趙彩琴，鈕紅麗

子宮內(nèi)膜癌中PKD1的表達(dá)及其臨床意義

趙彩琴，鈕紅麗

目的探討蛋白激酶 D1（protein kinase D1，PKD1）在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，并分析其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化 SP法及 qRT-PCR法檢測92例子宮內(nèi)膜癌組織和48例正常子宮內(nèi)膜組織中 PKD1 mRNA及其蛋白的表達(dá)，分析 PKD1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其與分化程度、臨床分期的關(guān)系。應(yīng)用 Western blot法檢測 PKD1蛋白在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞株及不同分化程度的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌組織中的 PKD1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.01）；PKD1 mRNA及蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織分化程度均有相關(guān)性，且組織分化程度越低，臨床病理分期越高，PKD1的表達(dá)越豐富。PKD1蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平也遠(yuǎn)高于正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.01），且癌細(xì)胞株的分化水平越低，PKD1蛋白表達(dá)的水平越高。結(jié)論P(yáng)KD1在子宮內(nèi)膜癌患者癌灶中呈高表達(dá)，PKD1表達(dá)水平的高、低可以做為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌惡性程度的一項重要參考依據(jù)。

子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜癌；蛋白激酶 D1；表達(dá)；病理診斷

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤，其病死率高［1］，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）在腫瘤形成的進(jìn)程中倍受關(guān)注，PKD1信號級聯(lián)反應(yīng)和胰腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2－4］，其原因在于 PKD1與癌細(xì)胞的增殖和分化以及癌細(xì)胞生長區(qū)域血管的新生密切相關(guān)［5］。然而，PKD1和子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系鮮有報道，本文通過檢測PKD1在不同子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中的表達(dá)水平，探討PKD1與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系，為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后判斷提供新的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年3月～2016年3月南陽市第一人民醫(yī)院診治的92例有完整臨床資料的子宮內(nèi)膜癌石蠟標(biāo)本?；颊吣挲g42～71歲，平均（56.1±11.2）歲，均為首次手術(shù)患者，術(shù)前未行其他治療。FIGO臨床組織學(xué)分級及病理分期：高分化癌39例，中分化癌32例，低分化癌21例；Ⅰ＋Ⅱ期60例，Ⅲ＋Ⅳ期32例。對照組為同期就診的48例經(jīng)病理診斷為增殖期或分泌期內(nèi)膜的刮宮標(biāo)本：年齡39～66歲，平均（50.8±9.6）歲。新鮮腫瘤組織標(biāo)本收集2016年3～5月南陽市第一人民醫(yī)院因子宮內(nèi)膜癌診斷行子宮切除術(shù)患者的癌組織標(biāo)本，以及同期因人工流產(chǎn)行刮診手術(shù)的子宮內(nèi)膜標(biāo)本，剪取0.5 cm3的新鮮腫瘤組織 2塊，無菌去離子水沖洗后置RNA later液中，采用 TRIzol法提取總 RNA后，－80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系 ESC和人高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞株 Ishikawa由腫瘤科主任趙旭林教授饋贈，中分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株 JEC及低分化子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞株 KLE購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基孵育各細(xì)胞株，在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁生長情況，待細(xì)胞貼壁75%～85%時，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以每毫升 1×106個的濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用于后續(xù)的實驗。

1.3 免疫組化免疫組化采用 SP法，子宮內(nèi)膜組織用10%的中性福爾馬林固定后，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上。常規(guī)脫蠟后，檸檬酸緩沖液中微波抗原修復(fù) 12 ～15min，3%H2O2溶液室溫下孵育10min，山羊血清室溫下封閉20 min。滴加PKD1抗體（OSP00005W，美國Pierce公司）（1∶125），4℃過夜。羊抗兔 IgG二抗和DAB按照試劑盒（TC1378和 DD1660，武漢博士德公司）說明書執(zhí)行。PKD1蛋白主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色，病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片隨機(jī)選取陽性細(xì)胞富集的10個高倍視野觀察（×200）。（1）根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量所占比計分：無陽性細(xì)胞為0分；≤25%為1分；26%～50% 為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。（2）根據(jù)著色強(qiáng)度計分：未著色為 0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相加：0～1分為（－），2分為（＋），3～4分為（?），＞5分為（?），其中（＋～?）為陽性，（－）為陰性。

