丁 莉，鄒先進(jìn)，范婉婷，鄭 杰，陳 瓊

應(yīng)用時(shí)間分辨法檢測(cè)石蠟包埋子宮頸組織p16INK4a蛋白

丁 莉1，鄒先進(jìn)1，范婉婷1，鄭 杰1，陳 瓊2

目的探討時(shí)間熒光分辨法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）檢測(cè)子宮頸組織中 p16INK4a蛋白的表達(dá)。方法選

子宮頸組織；p16INK4a；免疫組織化學(xué)；時(shí)間熒光分辨法

p16INK4a基因在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等許多腫瘤中，易出現(xiàn)缺失、突變或表觀沉默，其表達(dá)減少并失去生長(zhǎng)抑制作用［1］。在子宮頸癌及癌前病變中，人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染并與宿主細(xì)胞整合產(chǎn)生E6／7原癌基因蛋白，打斷 pRb-E2F-p16INK4a負(fù)反饋通路，導(dǎo)致 p16INK4a功能失活在細(xì)胞中蓄積增多。子宮頸癌及子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中 p16INK4a表達(dá)均升高，免疫組化 EnVision兩步法檢測(cè)子宮頸組織、子宮頸脫落細(xì)胞中 p16INK4a蛋白，用于輔助診斷子宮頸腫瘤性病變，得到眾多學(xué)者的共識(shí)［2－5］，p16INK4a是具有發(fā)展前景的子宮頸癌標(biāo)志物。時(shí)間熒光分辨法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）檢測(cè)蛋白表達(dá)線性范圍廣、非特異性信號(hào)低，其標(biāo)志物制備簡(jiǎn)便、保存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染，被臨床廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)建立 TRFIA法檢測(cè)子宮頸組織中p16INK4a蛋白表達(dá)，并與免疫組化 EnVision兩步法進(jìn)行相關(guān)性分析，為p16INK4a蛋白應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取2013年6月 ～2015年6月荊門市第一人民醫(yī)院存檔的子宮頸小活檢標(biāo)本 126例，患者年齡21～75歲，均已婚且無(wú)子宮頸手術(shù)史。免疫組化染色切片同時(shí)切取子宮頸組織薄片收集于 EP管中用于 TRFIA法檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑免疫組化p16INK4a抗體購(gòu)自福州邁新公司，子宮頸石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司，TRFIA檢測(cè) p16INK4a抗體購(gòu)自 Abnova公司。半自動(dòng) VICTOR 1420多標(biāo)記檢測(cè)儀購(gòu)自 Perkin Elmer公司。

1．3 免疫組化檢測(cè)子宮頸組織中 p16INK4a蛋白所有標(biāo)本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。免疫組化采用 EnVision兩步法，3 mm厚切片，EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)，DAB顯色。

