徐 倩，段 華，汪 沙，甘 露，付鳳仙，湯一群

宮腔粘連子宮內(nèi)膜組織中ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)及意義

徐 倩，段 華，汪 沙，甘 露，付鳳仙，湯一群

目的探討 ArhGAP29和 E-cadherin在宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUAs）子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其臨床意義，分析 ArhGAP29、E-cadherin在 IUAs發(fā)病中的作用機(jī)制。方法采用免疫組化 PV 9000兩步法檢測 IUAs中 ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)，分析其與 IUAs的臨床病理特征關(guān)系以及 ArhGAP29、E-cadherin的相關(guān)性。結(jié)果（1）ArhGAP29、E-cadherin在正常子宮內(nèi)膜中表達(dá)的免疫組化反應(yīng)評分（immunoreactive score，IRS）高于 IUAs患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.017，P＝0.004）；（2）中度 IUAs患者子宮內(nèi)膜中 ArhGAP29、E-cadherin表達(dá)的IRS高于重度 IUAs患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.020，P＝0.026）；非閉經(jīng) IUAs患者子宮內(nèi)膜 ArhGAP29、E-cadherin表達(dá)的 IRS高于閉經(jīng) IUAs患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.019，P＝0.031）；（3）ArhGAP29表達(dá)降低與E-cadherin低表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)（r＝0.725，P＜0.001）。結(jié)論 ArhGAP29、E-cadherin在 IUAs子宮內(nèi)膜中表達(dá)降低，其下降程度與IUAs嚴(yán)重程度有關(guān)，ArhGAP29、E-cadherin降低可能參與 IUAs的形成。

宮腔粘連；ArhGAP29；E-cadherin；上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化；免疫組織化學(xué)

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUAs）又稱Asherman綜合征，是指宮腔或者宮頸管的部分或全部閉塞［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究認(rèn)為，上皮 －間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）是 IUAs的可能發(fā)病機(jī)制之一［2－3］，子宮內(nèi)膜基底層損傷后，上皮細(xì)胞再生障礙，其在形態(tài)上發(fā)生向間（充）質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增生以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，粘連瘢痕形成。上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低是EMT過程中最顯著的細(xì)胞表型改變［4－5］。ArhGAP29通過調(diào)節(jié) RhoGTP酶活性，影響 EMT相關(guān)疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，其在細(xì)胞黏附、細(xì)胞-ECM黏附以及肌動蛋白重排中的作用已得到證實(shí)［6－7］，但在 IUAs中的作用鮮有報(bào)道。本文檢測子宮內(nèi)膜組織中 ArhGAP29及 E-cadherin的表達(dá)情況，分析其與IUAs臨床病理特征的相關(guān)性，以探討其在 IUAs發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2014年7月～2015年6月北京婦產(chǎn)醫(yī)院收治的IUAs子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本 39例，患者年齡23～40歲，中位年齡33歲；采用美國生育協(xié)會（AFS）IUAs評分系統(tǒng)，其重度IUAs患者 17例，中度IUAs患者22例；增殖期內(nèi)膜15例，分泌期內(nèi)膜24例；就診主訴為不孕 8例，月經(jīng)減少 24例，閉經(jīng)7例；粘連性質(zhì)為膜性8例，纖維性26例，肌性5例；輸卵管開口雙側(cè)可見21例，一側(cè)可見 13例，雙側(cè)不可見 5例；子宮發(fā)育正常 28例，合并子宮發(fā)育不良或子宮發(fā)育異常11例；刮宮次數(shù)＜3次者33例，≥3次者6例。正常子宮內(nèi)膜組織取自同期輸卵管性不孕患者診刮子宮內(nèi)膜組織，正常子宮內(nèi)膜組織26例，年齡27～40歲，中位年齡為32歲，診刮病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜增殖期 12例，分泌期14例。

1.2 試劑與儀器鼠抗人單克隆抗體ArhGAP29 （1∶500，NOVUS，Australia），兔抗人 E-cadherin多克隆抗體（1∶200，Abcam，USA），PV 9000兩步法染色試劑及濃縮型 DAB試劑盒（北京中杉金橋公司），60℃烤箱、二甲苯、乙醇、EDTA、高壓鍋、濕盒、倒置顯微鏡（OLYMPUS，JAPAN）。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用 PV 9000兩步法，組織切片5μm厚，脫蠟水化后采用 EDTA（pH9.0）修復(fù)抗原；3%H2O2去離子水孵育10 min，滴加一抗，ArhGAP29、E-cadherin抗體稀釋比例分別為1∶500、1∶200，4℃過夜，滴加聚合物增強(qiáng)劑（polymer helper）孵育20 min，滴加二抗（polyperoxidase）孵育后應(yīng)用 DAB溶液顯色。

