朱皓皞，任光玉，吳 琴，熊敦勇，袁 婷，余晚霞

子宮頸癌中高危型HPV感染與c-jun和c-fos蛋白表達的關(guān)系

朱皓皞，任光玉，吳 琴，熊敦勇，袁 婷，余晚霞

目的探討子宮頸癌中高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染與 c-jun和 c-fos蛋白表達的關(guān)系及臨床意義。方法采用 Cervista技術(shù)對70例子宮頸鱗狀細胞癌（cervical squmaous cell carcinoma，CSCC）、60例子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及20例慢性子宮頸炎行 HR-HPV檢測，同時應(yīng)用免疫組化 SP法檢測AP-1通路重要組份c-jun和c-fos蛋白的表達，分析HR-HPV感染與c-jun和c-fos蛋白表達的相關(guān)性及與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果70例CSCC中69例 HR-HPV呈陽性，陽性率98.6%（69／70），其中 A9組陽性占比最高，達85.5%（59／69）。70例CSCC中c-jun和c-fos的陽性率分別為80%（56／70）、85.7%（60／70），30例 CIN2＋CIN3中的陽性率均為70%（21／30），30 例CIN1中的陽性率分別為20%（6／30）、23.3%（7／30），20例慢性子宮頸炎中的陽性率均為0。CSCC組與 CIN組及慢性子宮頸炎組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。c-jun、c-fos陽性率在CSCC的臨床分期、組織學分級等分組中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CSCC中HR-HPV陽性與c-jun、c-fos的表達均呈正相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論 CSCC中HR-HPV感染具有顯著的亞型特點，且與c-jun和c-fos表達呈正相關(guān)，提示HR-HPV感染后AP-1通路活化可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

子宮頸腫瘤；人乳頭狀瘤病毒；c-jun；c-fos；病理學

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性身體健康［1］?，F(xiàn)已證實其發(fā)生與高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染密切相關(guān)，HR-HPV持續(xù)感染是子宮頸癌的發(fā)病誘因，其是子宮頸癌發(fā)生的必要生物學條件［2］。有文獻報道并非所有感染 HPV病毒的個體均進展為癌，因此 HPV感染和子宮頸癌發(fā)生的內(nèi)在機制尚不明確。本文應(yīng)用新型 Cervista技術(shù)和免疫組化 SP法檢測70例子宮頸鱗狀細胞癌（cervical squmaous cell carcinoma，CSCC）患者的子宮頸分泌物 HR-HPV感染情況及術(shù)后腫瘤組織中 AP-1信號通路中的重要分子 c-jun和 c-fos的表達，并結(jié)合臨床病理資料分析HR-HPV感染情況與c-jun和 c-fos蛋白表達的相關(guān)性，探討 HR-HPV感染與AP-1信號通路活化是否參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年3月～2016年2月解放軍第九四醫(yī)院病理科確診的 70例CSCC患者子宮頸分泌物、手術(shù)標本蠟塊，根據(jù)組織學分化程度分為3級：其中 1級高分化癌 25例，2級中分化癌 35例，3級低分化癌10例?；颊吣挲g 32～72歲，平均48.3歲。按FIGO（2009）臨床分期標準：Ⅰ＋Ⅱ期者30例，Ⅲ＋Ⅳ期者 40例；伴盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 43例；另選 30例低度鱗狀子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）即 CIN1級，30例高度鱗狀上皮內(nèi)病變即CIN2 ＋CIN3級，20例慢性子宮頸炎作為對照組。所有患者術(shù)前均未行放、化療或激素治療，均有完整的臨床及隨訪資料。所有標本均采用 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。HE石蠟切片由兩名副高級以上病理醫(yī)師復(fù)閱診斷。

1．2 HR-HPV檢測采用美國豪洛杰（Hologic）公司的新型 Cervista技術(shù)，按構(gòu)型采用 3組寡核苷酸混合物分別行14種HR-HPV檢測，其中A5／6組檢測51、56、66型，A7組檢測18、39、45、59、68型，A9組檢測16、31、33、35、52、58型。DNA樣本提取及檢測參照試劑盒說明書進行操作，所有樣本均設(shè)陰、陽性對照，任意一組或幾組陽性者判讀為 HR-HPV陽性。