1．4 TRFIA檢測(cè)子宮頸組織中 p16INK4a蛋白（1）組織蛋白提?。呵腥?6片 5μm厚石蠟包埋組織置于1.5 mL EP管中，加入1 mL預(yù)處理試劑 A，高速渦懸震蕩30 s后室溫靜置 5 min，并顛倒離心管數(shù)次。加入100μL預(yù)處理試劑B，渦懸震蕩10 s后離心10 000 r／min×2min，移去上下兩層液體。用500 μL雙蒸水清洗脫蠟的組織 2次，加入 100μL提取試劑，渦懸震蕩數(shù)秒，置于金屬浴中 100℃處理20 min，然后調(diào)節(jié)金屬浴至60℃處理2 h，約20 min震蕩1次。4℃離心12 000 r／min×15 min，取上清至潔凈EP管中置于－20℃?zhèn)溆?。?）包被：以多克隆抗體包被進(jìn)口雷勃板，室溫慢速震蕩 1 h，4℃靜置20 h后以每孔300μL PBS洗板2次并拍干，每孔加入200μL封閉液（PBS配制2%BSA）于37℃靜置2 h，拍干并密封－20℃保存?zhèn)溆谩＃?）標(biāo)記：將單克隆抗體加入超濾管中離心 10 000 r／min×10 min，將濃縮后的抗體加入 200μL標(biāo)記緩沖液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 9.0）中離心10 000 r／min×10 min，棄濾液；重復(fù)5～6次。將幾次離心后的超濾管取出棄濾液，把離心管濾膜反轉(zhuǎn)，4 000 r／min×3 min離心收集濾液。再次將濾膜反轉(zhuǎn)，加入 100μL標(biāo)記緩沖液靜置 5 min，將濾膜重新反轉(zhuǎn)，5 000 r／min×2 min離心收集液體。按摩爾比（5∶1）加入Eu-DTTA充分混勻后于室溫震蕩孵育 16～20 h，過(guò)凝膠層析柱純化，對(duì)標(biāo)記樣品進(jìn)行上樣洗脫。待蛋白檢測(cè)儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時(shí)，開始收集樣品（每管1 mL）。取5μL收集樣品，加至空白孔中，每孔加200 μL增強(qiáng)液，室溫緩慢震蕩5 min，測(cè)熒光值，收集信號(hào)最高的幾管合并，加終濃度為0.1%去金屬離子的 BSA，小量分裝備用。（4）p16INK4a蛋白檢測(cè)：稀釋樣品，用生理鹽水將待測(cè)樣品1∶100稀釋，按每孔100μL加入稀釋后的樣品，封板于37℃震蕩孵育1 h，每孔300μL洗板4次并拍干。每孔加入100μL銪標(biāo)記抗體1∶100（分析緩沖液稀釋）并封固于室溫震蕩孵育2 h。洗板 6次并拍干，加入每孔 200 μL增強(qiáng)液，室溫慢速振搖5 min，檢測(cè)熒光值。每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，應(yīng)用免疫組化檢測(cè) p16INK4a蛋白強(qiáng)陽(yáng)性的 HSIL樣本為陽(yáng)性對(duì)照、p16INK4a蛋白陰性的未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞、生理鹽水為陰性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判讀子宮頸組織學(xué)活檢結(jié)果判讀為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病 變 （low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）。

免疫組化檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a蛋白：細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞比例及染色深淺判斷。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：不著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50% 為3分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：黃色為 1分，棕黃色為 2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)指標(biāo)相乘：0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽(yáng)性（＋），4～6分為中陽(yáng)性（?），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（?）。

TRFIA檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a蛋白：統(tǒng)計(jì)學(xué)中，當(dāng)數(shù)據(jù)處于正態(tài)分布時(shí)，個(gè)體樣本的測(cè)量值與平均值之差落在 3倍標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)的可信限為 99%。本實(shí)驗(yàn)選取的所有免疫組化結(jié)果陰性未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞病例平均熒光值記為 MOD，標(biāo)準(zhǔn)差記為SD，檢測(cè)樣本個(gè)體熒光值記為ODi，以O(shè)Di＜MOD＋3SD判讀為陰性（－），ODi≥MOD＋3SD判讀為陽(yáng)性（＋）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)法進(jìn)行率的比較，以 P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)檢查126例活檢樣本中，未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞標(biāo)本 20例，LSIL標(biāo)本 24例，HSIL標(biāo)本53例，SCC標(biāo)本29例。

2．2 免疫組化檢測(cè)子宮頸活檢組織中 p16INK4a蛋白表達(dá)應(yīng)用免疫組化 EnVision兩步法檢測(cè) p16INK4a蛋白：20例未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞中p16INK4a蛋白呈弱陽(yáng)性 1例，陰性 19例；24例LSIL 中 p16INK4a蛋白呈陰性5例，弱陽(yáng)性 11例，中等陽(yáng)性＋強(qiáng)陽(yáng)性 8例；53例 HSIL中 p16INK4a蛋白呈弱陽(yáng)性6例、中等陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性 47例，未出現(xiàn)陰性病例。29例子宮頸癌中，p16INK4a蛋白陰性 1例，弱陽(yáng)性 5例，中等陽(yáng)性＋強(qiáng)陽(yáng)性23例（表1，圖1～4）。

