT-3′；內(nèi)參 actin引物上游序列：5′-GCACCCAGCACAATGAAGA-3′，下 游 序 列：5′-CGATCCACACGGAGTACTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)數(shù)資料比較均采用 χ2檢驗(yàn)，配對(duì)資料采用 t檢驗(yàn)，采用 Kaplan-Meier、Log-rank法分別繪制和比較生存曲線，采用 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Lgr5在不同子宮頸組織中的表達(dá)Lgr5蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Lgr5在65例CSCC組織中呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為78.3%（65／83）；在大部分癌旁組織中呈陰性，僅在8例癌旁正常組織中呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性率為14.3%（8／56），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝54.97，P＜0.01，表1）。Lgr5在低級(jí)別及高級(jí)別 CIN中的陽(yáng)性率分別為 36.8% （7／19）、46.2%（6／13），均顯著低于 CSCC組（P均＜0.05，表1，圖1）。

表1 Lgr5在不同子宮頸組織中的表達(dá)

2．2 RT-PCR檢測(cè)采用相對(duì)定量 2－ΔΔCt法計(jì)算Lgr5 mRNA在 CSCC及癌旁正常組織中的表達(dá)，CSCC中Lgr5 mRNA的表達(dá)水平為0.91±0.05，癌旁正常組織中Lgr5 mRNA的表達(dá)水平為0.33± 0.04，CSCC組織中 Lgr5基因表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（t＝9.242，P＜0.01，圖2）。

2．3 Lgr5表達(dá)與 CSCC臨床病理特征的關(guān)系Lgr5表達(dá)與腫瘤分化程度（χ2＝7.88，P＜0.01）、浸潤(rùn)深度（χ2＝6.47，P＜0.05）相關(guān)，與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P均＞0.05，表2）。

圖1 A.CSCC組織中 Lgr5呈強(qiáng)陽(yáng)性，EnVision兩步法；B.癌旁子宮頸組織中 Lgr5呈陰性，EnVision兩步法；C.低級(jí)別CIN累及腺體組織中 Lgr5呈弱陽(yáng)性，EnVision兩步法；D.高級(jí)別CIN累及腺體組織中Lgr5呈陽(yáng)性，EnVision兩步法

圖2 RT-PCR檢測(cè)Lgr5 m RNA的表達(dá)

2．4 Lgr5表達(dá)與 CSCC患者預(yù)后的關(guān)系Lgr5陽(yáng)性組患者的中位生存時(shí)間為27個(gè)月，顯著低于陰性組的39個(gè)月（P＝0.036，圖3）。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，F(xiàn)IGO分期（P＝0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.012）和 Lgr5的表達(dá)（P＝0.027）可以作為判斷 CSCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

近年來(lái)子宮頸癌發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì)，其發(fā)生是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，與細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)失衡、信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)紊亂、癌基因和抑癌基因的表達(dá)異常等均存在密切的關(guān)系。研究表明：Wnt信號(hào)通路的異?；罨诩?xì)胞癌變、腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲過(guò)程中具有重要作用，已發(fā)現(xiàn)在人類多種惡性腫瘤中存在異常 Wnt蛋白信號(hào)［8］，Lgr5作為Wnt信號(hào)通路中 β-連環(huán)蛋白 TCF-4的靶基因，其表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，可能在細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［9］。