1．4 qRT-PCR檢測 依據(jù) MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RTP50，北京盛科博源公司）說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。qRT-PCR檢測嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書操作流程進(jìn)行：每個反應(yīng)體系分別加入 SYBER 5 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2μL，上下游引物各0.3μL，cDNA 2μL，加入無酶水至10μL，實時熒光定量 PCR儀上執(zhí)行40個熱循環(huán)反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，58℃ 30 s，65℃ 15 s。每份樣本設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。依據(jù)內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)化算 出 目的 基 因相 對 表達(dá) 量，即 RQ＝2－ΔΔCT、ΔCTPKD1基因＝ CTPKD1基因－ CTβ-actin基因、ΔΔCT ＝ΔCTPKD1基因－ΔCT正常子宮內(nèi)膜組織均值。引 物 PKD1-F：3’-GCATGAGCTAGCCTACAGCC-5’，PKD1-R：3’-CTAATCACGACGCTGGGACT-5′。β-actin-F：3′-GCAGTTGGTTGGAGCAA-5′，β-actin-R：3′-ATGCCGTGGATACTTGGA-5′。

1．5 Western blot檢測對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞 RIPA裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白的濃度。取100μg蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用 5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入 1∶800的PKD1單克隆抗體4℃冰箱中孵育過夜，內(nèi)參為 βactin；37℃復(fù)溫1 h，TBST洗膜3次，每次10min；加入1∶2 000的山羊抗兔二抗孵育2 h，TBST洗膜 3次，每次10 min；ECL顯影，測量目的條帶和內(nèi)參條帶的光密度比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗、多組間比較采用 F檢驗，當(dāng)方差不齊時，采用秩和檢驗。兩變量間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，PKD1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組中的表達(dá)高于正常對照組（t＝189.85，P＜0.01，表1），PKD1蛋白主要集聚在子宮內(nèi)膜癌組織中的細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色；正常子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞中 PKD1蛋白呈散在性表達(dá)，核陽性的細(xì)胞數(shù)量極少。39例高分化子宮內(nèi)膜癌患者中PKD1蛋白主要呈散在性表達(dá)，核陽性者22例（56.41%），32例中分化子宮內(nèi)膜癌患者中 PKD1蛋白主要呈局灶陽性，核陽性者23例（71.88%），21例低分化子宮內(nèi)膜癌患者中 PKD1蛋白主要呈彌漫陽性，核陽性者18例（85.71%）；60例臨床Ⅰ＋Ⅱ期陽性者 37例（61.67%），PKD1蛋白主要呈散在性和局灶性表達(dá)，Ⅲ＋Ⅳ期陽性者25例（78.13%），PKD1蛋白主要呈彌漫陽性。PKD1蛋白的表達(dá)和腫瘤的組織學(xué)分化程度有相關(guān)性（rs＝0.83，P＜0.01），且組織分化程度越低，PKD1蛋白越豐富（F＝7.23，P＜0.01）；與腫瘤臨床分期也有相關(guān)性（rs＝0.69，P＜0.05），且臨床分期越高，PKD1蛋白越豐富（F＝4.54，P＜0.05，表2，圖1～3）。

圖 1 高分化子宮內(nèi)膜癌中PKD1的表達(dá)，SP法

圖 2 中分化子宮內(nèi)膜癌中PKD1的表達(dá)，SP法

圖 3 低分化子宮內(nèi)膜癌中PKD1的表達(dá)，SP法

2．2 PKD1 m RNA在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較 qRT-PCR檢測結(jié)果表明，PKD1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常對照組（t＝33.57，P＜0.01，表3），且PKD1 mRNA的表達(dá)和腫瘤的組織學(xué)分化程度（rs＝0.79，P＜0.01）及臨床分期均呈相關(guān)性（rs＝0.65，P＜0.05）；與 PKD1蛋白表達(dá)的結(jié)果高度吻合，腫瘤組織分化程度越低（F ＝6.78，P＜0.01），臨床分期越高（F＝8.92，P＜0.01），PKD1 mRNA的表達(dá)豐度越高（表4）。

表1 PKD1蛋白在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)

表2 PKD1蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 PKD1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)（±s）

表3 PKD1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)（±s）

組別 n PKD1 mRNA t值 P值正常子宮內(nèi)膜 48 0.56±0.1333.57 ＜0.01子宮內(nèi)膜癌92 3.72±0.35

表4 PKD1 m RNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表4 PKD1 m RNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理參數(shù) n PKD1 mRNA F值 P值組織學(xué)分級高39 1.82±0.33 中32 3.54±0.97 6.78 ＜0.01 低21 4.91±1.12臨床分期Ⅰ＋Ⅱ 60 1.97±0.44 8.92 ＜0.01Ⅲ＋Ⅳ32 4.45±0.82