圖 1 在未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞中 p16INK4a蛋白呈陰性，EnVision兩步法 圖 2 在 LSIL中 p16INK4a蛋白呈弱陽(yáng)性，EnVision兩步法 圖3 在 HSIL中 p16INK4a蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性，EnVision兩步法 圖 4 在 SCC中 p16INK4a蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性，EnVision兩步法

2．3 TRFIA檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a蛋白表達(dá)與免疫組化結(jié)果分析20例未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞標(biāo)本中，TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白陽(yáng)性 3例，其中1例為免疫組化陽(yáng)性。另 2例雖然免疫組化結(jié)果判讀為陰性，但活檢組織面積較大，TRFIA檢測(cè) p16INK4a水平在陽(yáng)性閾值之上。TRFIA檢測(cè)LSIL 組 p16INK4a蛋白陽(yáng)性 17例，HSIL及 SCC組中陽(yáng)性分別為50、27例。LSIL、HSIL及SCC組中TRFIA檢測(cè)p16INK4a蛋白陽(yáng)性的病例，免疫組化檢測(cè)均為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果判讀為陽(yáng)性而TRFIA檢測(cè)陰性的病例，在LSIL、HSIL、SCC組中分別為2、3、1例（表2）。

表 1 免疫組化檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a蛋白的表達(dá)

表 2 TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白表達(dá)與免疫組化結(jié)果比較

TRFIA檢測(cè) LSIL組織中 p16INK4a蛋白陽(yáng)性率為70.83%（17／24），檢測(cè)HSIL及 SCC兩組的總陽(yáng)性率為93.90%（77／82），差異有顯著性（χ2＝9.842，P ＝0.002）。TRFIA檢查子宮頸組織 p16INK4a蛋白在未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞組中的陽(yáng)性率為15.00%（3／20），低于 LSIL（χ2＝13.716，P＜0.001）、HSIL及SCC組（χ2＝59.171，P＜0.001）。

3 討論

p16INK4a是子宮頸癌及鱗狀上皮內(nèi)病變較特異性的分子標(biāo)志物，在多數(shù)子宮頸SCC和癌前病變中呈過(guò)表達(dá)或高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)［4］。不同形態(tài)的子宮頸腺癌，包括子宮頸型、漿液型、子宮 內(nèi) 膜 樣 型 等，p16INK4a蛋 白 均過(guò)表 達(dá)［6］。2005～2010年中國(guó)7個(gè)地區(qū)9個(gè)醫(yī)院的169例根治子宮頸腺癌標(biāo)本中，免疫組化檢測(cè)大部分 p16INK4a過(guò)表 達(dá)［7］。

p16INK4a蛋白檢測(cè)方法有多種，免疫組化法因其檢測(cè)結(jié)果直觀、無(wú)需特殊條件，應(yīng)用最為廣泛；但該方法程序繁多、耗時(shí)較長(zhǎng)，大部分基層醫(yī)院仍然保持手工操作，因此不適合大規(guī)模檢測(cè)。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法用于檢測(cè)子宮頸脫落細(xì)胞中p16INK4a蛋白，比細(xì)胞形態(tài)學(xué)篩查具有更高的敏感性和相似的特異性［8］，但試劑及熒光檢測(cè)系統(tǒng)成本高昂，并需要專業(yè)培訓(xùn)的病理學(xué)醫(yī)師，且與免疫組化染色相比并無(wú)明顯的優(yōu)越性。電壓免疫傳感器法通過(guò)抗體吸附蛋白，引起傳感器諧振頻率改變反映 p16INK4a蛋白的數(shù)量［9］，該方法客觀、快速且技術(shù)成本較小，但穩(wěn)定性和精密度有待提高。枸櫞酸鈉還原法制備13 nm金顆粒，建立基于免標(biāo)記納米金和抗重組 p16INK4a適配體，可用于快速檢 測(cè) p16INK4a蛋白［10］。

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）檢測(cè)子宮頸脫落細(xì)胞 p16INK4a蛋白，具有快速、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，且量化的數(shù)值能夠使檢測(cè)更加客觀，減少主觀判讀引起的偏差［11－12］。ELISA是將抗原及抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合，利用呈色反應(yīng)進(jìn)行定量分析，但是酶標(biāo)志物的穩(wěn)定性較差，對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能產(chǎn)生一定影響。

