劉玉艷，沈久洋，朱安超，秦丹婷，黃 英

p16／Ki-67細胞學雙染在子宮頸癌篩查中應用價值

劉玉艷，沈久洋，朱安超，秦丹婷，黃 英

目的探討 p16／Ki-67細胞學雙染檢測在子宮頸癌篩查中的應用價值。方法選取液基細胞學（thinprep cytologic test，TCT）檢查結(jié)果為意義不明的非典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）和低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的患者295例，行p16／Ki-67細胞學雙染檢測、陰道鏡檢查、定位活檢病理檢查，比較 p16／Ki-67細胞學雙染與病理活檢的符合率，并檢測其在兩組病例中的敏感性和特異性。結(jié)果在ASC-US和LSIL兩組中，p16／Ki-67細胞學雙染的陽性率分別為 37.42%和 36.36%；病理活檢診斷子宮頸上皮內(nèi)病變 2／3（cervical intraepithelial neoplasia 2／3，CIN2／3）陽性率分別為25.77%和 25.76%，兩者具有較高的符合率。ASC-US組中，p16／Ki-67診斷CIN2／3病例的敏感性83.33%，特異性78.51%；LSIL組中，p16／Ki-67診斷 CIN2／3病例的敏感性85.30%，特異性80.61%。結(jié)論 p16／Ki-67細胞學雙染可提高TCT的敏感性和人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測的特異性；p16／Ki-67細胞學雙染檢測有效分流 TCT中宮頸高級別病變，提高子宮頸癌篩查的準確率。

p16／Ki-67；細胞學雙染；液基細胞檢測

子宮頸癌是威脅亞洲婦女健康的第二大惡性腫瘤［1］，近年在我國發(fā)病率逐年上升且有年輕化的趨勢。子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有較長的癌前病變階段，進行早期篩查對防治子宮頸癌至關(guān)重要。細胞學檢查和人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測是子宮頸癌的主要篩查方法。目前，我國子宮頸癌篩查面臨細胞學檢測敏感度較低（50%～70%）、觀察者間重復性差、質(zhì)量控制不足等問題。HPV檢測敏感性較高，但是特異性較差，不能識別是否為 HPV持續(xù)性感染亦或是否癌變，所以作為分流手段尚嫌不足，進一步尋找新的分流標志物便成為當務之急。p16／Ki-67細胞學雙重染色檢測是新近發(fā)展的子宮頸癌篩查技術(shù)，其高靈敏度和特異性極大改善了子宮頸癌篩查分流管理。本文對295例液基細胞學（thinprep cytologic test，TCT）檢測異常的患者進行p16／Ki-67細胞學雙重染色檢測并接受陰道鏡下子宮頸多點活體組織檢查，探討p16／Ki-67細胞學雙重染色檢測的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集 2014年12月～2016年 7月哈爾濱市第一醫(yī)院婦科行 TCT檢查的患者 13 518例，其中745例結(jié)果異常，剔除臨床資料不完整、剩余標本不符合作進一步檢查要求及 TCT直接診斷高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）以上病例，其中篩查 163例意義不明的非典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）、132例低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）進行p16／Ki-67細胞學雙重染色檢測，以子宮頸活體組織病理檢查結(jié)果為金標準。患者年齡21～73歲，有 1年以上性生活史，2周內(nèi)未行宮頸涂片檢查，無骨盆區(qū)域放射治療史或化療史，非月經(jīng)期、孕期、產(chǎn)后半年之內(nèi)，無急性婦科炎癥或陰道活動性出血，無全子宮切除，無光過敏疾病史或正在接受光動力療法或曾經(jīng)接觸過光敏劑者。

1.2 方法

1.2.1 p16／Ki-67細胞學雙染檢測 利用 TCT剩余細胞學標本進行 p16／Ki-67免疫細胞化學染色。儀器采用羅氏全自動免疫組化分析儀。泰普液基制片后，95%乙醇固定，自然晾干備用。一抗孵育，HQ半抗原結(jié)合，過氧化物酶多聚體結(jié)合，NP linker，AP多聚體，蘇木精復染、返藍；染色結(jié)束，取出切片，洗潔精清洗后自然晾干，封固、鏡下觀察。