2．3 PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)PKD1蛋白表達(dá)在KLE細(xì)胞株中表達(dá)最高，其次為JEC、Ishikawa、ESC細(xì)胞株中表達(dá)；PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝7.63，P＜0.05，圖4，表5）。

表5 PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中的表達(dá)（±s）

表5 PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中的表達(dá)（±s）

細(xì)胞株 PKD1 F值 P值ESC 0.073±0.00 Ishikawa 0.542±0.06 7.63 ＜0.05 JEC 0.713±0.11 KLE 0.896±0.13

圖4 PKD1蛋白在不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中的表達(dá)

3 討論

PKD1屬于鈣調(diào)蛋白依賴性激酶家族成員之一，廣泛參與多種細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。有文獻(xiàn)報道，PKD1涉及腫瘤進(jìn)展過程中細(xì)胞的生長、凋亡、運(yùn)動及血管生成等作用［6］，并且在不同類型的腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。如在前列腺癌組織中，PKD1的表達(dá)聚集在細(xì)胞的胞核中，且比正常的前列腺上皮高［7］；在胰腺癌細(xì)胞中，PKD1的表達(dá)也比正常的胰腺組織高［8］，且研究證實，采用特異的PKD1蛋白抑制劑可顯著抑制胰腺癌組織生長，縮小腫瘤體積［9］。在肺小細(xì)胞癌的報道中也發(fā)現(xiàn)，作為 PKC的主要下游靶基因之一，PKD1參與腫瘤的演進(jìn)進(jìn)程［10］。相反，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，PKD1的表達(dá)卻較正常乳腺組織低，激活 PKD1可通過上調(diào) MMP蛋白的表達(dá)水平抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］；在胃癌癌組織的細(xì)胞中，由于 PKD1的啟動子區(qū)域的高度甲基化，使PKD1蛋白的表達(dá)水平也遠(yuǎn)較正常組織低［12］。

本實驗通過免疫組化 SP法和qRT-PCR法檢測，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織的 PKD1表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組織明顯升高。免疫組化SP法證實，隨著子宮內(nèi)膜癌組織的分化程度由高到低，子宮內(nèi)膜癌組織細(xì)胞核中的PKD1表達(dá)則由低到高。qRT-PCR法證實子宮內(nèi)膜癌組織的分化程度越低，臨床分期越高，PKD1 mRNA的表達(dá)豐度也越高，且PKD1 mRNA的表達(dá)和腫瘤的組織學(xué)分化程度及臨床分期均有相關(guān)性。Western blot實驗進(jìn)一步證實，隨著人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株分化程度的降低，PKD1蛋白表達(dá)呈顯著升高趨勢，而正常的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中雖能檢測到 PKD1蛋白的表達(dá)，但遠(yuǎn)低于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株。提示子宮內(nèi)膜組織中 PKD1的表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病有相關(guān)性，PKD1蛋白的表達(dá)升高可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生；且子宮內(nèi)膜癌組織中PKD1蛋白的表達(dá)越高，其惡性程度可能越高，與之前報道的胰腺癌和前列腺癌中 PKD1的表達(dá)特征高度相似［7－8］，與胃癌及乳腺癌中 PKD1的表達(dá)特征相反。最新胰腺癌研究表明，癌組織中 PKD1蛋白表達(dá)已成為腫瘤預(yù)后判定的重要參考指標(biāo)［13］。我們推測，PKD1蛋白表達(dá)可能作為子宮內(nèi)膜癌惡性程度高、低及預(yù)后判定的重要參考指標(biāo)。

綜上所述，PKD1可以顯著上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)CXCL8分泌、胰腺腫瘤生長區(qū)域血管的新生和成熟，進(jìn)而增進(jìn)癌細(xì)胞的生長、存活、運(yùn)動及細(xì)胞骨架重建，為腫瘤的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)來源［14］。PKD1還可以上調(diào)癌組織中 MMP的表達(dá)，增強(qiáng)其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵蝕和轉(zhuǎn)移［15］。子宮內(nèi)膜癌中，PKD1是否發(fā)揮同等或類似的作用是我們下一步工作的重點，旨在為 PKD1潛在的可能靶標(biāo)治療子宮內(nèi)膜癌提供理論和實驗支持。

［1］ 張雅麗，侯安麗，王杏茶，等.84例子宮內(nèi)膜癌中 Foxp3的表達(dá)及臨床意義［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（7）：748 －751.

［2］ Evans IM，Bagherzadeh A，Charles M，et al.Characterization of the biological effects of a novel protein kinase D inhibitor in endothelial cells［J］.Biochem，2010，429（3）：565－572.