TRFIA分析法采用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，是目前最靈敏的微量分析技術(shù)。鑭系元素標(biāo)志物克服了酶穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，只要反應(yīng)板的液體不揮發(fā)，反應(yīng)終止后測(cè)定值能穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間。鑭系離子螯合物的熒光衰變時(shí)間極長(zhǎng)，是傳統(tǒng)熒光的103～106倍，通過(guò)時(shí)間延遲，待激發(fā)光衰減后進(jìn)行發(fā)射熒光檢測(cè)。由于標(biāo)記離子的熒光激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬，而發(fā)射光譜峰范圍較窄，激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長(zhǎng)位移大，可達(dá) 290 nm，通過(guò)濾光片幾乎可以消除背景熒光的干擾。通過(guò)時(shí)間延遲和波長(zhǎng)分辨，將強(qiáng)特異性熒光和背景熒光分辨開，極大提高該方法的特異性。TRFIA檢測(cè)在臨床上廣泛應(yīng)用于病原微生物血清標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物、激素含量檢測(cè)等，并發(fā)展為新生兒篩查質(zhì)控中心推薦的先天性甲狀腺功能減退首選方法［13］。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 20例子宮頸未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞中p16INK4a蛋白表達(dá)，免疫組化染色顯示陰性15例，TRFIA檢測(cè)亦陰性；1例鱗狀上皮化生陽(yáng)性，TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性；另外4例雖然免疫組化染色鱗狀上皮部分區(qū)域散在細(xì)胞著色［14］，免疫組化結(jié)果判讀時(shí)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，未參考病灶大小，因此仍然被判讀為陰性。若取材面積較大時(shí)，p16INK4a蛋白總量高于 TRFIA判讀閾值。TRFIA檢測(cè)4例子宮頸未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞，結(jié)果顯示陰陽(yáng)性各2例。

LSIL、HSIL及 SCC組中，TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性的病例，免疫組化染色也顯示陽(yáng)性。免疫組化檢測(cè)結(jié)果僅僅對(duì)腫瘤細(xì)胞比例進(jìn)行計(jì)算，未考慮病灶大小，因此在部分病例病灶面積較小、染色較弱的情況下，p16INK4a蛋白總水平低于陽(yáng)性判讀閾值。SCC組中1例經(jīng)免疫組化及TRFIA檢測(cè)均陰性，提示 p16INK4a蛋白可陰性［15］。

免疫組化檢測(cè)未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞陽(yáng)性1例，TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性3例；免疫組化檢測(cè)LSIL陽(yáng)性19例，TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性17例；免疫組化檢測(cè)HSIL陽(yáng)性53例，TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性50例。少數(shù)病例因組織中病灶大小、表達(dá) p16INK4a蛋白強(qiáng)度差異等因素影響，絕大部分病例中，TRFIA檢測(cè)子宮頸組織p16INK4a蛋白表達(dá)與免疫組化保持一致，提示 TRFIA適合于檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a蛋白。

TRFIA檢測(cè) p16INK4a在子宮頸組織未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞組的陽(yáng)性率為 15.00%（3／20），而在 LSIL陽(yáng)性率為70.83%（17／24），差異有顯著性（χ2＝13.716，P＜0.001）。TRFIA檢測(cè)子宮頸組織 p16INK4a在 HSIL及SCC組的總陽(yáng) 性率為93.90%（77／82），高于 LSIL組（χ2＝9.842，P＝0.002）。p16INK4a蛋白表達(dá)對(duì)于子宮頸病變有預(yù)測(cè)作用，強(qiáng)陽(yáng)性患者疾病可能進(jìn)展，而陰性模式僅出現(xiàn)在自然消退的子宮頸病變組［16］。因此若不加干預(yù)治療，TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白陽(yáng)性的患者疾病可能進(jìn)展，而檢測(cè)陰性患者可能隨著病灶面積擴(kuò)大被檢測(cè)出來(lái)，也可能自行消退。