1.4 結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果根據(jù) Remmele和Stegner提出的免疫組化反應(yīng)評分（immunoreactive score，IRS）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀：IRS＝染色強(qiáng)度 ×陽性細(xì)胞百分比。ArhGAP29蛋白以細(xì)胞核周呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞，E-cadherin蛋白以細(xì)胞膜呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞，著色境界清晰，突出于背景。染色強(qiáng)度評分：0分為（－）、1分為（＋）、2分為（?）、3分為（?）。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分、1%～50%陽性細(xì)胞為2分；51% ～100%陽性細(xì)胞為3分。每個切片隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行評分，其平均值作為此樣本的最終 IRS［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)性變量組間均值采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，分析蛋白表達(dá)與 IUAs患者臨床因素的相關(guān)性采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)采用 Spearman相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α＝0.05。

2 結(jié)果

2．1 ArhGAP29、E-cadherin在正常組及 IUAs子宮內(nèi)膜中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，ArhGAP29多表達(dá)在核周胞質(zhì)中，并呈點(diǎn)狀模式，子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)上皮細(xì)胞均有表達(dá)（圖1）；E-cadherin陽性多位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞膜，細(xì)胞與細(xì)胞間的連接處較為明顯（圖2）。ArhGAP29、E-cadherin在正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的 IRS分別為6.36±2.16、7.71±1.51；在 IUAs患者子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的IRS分別為 2.62±1.55、2.79±1.28，低于正常組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.017，P＝0.004）。

2．2 ArhGAP29、E-cadherin表達(dá)與 IUAs臨床病理特征的關(guān)系中度及重度 IUAs患者中，Arh-GAP29表達(dá)的 IRS分別為 3.18±1.62、1.88± 1.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.020）；E-cadherin表達(dá)的IRS分別為3.43±1.20、1.88±0.72，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.026）。在非閉經(jīng)及閉經(jīng) IUAs患者中，ArhGAP29表達(dá)的 IRS分別為2.81±1.58、1.71 ±1.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.019）；E-cadherin表達(dá)的IRS分別為3.03±1.28、1.71±0.49，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.031）。E-cadherin表達(dá)的 IRS在膜性、纖維性及肌性粘連中分別為3.88±1.73、2.65±1.02及 1.80±0.45，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.008）；其IRS在輸卵管開口雙側(cè)可見、單側(cè)可見及雙側(cè)不可見的患者中分別為 3.29±1.31、2.31± 0.95及 2.00±1.23，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＝0.027）。提示ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)同 IUAs的嚴(yán)重程度及患者是否閉經(jīng)有關(guān)，重度及閉經(jīng)患者

圖1 ArhGAP29在不同子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，PV 9000兩步法：A.正常子宮內(nèi)膜；B.中度IUAs；C.重度IUAs

圖2 E-cadherin在不同子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，PV 9000兩步法：A.正常子宮內(nèi)膜；B.中度 IUAs；C.重度 IUAs其蛋白表達(dá)水平較低；E-cadherin的表達(dá)同刮宮次數(shù)、粘連性質(zhì)及輸卵管開口情況亦可能有相關(guān)性，刮宮次數(shù)≥3次、肌性粘連及雙側(cè)輸卵管開口不可見的患者，其E-cadherin表達(dá)水平較低（表1）。

表1 ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)與IUAs臨床病理特征的關(guān)系

2．3 ArhGAP29、E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性將ArhGAP29與E-cadherin表達(dá)的IRS進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析顯示，兩者的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r＝0.725，P＜0.001）。

3 討論

IUAs引起的不孕、反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)、前置胎盤、胎盤粘連或胎盤植入等并發(fā)癥已嚴(yán)重威脅女性的生殖健康，由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，重度 IUAs患者治愈困難，復(fù)發(fā)率高。目前研究認(rèn)為，上皮細(xì)胞在發(fā)育過程中可能受炎癥等刺激發(fā)生 EMT過程，轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維母細(xì)胞，因此 EMT可能在 IUAs形成過程中發(fā)揮作用。

ArhGAP29是一種 GTP酶活化蛋白（GAP），是EMT發(fā)生的重要調(diào)控分子，其基因定位于人類染色體1p22.1，具有RhoA的GAP結(jié)構(gòu)域，與RhoA具有很強(qiáng)的親和力，是 RhoA活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。RhoA是小 G蛋白超家族的亞族成員，具有 GTP酶活性，是細(xì)胞表面受體同胞內(nèi)多種信號蛋白的中介。ArhGAP29可使RhoA由GTP限制型轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP限制型而失活，進(jìn)一步影響下游效應(yīng)分子 ROCK，調(diào)節(jié)細(xì)胞動力學(xué)和肌動蛋白細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞分裂及細(xì)胞周期，改變上皮細(xì)胞極性的穩(wěn)定性，參與 EMT過程的調(diào)控［9］。本組免疫組化結(jié)果顯示，ArhGAP29在子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)上皮細(xì)胞均有表達(dá)，并呈點(diǎn)狀模式表達(dá)在核周胞質(zhì)中。ArhGAP29在 IUAs患者子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)低于正常子宮內(nèi)膜組織中的蛋白表達(dá)水平，提示在 IUAs的發(fā)病過程中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞骨架的改變，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化改變。