［3］ di Blasio L，Droetto S，Norman J，et al.Protein kinase D1 regulates VEGF-A-induced alphavbeta3 integrin trafficking and endothelial cellmigration［J］.Traffic，2010，11（8）：1107－1118.

［4］ 劉 暖，楊 雷，毛秉豫，等.蛋白激酶 D1在大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞中的促血管新生作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2015，31（9）：1259－1264.

［5］ 楊 雷，劉 暖，毛秉豫，等.蛋白激酶 D1促血管新生的體內(nèi)外實驗分析［J］.中國病理生理雜志，2016，32（1）：146－150，155.

［6］ Stravodimou A，Voutsadakis IA.Statin use and peripheral blood progenitor cells mobilization in patients with multiple myeloma ［J］.Clin Transl Oncol，2014，16（1）：85－90.

［7］ Rozengurt E.Protein kinase D signaling：multiple biological functions in health and disease［J］.Physiology（Bethesda），2011，26（1）：23－33.

［8］ Guha S，Tanasanvimon S，Sinnett-Smith J，et al.Role of protein kinase D signaling in pancreatic cancer［J］.Biochem Pharmacol，2010，80（12）：1946－1954.

［9］ Ziegler S，Eiseler T，Scholz R P，et al.A novel protein kinase D phosphorylation site in the tumor suppressor rabinteractor1 is critical for coordination of cellmigration［J］.Mol Biol Cell，2011，22 （5）：570－580.

［10］Wong C，Jin Z G.Protein kinase C-dependent protein kinase D activationmodulates ERK signal pathway and endothelial cell proliferation by vascular endothelial growth factor［J］.JBiol Chem，2005，280（39）：33262－33269.

［11］Kisfalvi K，Hurd C，Guha S，etal.Induced overexpression of protein kinase D1 stimulatesmitogenic signaling in human pancreatic carcinoma PANC-1 cells［J］.JCell Physiol，2010，223（2）：309 －316.

［12］Eiseler T，Doppler H，Yan IK，etal.Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot［J］.Nat Cell Biol，2009，11（5）：545－556.

［13］Liou G Y，Storz P.Protein kinase D enzymes：novel kinase targets in pancreatic cancer［J］.Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2015，9（9）：1143－1146.

［14］Sinnett-Smith J，Ni Y，Wang J，etal.Protein kinase D1mediates class IIa histone deacetylase phosphorylation and nuclear extrusion in intestinal epithelial cells：role inmitogenic signaling［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2014，306（10）：961－971.

［15］Aicart-Ramos C，Sanchez-Ruiloba T，Gomez-Parrizas M，et al. Protein kinase D activity controls endothelial nitricoxide synthesis ［J］.JCell Sci，2014，127（Pt15）：3360－3372.

Expression and clinical significance of PKD1 in human endometrial carcinoma

ZHAO Cai-qin，NIU Hong-li
（Department of Reproductive Gynecology of Nanyang First People’s Hospital，Nanyang 473000，China）

PurposeTo investigate the expression of protein kinase D1（PKD1）in endometrial carcinoma and normal endometrium，and to investigate its relationship with the clinicopathological features of endometrial carcinoma.MethodsImmunohistochemical SP and qRT-PCR was used to detect themRNA and protein expression of PKD1 in 92 cases of endometrial cancer and 48 cases of normal endometrium，and to analyze the relationship of expression of PKD1 with the tumor differentiation and clinical stage of endometrial carcinoma tissue.Western blot method was used to detect the expression level of PKD1 protein in normal endometrial cell line and endometrial carcinoma cell lines with different degree of differentiation.ResultsmRNA and protein expression of PKD1 in endometrial carcinoma tissues was significantly higher than those in normal endometrial tissues （P＜0.01），which showing a correlation to the degree of tissue differentiation and clinical pathologic staging.While，the expression level of PKD1 protein in endometrial cancer cell lines was alsomuch higher than that in normal endometrial cells（P＜0.01），and the lower differentiation，the higher level of PKD1 protein expression.ConclusionPKD1 is highly expressed in endometrial cancer patients.The level of PKD1 expression may be an important reference for predicting themalignant degree of endometrial cancer.

endometrial neoplasm；endometrial carcinoma；protein kinase D1；expression；pathologic diagnosis

R 737.33

A

1001－7399（2017）01－0008－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.003

接受日期：2016－11－20

國家自然科學(xué)基金（81473438）、河南省科技攻關(guān)課題（122102330049）

河南省南陽市第一人民醫(yī)院生殖婦科 473000

趙彩琴，女，副主任醫(yī)師。Tel：（0377）63310287，E-mail：hnnywy611＠126.com