1.2.2 陰道鏡下活檢術(shù) 采用陰道鏡進行活檢，由高年資主治醫(yī)師經(jīng)系統(tǒng)培訓合格后操作。依次以3%醋酸和1%復方碘溶液涂抹子宮頸，于可疑部位進行病理檢查。對陰道鏡圖像不滿意者，常規(guī)搔刮宮頸管。標本均用 10%中性福爾馬林固定并送至病理科檢查。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 p16／Ki-67細胞學雙染結(jié)果判讀 胞質(zhì)陽性呈棕色，細胞核陽性呈紅色，同一個細胞內(nèi)同時有棕色的胞質(zhì)（p16）和紅色的細胞核（Ki-67）著色則為陽性細胞，任何水平、任何強弱的表達均可；其判讀標準獨立于形態(tài)學；單個細胞的雙染即為陽性結(jié)果 ［2］。

1.3.2 陰道鏡活檢結(jié)果判讀 活檢診斷子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）中CIN2、CIN3記為 CIN2／3，診斷子宮頸炎癥及 CIN1者記為非 CIN2／3。最終病理診斷結(jié)果由兩位高年資醫(yī)師確定。

1.4 統(tǒng)計學方法以陰道鏡病理檢查結(jié)果為診斷金標準，將p16／Ki-67結(jié)果與其比較分析，評價p16／Ki-67對子宮頸病變的診斷準確率、敏感性和特異性。敏感性＝真陽性／（真陽性 ＋假陰性）×100%，特異性＝真陰性／（真陰性＋假陽性）×100%。

2 結(jié)果

2．1 p16／Ki-67細胞學雙染結(jié)果病變細胞輕度增大，核質(zhì)比輕度增高，同一個細胞內(nèi)胞質(zhì)棕色（p16）、胞核紅色（Ki-67）為陽性細胞（圖1、2）。

圖1 ASC-US組中p16／Ki-67細胞學雙染陽性，EnVison兩步法

圖2 LSIL組中p16／Ki-67細胞學雙染陽性，EnVison兩步法

2．2 p16／Ki-67細胞學雙染與病理學檢測結(jié)果的符合率比較TCT異常者 295例，其中ASC-US者163例，p16／Ki-67陽性者 61例（37.42%），活檢CIN2／3者42例（25.77%）；LSIL者132例，p16／Ki-67陽性者 48例（36.36%），活檢CIN2／3者 34例（25.76%）（表1）。ASC-US組中 p16／Ki-67診斷CIN2／3者的敏感性 83.33%、特異性78.51%（表2）；LSIL組中p16／Ki-67診斷 CIN2／3者的敏感性85.30%、特異性80.61%（表3）。