表2 Lgr5表達(dá)與 CSCC臨床病理特征的關(guān)系

圖3 Lgr5陽(yáng)性組和陰性組 CSCC患者的生存曲線

Lgr5在人體小腸底部隱窩基底柱狀細(xì)胞、結(jié)腸隱窩、胃腺體底部及毛囊中均有不同程度的表達(dá)，可作為多種人體組織干細(xì)胞的標(biāo)志物。近年文獻(xiàn)報(bào)道，Lgr5基因可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Becker等［10］采用免疫組化法觀察胃腸道正常組織和癌前病變組織中Lgr5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌前病變組織中 Lgr5的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且在正常胃腸組織中 Lgr5的表達(dá)局限于隱窩基底部，而在癌前病變組織中 Lgr5的表達(dá)并不局限于隱窩基底部，提示 Lgr5離開(kāi)隱窩基底部是腫瘤形成和惡化的早期事件。在肝細(xì)胞癌中，Yamamoto等［11］發(fā)現(xiàn) Lgr5 mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肝組織；將突變的β-連環(huán)蛋白導(dǎo)入培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中，會(huì)引起小鼠 Lgr5的上調(diào)。由此推測(cè)，Lgr5參與肝癌的生成，并且很可能是被 Wnt信號(hào)途徑激活的目標(biāo)基因。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道在基底細(xì)胞癌［12］、卵巢癌［13］及食管癌［9］中 Lgr5均過(guò)表達(dá)，揭示Lgr5與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision兩步法及 RTPCR檢測(cè)Lgr5在 CSCC和癌旁組織及CIN中的表達(dá)，結(jié)果顯示：Lgr5蛋白陽(yáng)性部位主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Lgr5在腫瘤組織中陽(yáng)性率為78.3%，在癌旁正常組織中陽(yáng)性率為 14.3%，Lgr5在 CSCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織及CIN；RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，CSCC組織中 Lgr5基因表達(dá)也明顯高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析Lgr5蛋白表達(dá)與CSCC臨床病理特征的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，Lgr5表達(dá)與 CSCC分化程度及浸潤(rùn)深度有關(guān)；與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，腫瘤分化程度越低，浸潤(rùn)深度越深，Lgr5的陽(yáng)性強(qiáng)度越高。Sun等［14］對(duì) 94 例 CSCC的分析中發(fā)現(xiàn)，Lgr5在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且與腫瘤大小和有無(wú)宮旁浸潤(rùn)密切相關(guān)。由此推測(cè)，Lgr5可能參與 CSCC的發(fā)生，并對(duì)病變的發(fā)展有一定的促進(jìn)作用。

既往研究證實(shí)，在多種腫瘤如食管腺癌［9］、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤［15］及軟組織肉瘤［16］中，Lgr5表達(dá)增加與腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Kaplan-Meier生存分析同樣發(fā)現(xiàn)，Lgr5高表達(dá)患者5年生存率顯著低于 Lgr5低表達(dá)患者；并且多因素Cox回歸分析證實(shí)，Lgr5的高表達(dá)率與 CSCC不良預(yù)后相關(guān)。提示 Lgr5可作為判斷 CSCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，進(jìn)一步分析其在促進(jìn)腫瘤發(fā)展中的分子作用機(jī)制，有望成為 CSCC治療的新靶點(diǎn)。

Lgr5在 CSCC組織中的過(guò)表達(dá)揭示了其在CSCC發(fā)生、發(fā)展中的促進(jìn)作用，但有關(guān) Lgr5在不同信號(hào)途徑中發(fā)揮作用的機(jī)制及 Lgr5細(xì)胞能否代表CSCC腫瘤干細(xì)胞等問(wèn)題，還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

［1］ McDonald T，Wang R，BaileyW，etal.Identification and cloning of an orphan G protein-coupled receptor of the glycoprotein hor-mone receptor subfamily［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，247（2）：266－270.

［2］ Hsu S Y，Liang SG，Hsueh A J，et al.Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G protein-coupled，seven-transmembrane region［J］.Mol Endocrinol，1998，12（12）：1830－1845.

［3］ Barker N，van Es JH，Kuipers J，et al.Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5［J］.Nature，2007，449（7165）：1003－1007.

［4］ Jaks V，Barker N，Kasper M，etal.Lgr5marks cycling，yet longlived，hair follicle stem cells［J］.Nat Gene，2008，40（11）：1291－1299.

［5］ 付 焱，劉志蘇，江從慶，等.腸道干細(xì)胞標(biāo)記基因 Lgr5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28 （7）：1142－1144.

［6］ Becker L，Huang Q，Mashimo H.Lgr5，an intestinal stem cell marker，is abnormally expressed in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma［J］.Dis Esophagus，2010，23（2）：168 －174.