本實(shí)驗(yàn)采用TRFIA檢測(cè)石蠟包埋子宮頸組織p16INK4a蛋白，提取需進(jìn)行脫蠟等一系列處理，且經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋處理可造成蛋白鉸鏈、抗原位點(diǎn)折疊或斷裂等，降低檢測(cè)的敏感性并增加非特異性。子宮頸脫落細(xì)胞全蛋白提取則只需收集細(xì)胞、裂解并提取上清，即可進(jìn)行蛋白檢測(cè)。如果 TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白試劑商品化，可大大降低檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化操作過(guò)程。該方法具有高靈敏度、高特異性、線性范圍廣、示蹤物穩(wěn)定、無(wú)同位素放射性污染的特點(diǎn)，且對(duì)檢測(cè)條件要求不高，可滿足基層醫(yī)院到三甲醫(yī)院臨床不同層次的需求，有利于大規(guī)模應(yīng)用。

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Detection p16INK4aprotein in cervical tissuesw ith time-resolved fluoroimmunoassay

DING Li1，ZOU Xian-jin1，F(xiàn)ANWan-ting1，ZHENG Jie1，CHEN Qiong2
（1Department of Pathology，the First People’s Hospital of Jingmen，Jingmen 448000，China；2School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

PurposeTo establish a new method for detecting p16INK4ain cervical tissueswith time-resolved fluoroimmunoassay（TRFIA）.M ethods126 cases of paraffin imbedding tissues of cervix were selected for immunohistochemistry（IHC）of EnVision two-step and TRFIA.ResultsThere were 20 cases of no intraepithelial lesion ormalignancy，24 cases of low-grade squamous intraepithelial lesion（LSIL），53 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion（HSIL）and 29 cases of squamous cell carcinoma（SCC）.In the groups of no intraepithelial lesion or malignancy，LSIL，HSIL and SCC，p16INK4apositive was seen in 1，19，53 and 28，respectively.TRFIA test results displayed p16INK4apositive in 3，17，50 and 27 cases，respectively.Positive of p16 using by TRFIA in no intraepithelial lesion ormalignancy，LSIL，above HSIL was 15.00%，70.83% and 93.90%，respectively（P＜0.01）.ConclusionTRFIA is suitable for detecting of p16INK4aprotein and demand low detection equipment.p16INK4aexpression detected by TRFIA may helpful for large scale detection in various clinical institution.

cervical tissues；p16INK4a；immunohistochemistry；time-resolved fluoroimmunoassay

R 737.33；R 446

A 文章編號(hào)：1001－7399（2017）01－0017－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.005

接受日期：2016－11－16

湖北省自然科學(xué)基金（2013CFB478）

1荊門市第一人民醫(yī)院病理科 4480002南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣州 510515

丁 莉，女，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail：dl789521＠126. com鄒先進(jìn)，男，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：xjz6074＠sina. com

取子宮頸組織病理學(xué)小活檢標(biāo)本126例，采用免疫組化EnVision兩步法及 TRFIA法檢測(cè)石蠟包埋組織中 p16INK4a蛋白。結(jié)果126例標(biāo)本中，未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞 20例、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）24例、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）53例、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）29例。免疫組化檢測(cè)未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞組、LSIL組、HSIL組、SCC組中p16INK4a蛋白陽(yáng)性病例分別為1、19、53、28例，TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白陽(yáng)性病例分別為3、17、50、27例。LSIL、HSIL及 SCC組中，TRFIA檢測(cè) p16INK4a蛋白陽(yáng)性的病例經(jīng)免疫組化結(jié)果均為陽(yáng)性。TRFIA檢測(cè)p16INK4a蛋白在未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞及惡性細(xì)胞組、LSIL、HSIL及 SCC組的陽(yáng)性率分別為15.00%、70.83%、93.90%，差異有顯著性（P＜0.01）。結(jié)論TRFIA適合于檢測(cè) p16INK4a蛋白，且對(duì)檢測(cè)條件要求低，有利于臨床工作中不同機(jī)構(gòu)大規(guī)模檢測(cè)。