1.3 免疫組化鼠抗人c-jun和 c-fos單克隆抗體和二抗試劑盒均為即用型，購自福州邁新公司?？乖迯?fù)采用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓修復(fù)。免疫組化染色采用SP法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，以 PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性結(jié)果做陽性對照。結(jié)果判斷：c-jun和 c-fos蛋白免疫組化結(jié)果以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。由兩名副高級以上病理醫(yī)師對切片進行雙盲法閱片，每張切片隨機選取 10個高倍視野（×400），根據(jù)染色細胞百分率和染色程度進行綜合評分。陽性細胞所占百分比分為5級：無陽性著色細胞為0分，陽性著色細胞1%～25%為1分，陽性著色細胞26%～50%為2分，陽性著色細胞51%～75%為3分，陽性著色細胞 76%～100%為4分；根據(jù)細胞染色強度分為4級：無陽性著色為 0分，淺黃色為 1分，棕黃色為2分，棕褐色為 3分。陽性細胞百分比和染色強度乘積為免疫反應(yīng)得分（immunoreactive score，IRS）［3］，即IRS＝陽性細胞百分比／級 ×染色強度／級。按照0～2分為（－），3～5分為（＋），6～8分為（?），9～12分為（?）；其中0～2分判為陰性，3 ～12分判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法采用 SPSS 17.0軟件對各數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料用率或百分比表示，率的比較采用χ2檢驗（或Fisher確切概率法），相關(guān)性采用 Spearman等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 不同子宮頸病變中 HR-HPV感染情況70 例 CSCC患者中 HR-HPV檢測69例呈陽性，陽性率98.6%（69／70），其中 A9組陽性占比最高，達85.5%（59／69）。CIN2＋CIN3級患者HR-HPV感染率96.7%（29／30），其中 A9組占比 86.2%（25／29）。CIN1級患者 HR-HPV感染率66.7%（20／30），其中A9組占比55%（11／20）。對照組慢性子宮頸炎 HR-HPV感染率僅 5%（1／20），為 A5／6型組（表1）。

表1 不同子宮頸病變中 HR-HPV感染情況

2．2 c-jun、c-fos表達及與 CSCC的臨床病理特征關(guān)系c-jun和 c-fos陽性表達定位于細胞核，慢性子宮頸炎中未見陽性細胞，CIN組中可見陽性細胞上移，位置與級別相符。CSCC組中陽性細胞明顯增多且呈強陽性。CSCC、CIN2＋CIN3組與慢性子宮頸炎組及 CIN1組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但在 CSCC與 CIN2＋CIN3、CIN1與慢性子宮頸炎組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2、3，圖1～4）。70例 CSCC組織中 c-jun蛋白表達與腫瘤FIGO分期、組織學分級及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等分組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與患者年齡、腫瘤大小等分組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。c-fos蛋白表達與腫瘤 FIGO分期、組織學分級相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與患者年齡及腫瘤大小及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等分組中表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。

圖1 c-jun在CSCC中呈陽性，SP法 圖2 c-jun在CIN3中呈陽性，SP法 圖3 c-fos在CSCC中呈陽性，SP法 圖4 c-fos在CIN3中呈陽性，SP法

表2 c-jun在不同子宮頸組織中的表達

表3 c-fos在不同子宮頸組織中的表達

表4 c-jun、c-fos表達與 CSCC臨床病理特征的關(guān)系

2．3 HR-HPV陽性與c-jun、c-fos在CSCC中表達的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析顯示：HR-HPV陽性在CSCC組織中與c-jun、c-fos表達呈顯著正相關(guān)（P＜0.01，表5）。