表1 p16／Ki-67細胞學雙染與病理學活檢結(jié)果比較

表2 ASC-US組p16／Ki-67雙染分流CIN2／3病例的敏感性與特異性

表3 LSIL組p16／Ki-67雙染分流CIN2／3病例的敏感性與特異性

3 討論

自 Zur Hausen教授在1977年發(fā)現(xiàn) HPV感染是子宮頸癌發(fā)生的一個重要原因，相關(guān)研究不斷深入，99.7%子宮頸癌患者存在HPV感染，目前已經(jīng)證實HPV感染是 CIN和子宮頸癌的主要病因。根據(jù)HPV致子宮頸癌的風險性不同，分為高危型 HPV和低危型 HPV兩大類［3］，高危型HPV，其基因整合到宿主細胞染色體中稱為整合形式致病，由底層向中表層侵犯鱗狀上皮細胞，通過 HPV E6與 p53蛋白、HPV E7蛋白與 pRb相互作用，干擾宿主細胞的生長引起癌變。相關(guān)文獻報道，p16、Ki-67與 HPV感染存在著極為密切的聯(lián)系。p16是 Rb信號通路的重要成員，并接受 Rb的負反饋抑制，HPV E7蛋白將 Rb滅活后會繼發(fā) p16的表達水平增高［4］；而Ki-67可以準確反映細胞的增殖活性。在同一細胞中同時檢測 p16和 Ki-67，可作為細胞周期失調(diào)的標志物，幫助檢出真正的病變細胞，且不依賴于形態(tài)學檢查結(jié)果。當 p16／Ki-67檢測陽性時，提示高級別病變，為區(qū)分潛在高級別病變患者提供客觀檢測指標。p16／Ki-67免疫組化雙染技術(shù)是基于細胞學基礎(chǔ)上的免疫組化技術(shù)，即在宮頸細胞涂片上運用羅氏全自動免疫組化分析儀進行免疫組化雙染標記，同時檢測生物標志物p16和 Ki-67兩種抗體的表達情況，可以確認或排除 HSIL。

目前，高敏感度和高特異度的 p16／Ki-67免疫組化雙染技術(shù)已用于 ASC-US（尤其年輕女性）、LSIL、細胞學檢查陰性而高危型HPV陽性、以 HPV初篩時的高危型 HPV陽性者進行分流，可有效降低HSIL的漏診率，也減少和避免不必要的陰道鏡檢查。Wentzensen等［2］對 p16／Ki-67免疫組化雙染技術(shù)預測子宮頸癌前病變的能力進行評估，收集 625例轉(zhuǎn)行陰道鏡檢查的婦女，結(jié)果顯示在正常子宮頸、CIN1、CIN2、CIN3組中，p16／Ki-67的陽性率分別為26.8%、46.5%、82.8%、92.8%，陽性率隨病理檢查病變級別的升高而升高；檢測 CIN3及以上病變的敏感度和特異度分別為 93.2%、46.1%，在 30歲及以上婦女中的敏感度和特異度上升至97.2%、60.0%。本實驗通過篩選 TCT異常病例，進行 p16／Ki-67細胞學雙重染色，在 ASC-US和 LSIL病例中p16／Ki-67的陽性率分別為37.42%和36.36%；在病理活檢中，ASC-US和 LSIL中診斷CIN2／3的百分率分別為25.77%和25.76%，提示 p16／Ki-67細胞學雙染對于分流 CIN2／3與病理活檢具有較高符合率。

Roelens等［5］對 p16INK4a免 疫 細 胞 化 學 染色與HC-Ⅱ?qū)SC-US和LSIL的分流能力進行分析，結(jié)果顯示p16INK4a預測 ASC-US和 LSIL進展為 CIN2、CIN3的敏感度分別為 83.2%、83.8%，特異度分別為71.0%、65.7%，與HC-Ⅱ相比，兩者的敏感度相近，但前者的特異度較高。Schmidt等［6］指出，細胞學初篩ASC-US，p16／Ki-67分流CIN2／3病例敏感性和特異性分別為 92.2%和 80.6%。對于細胞學LSIL，p16／Ki-67雙染分流 CIN2／3敏感性和特異性分別為94.2%和68%。本組結(jié)果顯示，對于 ASCUS病例 p16／Ki-67雙染的敏感性和特異性分別為83.33%和78.51%；LSIL組中，p16／Ki-67雙染的敏感性和特異性分別為 85.30%和80.61%。與文獻報道相比，敏感性略低，可能與主觀判斷和病例的多少有關(guān)；但是其特異性明顯增高，此方法可以彌補高危型 HPV檢測特異性低的不足。Possati-Resende等［7］對比高危型 HPV檢測和 p16／Ki-67雙染對于201例 TCT異常病例預測 CIN的準確率，結(jié)果顯示對于 ＞30歲女性 ASC-US患者，應用高危型 HPV檢測和 p16／Ki-67雙染預示子宮頸高級別病變具有相似的意義和價值，而對于 ＜30歲的 LSIL群體，p16／Ki-67雙染具有較高的準確率，尤其對于 CIN3的病例。但也有研究者認為，與高危型 HPV檢測相比，p16／Ki-67雙染敏感性較低，不能確保一些 HPV持續(xù)感染者不被漏診［8］。