E-cadherin是鈣依賴性的跨膜蛋白，普遍存在于上皮細(xì)胞、胎盤及間胚層細(xì)胞中，主要介導(dǎo)同一種細(xì)胞之間的黏附，多表達(dá)在細(xì)胞與細(xì)胞連接處。對于維持上皮細(xì)胞的極性、完整性及細(xì)胞分化非常重要［10］。發(fā)生 EMT的上皮細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物增多，加強(qiáng)細(xì)胞接觸的 E-cadherin及 β-連環(huán)蛋白等表達(dá)降低［11］，本組結(jié)果顯示E-cadherin的陽性多位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞膜，細(xì)胞與細(xì)胞間的連接處較為明顯，其在 IUAs子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織，與 Li等［2］在動物 IUAs實(shí)驗(yàn)中結(jié)論一致。

ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)與 IUAs的嚴(yán)重程度及患者是否閉經(jīng)有關(guān)，重度及閉經(jīng)患者其蛋白表達(dá)水平較低；E-cadherin的表達(dá)同刮宮次數(shù)、粘連性質(zhì)及輸卵管開口情況亦顯示出相關(guān)性，刮宮次數(shù)≥3次、肌性粘連及雙側(cè)輸卵管開口不可見的患者，其E-cadherin表達(dá)水平較低。提示機(jī)械刺激越大，子宮內(nèi)膜的損傷程度越重，子宮內(nèi)膜發(fā)生 EMT細(xì)胞骨架改變的概率和程度就越大。IUAs臨床診療中國專家共識也強(qiáng)調(diào)了殘留子宮內(nèi)膜面積對于治療反應(yīng)的重要性，并指出對于內(nèi)膜嚴(yán)重破壞、幾乎沒有正常內(nèi)膜殘存的重度 IUAs患者，藥物治療反應(yīng)較差［12］，從而也提示正常內(nèi)膜越少，越有可能發(fā)生分子水平病變，導(dǎo)致其內(nèi)膜反應(yīng)性及修復(fù)能力差。

子宮內(nèi)膜纖維化是導(dǎo)致IUAs預(yù)后不良的關(guān)鍵原因，組織損傷修復(fù)過程中，多種細(xì)胞（如上皮細(xì)胞、周細(xì)胞等）可通過EMT轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，使其成為纖維化疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道提示子宮內(nèi)膜纖維化的形成與 EMT關(guān)系密切，但其分子機(jī)制仍未闡明。本組結(jié)果顯示，ArhGAP29與 E-cadherin表達(dá)呈顯著性正相關(guān)，提示在IUAs形成過程中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞中ArhGAP29、E-cadherin的表達(dá)量降低協(xié)同發(fā)揮作用，促使細(xì)胞骨架改變、內(nèi)膜細(xì)胞極性及完整性破壞，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的纖維化改變。深入分析子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制，有助于尋找子宮內(nèi)膜纖維化改變的重要分子靶點(diǎn)，從而為逆轉(zhuǎn)或減輕 IUAs纖維化病變提供新的診療思路。

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Expression and significance of ArhGAP29 and E-cadherin in intrauterine adhesions of endometrium

XU Qian，DUAN Hua，WANG Sha，GAN Lu，F(xiàn)U Feng-xian，TANG Yi-qun
（Department of Gynecology Minimally Invasive Center，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100006，China）

PurposeTo investigate the expression and significance of ArhGAP29 and E-cadherin in endometrial tissue of intrauterine adhesions（IUAs）and to explore their roles in the pathogenesis of IUAs.MethodsThe expression of ArhGAP29 and E-cadherin was detected by immunohistochemical PV 9000 two-step method.The correlation between ArhGAP29 and E-cadherin expression and clinical features was analyzed.Results（1）The immunoreactive score（IRS）of ArhGAP29 and E-cadherin in normal endometrial tissuewere higher than those in IUAs endometrial tissue（P＝0.017，P＝0.004）.（2）IRS of Arh-GAP 29 and E-cadherin in moderate IUAs patients were higher than that in severe IUAs patients（P＝0.020，P＝0.026）.In IUAs patientswithout amenorrhea，the IRSof ArhGAP29 and E-cadherin were higher（P＝0.019，P＝0.031）than that in IUAs patients with amenorrhea.（3）The decrease of ArhGAP29 expression had a significantly parallel relationship with the negative expression of E-cadherin（r＝0.725，P＜0.001）.ConclusionThe expression of ArhGAP29 and E-cadherin decreases in endometrial tissue of IUAs patients，which is related with degree of IUAs severity.ArhGAP29 and E-cadherinmay participate in the IUAs formation.

intrauterine adhesions；ArhGAP29；E-cadherin；epithelial-mesenchymal transition；immunohistochemistry

R 711.74

A

1001－7399（2017）01－0004－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.002

接受日期：2016－11－12

國家科技支撐計(jì)劃（2014BAI05B03）、首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（2014-1-2112）、北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（ZYLX201406）

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京100006

徐 倩，女，博士研究生。Tel：（010）52277666，E-mail：qyxuqian1989＠163.com 段 華，女，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：duanhuasci＠163.com