表5 CSCC中HR-HPV與c-jun、c-fos表達相關(guān)性分析

3 討論

自20世紀70年代后期Harald zur Hausen博士提出 HPV與子宮頸癌有關(guān)以來，近 40余年大量流行病學研究已證實子宮頸癌及癌前病變的發(fā)生與HR-HPV持續(xù)感染和缺乏子宮頸癌篩查有關(guān)。乳頭狀瘤病毒的種系分類包括118型，HPV為 A屬由許多密切相關(guān)的亞型組成，其中最重要的是 A9分化體（以HPV 16為代表）和A7分化體（以HPV 18和HPV 45為代表）［3］。大多數(shù)HPV感染為一過性，并可被機體免疫反應(yīng)清除，HR-HPV感染清除時間比低危者緩慢，若感染持續(xù)時間 36個月后，將來被清除的可能性則顯著降低；且持續(xù)感染時間越長，更可能形成高度病變，甚至發(fā)展成浸潤性子宮頸癌［4］。因此，HR-HPV持續(xù)感染在大多數(shù)子宮頸癌及其前驅(qū)病變的發(fā)病機制上起關(guān)鍵作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，在70例 CSCC患者子宮頸分泌物中HR-HPV的陽性率98.6%，在 CIN2＋CIN3級中同樣有類似的高陽性率，且均以A9組占比最多，提示 A9組HPV在人類具有高致病性、易感性的生物學特性。這一實驗結(jié)果與現(xiàn)有報道相同，國內(nèi)李芳等［5］通過對 21 776例女性進行HPV感染的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，在 4 274例感染標本中 A9組檢出率最高（2 237例），占比10.3%，且 A9組HPV感染患者在隨后的子宮頸活檢中診斷為CIN2＋CIN3級的比率高達70.3%，提示HR-HPV A9組病毒致病性及導(dǎo)致子宮頸癌的危險程度最高。臨床應(yīng)對 A9組 HR-HPV感染患者采取更積極的治療及隨訪策略。

AP-1信號通路是近年來倍受關(guān)注的細胞中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究表明［6］，AP-1信號通路活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在參與腫瘤發(fā)生和進展的基因序列上，常能檢測到AP-1結(jié)合位點的存在，其活性增高可誘導(dǎo)惡性腫瘤的形成，并促進腫瘤組織浸潤及轉(zhuǎn)移能力增強。原癌基因 c-jun和 c-fos屬于 myc基因家族，其蛋白表達產(chǎn)物 c-jun和c-fos定位于細胞核，具有結(jié)合特異性DNA序列和激活基因轉(zhuǎn)錄的活性，是一種早期基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子。AP-1通常由 c-jun和 c-fos以亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的異源二聚體結(jié)構(gòu)，兩者均可因結(jié)構(gòu)改變而被激活為癌基因，通過MAPKS家族的磷酸化來調(diào)節(jié)激活前和新合成的AP-1活性，其產(chǎn)物可結(jié)合到多種基因增強子上，導(dǎo)致靶基因的表達而引起致癌作用［7］。在體細胞受各種刺激如病毒感染后，體內(nèi)c-jun和 cfos蛋白水平增高，激活A(yù)P-1信號通路，并通過調(diào)控下游靶基因促進腫瘤新生血管的形成、腫瘤細胞運動、黏附增加等促進惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。同樣，在人類鱗狀細胞癌組織中，也觀察到高水平的c-jun和c-fos蛋白，且較高的 c-jun和 c-fos蛋白水平均能增加淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移機率，其機制可能與誘導(dǎo)AP-1活性的正反饋循環(huán)有關(guān)。