生物學標志物是監(jiān)測惡性腫瘤進展最準確的指標，運用 p16／Ki-67雙染檢測有利于更準確地發(fā)現(xiàn)高級別子宮頸病變，但目前文獻報道存在樣本量不足和研究范圍小等問題，需要更多的臨床試驗進一步驗證。在實際工作中，應結(jié)合具體情況，選擇最適合的篩查和分流技術(shù)，從而降低子宮頸癌的發(fā)生率和病死率。

［1］ Lertkhachonsuk A A，Yip C H，Khuhaprema T，et al.Cancer prevention in Asian：resource-stratified guidelines from the Asian Oncology Summit2013［J］.Lancet Oncol，2013，14（12）：497－507.

［2］ Wentzensen N，Schwartz L，Zuna R E，et al.Performance of p16／Ki-67 immunostaining to detect cervical cancer precursors in a colposcopy referral population［J］.Clin Cancer Res，2012，18 （15）：4154－4162.

［3］ 溫旺榮，周華友.臨床分子診斷學［M］.廣州：廣東科技出版社，2014：154－158.

［4］ 徐耀先，陳德基，解夢霞，等.HPV-16 E7、Rb、p16蛋白在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及其意義［J］.癌癥，2000，19（7）：631－634.

［5］ Roelens J，Reuschenbach M，von Knebel Doeberitz M，et al. p16INK4a immunocytochemistry versus human papillomavirus testing for triage ofwomen with minor cytologic abnormalities：a systematic review and meta-analysis［J］.Cancer Cytopathol，2012，120（5）：294－307.

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Diagnostic value of p16／K i-67 dual stain cytology for detection of cervical precancerous lesions

LIU Yu-yan，SHEN Jiu-yang，ZHU An-chao，QIN Dan-ting，HUANG Ying
（Department of Pathology，the First Hospital of Harbin，Harbin 150010，China）

PurposeTo investigate the diagnostic value of p16／Ki-67 dual stain cytology for detection of cervical precancerous lesions as a novel option for cervical lesions screening.M ethodsA total of 295 cases diagnosed as atypical squamous cells of undetermined significance（ASC-US）and low-grade squamous intraepithelial lesion（LSIL）from thinprep cytologic test（TCT）were selected.Double staining of p16／Ki-67 cytology，vaginal biopsy，biopsy and pathological examination were applicated，p16／Ki-67 dual stain cytology was compared with that of biopsy and pathological examination.At the same time，The sensitivity and specificity of p16／Ki-67 dual stain cytology between ASC-USand LSIL was analyzed.Results The positive rate of p16／Ki-67 dual stain cytology were 37.42% and 36.36%in ASC-USand LSIL，respectively.The positive rate of cervical intraepithelial neoplasia 2／3（CIN2／3）were 25.77% and 25.76%.The sensitivity and specificity of the p16／Ki-67 test for detecting CIN2／3 was83.33%and 78.51%.The sensitivity and the specificity of the p16／Ki-67 test for detecting CIN2／3 was 85.30%and 80.61%in LSIL group.Conclusionp16／Ki-67 double stain cytology detection can improve the sensitivity of CIN2／3 and the specificity of human papilloma virus（HPV）.p16／Ki-67 double stain detection can effectively triage the high grade cervical lesions in TCT and improve the accuracy of cervical cancer screening.

p16／Ki-67；cytology dual stain；thinprep cytologic test

R 737.9

：A

1001－7399（2017）01－0038－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.010

接受日期：2016－11－15

哈爾濱市第一醫(yī)院病理科 150010

劉玉艷，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：liuyuyan1983＠126. com

黃 英，女，碩士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：hying0451 ＠163.com