［7］ 江曉紅，張燕萍.Lgr5在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（3）：323 －325.

［8］ Lustig B，Behrens J.The Wnt signaling pathway and its role in tumor development［J］.JCancer Res Clin Oncol，2003，129（4）：199－221.

［9］ Barker N，van Es JH，Jaks V，etal.Very long-term self-renewal of small intestine，colon，and hair follicles from cycling Lgr5＋ve stem cells［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2008，73：351 －356.

［10］Becker L，Huang Q，Mashimo H.Immunostaining of Lgr5，an intestinal stem cellmarker，in normal and premalignant human gastrointestinal tissue［J］.Scientific World J，2008，8（7）：1168－1176.

［11］Yamamoto Y，Sakamoto M，F(xiàn)ujii G，et al.Overexpression of orphan G-protein-coupled receptor，Gpr49，in human hepatocellular carcinomas with beta-cateninmutations［J］.Hepatology，2003，37 （3）：528－533.

［12］Tanese K，F(xiàn)ukuma M，Yamada T，et al.G-protein-coupled receptor GPR49 is up-regulated in basal cell carcinoma and promotes cell proliferation and tumor formation［J］.Am JPathol，2008，173 （3）：835－843.

［13］McClanahan T，Koseoglu S，Smith K，etal.Identification of overexpression of orphan G protein-coupled receptor GPR49 in human colon and ovarian primary tumors［J］.Cancer Biol Ther，2006，5 （4）：419－426.

［14］Sun B，Ye X，Li Y，etal.Lgr5 is a potential prognosticmarker in patients with cervical carcinoma［J］.Int JClin Exp Pathol，2015，8（2）：1783－1789.

［15］Nakata S，Campos B，Bageritz J，etal.LGR5 is amarker of poor prognosis in glioblastoma and is required for survival of brain cancer stem-like cells［J］.Brain Pathol，2013，23（1）：60－72.

［16］Rot S，Taubert H，Bache M，et al.A novel splice variant of the stem cell marker LGR5／GPR49 is correlated with the risk of tumor-related death in soft-tissue sarcoma patients［J］.BMC Cancer，2011，11（1）：429.

Expression of Lgr5 in cervical squamous cell carcinoma and its significance

QIAN Ping，GAO Bao-lian
（Department of Pathology，Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiaxing City，Jiaxing 314001，China）

PurposeTo investigate the expression of Lgr5 in cervical squamous cell carcinoma（CSCC）and its significance.MethodsLgr5 protein expression was evaluated by immunohistochemistry of EnVision two-step in 83 paraffin-embedded CSCC specimens，56 normal cervical tissues specimens and 32 cervical intraepithelial neoplasia（CIN）specimens.The expression of Lgr5 mRNA was evaluated by RT-PCR in 13 pairs of surgically removed CSCC and adjacent normal cervical tissues. The correlation between Lgr5 expression and clinicopathological features were statistically analyzed.ResultsThe positive proportion of Lgr5 protein in CSCC tissues was significantly higher than those in adjacent normal cervix（P＜0.01）and CIN（P＜0.05）.The expression of Lgr5 in CSCC tissues was associated with grade of tumors（P＜0.01）and depth of invasion（P＜0.05），but not associated with age，tumor size，clinical stage and lymph nodemetastasis（P＞0.05）.Kaplan-Meier analysis showed that the 5-year survival rate of patients with Lgr5 overexpression was significantly lower than thatof patientswith lower expression（P＜0.01）.ConclusionThe expression of Lgr5 in CSCC tissuesmay associated with grade of tumors and depth of invasion and may be involved in initiation and development of CSCC，and itmay be a new assistant marker for prognosis of CSCC.

cervix neoplasm；squamous cell carcinoma；Lgr5；clinical pathology

R 737.33

A

1001－7399（2017）01－0042－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.011

接受日期：2016－11－21

浙江省嘉興市中醫(yī)醫(yī)院病理科 314001

作者單位：錢(qián) 萍，女，副主任醫(yī)師。E-mail：3539405730＠qq.com