本實驗從慢性子宮頸炎、CIN1、CIN2＋CIN3、CSCC疾病譜中檢測 c-jun和 c-fos蛋白的表達，cjun和 c-fos蛋白在慢性子宮頸炎中均呈陰性，在CSCC及其癌前病變中呈高表達，且在CSCC中的表達隨腫瘤組織分化程度的降低及臨床分期升高。其陽性率逐漸增高、強度逐漸增強，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證實 AP-1通路活化與子宮頸疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本組前期實驗已證實c-jun 和 c-fos蛋白具有協(xié)同作用［8］，這一結(jié)果與 Prusty等［9］的報道相符，c-jun和 c-fos表達強度隨 CIN級別增高其強度逐步增強，在 CSCC中均呈強表達。由于惡性腫瘤的發(fā)生是一個多步驟、多基因改變的過程，且 CIN及 CSCC均為 HPV感染相關(guān)性疾病。因此，在該瘤變進程中病毒感染后AP-1轉(zhuǎn)錄因子可能起重要的促進作用。此外，本實驗結(jié)果還顯示HR-HPV感染與c-jun和c-fos在 CSCC中的表達呈正相關(guān)，提示AP-1信號通路活化可能是 HPV感染后子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要步驟。這也與文獻報道［10－11］相一致。Chen等［12］采用 mRNA原位雜交法檢測濕疣患者中 E5Aa基因和 c-jun mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)c-jun mRNA水平在E5AamRNA水平高的子宮頸濕疣標本中比在正常子宮頸標本高，并認為HPV感染可能促進c-jun mRNA的轉(zhuǎn)錄。HPV感染后可通過c-jun、c-fos表達促進細胞增生，但其確切機制有待進一步分析。

綜上所述，HR-HPV陽性與 c-jun和 c-fos蛋白表達呈正相關(guān)，提示 HR-HPV感染后 AP-1通路活化在 CSCC的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測 HR-HPV與c-jun和 c-fos蛋白的表達，有助于臨床對子宮頸疾病的早期篩查、準確分級及預(yù)后評估，提高子宮頸疾病的整體治療水平，并有望通過下調(diào) c-jun和 c-fos水平來逆轉(zhuǎn) AP-1活性成為子宮頸癌治療的新手段。

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Relationship of high-risk human papillomavirus infection and c-jun and c-fos expression in cervical carcinoma

ZHU Hao-hao，REN Guang-yu，WU Qin，XIONG Dun-yong，YUAN Ting，YUWan-xia
（Department of Pathology，the94th Hospital of PLA，Nanchang 330002，China）

PurposeTo investigate the relationship and clinical significance of high-risk human papillomavirus infection and expression of c-jun and c-fos protein in cervical carcinoma.M ethodsCervista HR-HPV testing，immunohistochemical SP method were employed to detect the infection of HR-HPV，c-jun and c-fos protein in 70 cases of CSCC，60 cases of cervical intraepithelial neoplasia and 20 cases of chronic cervicitis.The correlation between c-jun and c-fos protein expression and of HR-HPV infection was analyzed.ResultsOf the 70 cases of CSCC，the positive HR-HPV was 69 cases，the positive rate in HR-HPV in A9 group was the highest（85%，59／69）.The positive expression of c-jun and c-fos were 80% （56／70），85.7% （60／70）in 70 cases CSCC，70% （21／30）and 70% （21／30）in 30 cases of cervical high grade intraepithelial neoplasia，and 20%（6／30），23.3%（7／30）in 30 cases cervical low grade intraepithelial neoplasia，but the positive expression rates of c-jun and c-fos in the 20 cases of chronic cervicitiswere 0.Expression of c-jun and c-fos in cervical cancer group was higher than that in the chronic cervicitis group and low grade intraepithelial neoplasia（P＜0.05）.The expression of c-jun and c-fos was statistically significant in different groups of clinical stage and pathologic grading in the CSCC（P＜0.05）.Additionally，the expression of c-jun and c-fos was positively correlated with the infection of HR-HPV in CSCC（P＜0.01）.ConclusionThe infection of HR-HPV has significant subtype-specific and has a positive correlation with the expression of c-jun and c-fos in CSCC，which suggests that AP-1 pathway activation after HRHPV infection may be associated with the occurrence and development of cervical carcinoma.

cervical neoplasm；HPV；c-jun；c-fos；pathology

R 737.33

：A

1001－7399（2017）01－0027－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.007

接受日期：2016－11－21

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生資助（12MB022）

江西南昌解放軍第九四醫(yī)院病理科，南昌 330002

朱皓皞，女，副主任醫(yī)師。E-mail：2572839187＠qq.com