李進波++萬丙良++方國成++戚華雄

摘要：增加穗粒數(shù)是提高水稻產(chǎn)量的有效途徑，為了培育高產(chǎn)中熟粳稻新品系，采用回交育種并結(jié)合分子標記輔助選擇技術(shù)，將感溫型大穗品系HK05418的大穗基因Gn1a導入到感光型優(yōu)質(zhì)晚粳品種秀水134中。在BC2F4代得到農(nóng)藝性狀穩(wěn)定、等位基因純合、早熟且每穗粒數(shù)、單株產(chǎn)量顯著優(yōu)于秀水134的穩(wěn)定株系C3068。

關鍵詞：粳稻；Gn1a基因；分子標記輔助選擇；穗粒數(shù)

中圖分類號：S330 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.005

Study on Improving Grain Number of Japonica Rice by Using Gn1a Gene

YIN De-suo，LI Jin-bo，WAN Bin-liang，F(xiàn)ANG Guo-cheng，QI Hua-xiong

（Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China）

Abstract： Increasing grain number is a reliable way to abstain high yield of rice. In order to develop new japonic lines possessing high yield potential，the Gn1a MAS（molecular assistant selection） assay was carried out，the null allele of Gn1a in HK05418 was transferred to the target variety，Xiushui 134. By backcrossing，inbreeding，screening and selecting，a new line C3068 from BC2F4 was identified as more early maturing and high yield than the control variety Xiushui 134.

Key words： japonica rice； Gn1a gene； molecular assistant selection； grain number

水稻（Oryza sativa L.）高產(chǎn)一直是育種者追求的目標。水稻的單位面積產(chǎn)量由單位面積內(nèi)的有效穗（分蘗數(shù)）、穗粒數(shù)、結(jié)實率及粒重（粒型）共同組成。與水稻分蘗能力和粒重、粒型相關的主效基因近年不斷被報道，例如控制粒型和粒重的GS3[1]、GW2[2]、GW5[3]、GW8[4]、GW7[5]等，控制分蘗數(shù)的MOC1[6]，控制穗粒數(shù)的Ghd7[7]和Gn1a[8]等。這些主效基因的鑒定和克隆，使得利用分子標記輔助選擇來進行水稻產(chǎn)量性狀的改良成為了可能。

近年來，隨著人們生活水平的提高，由于品質(zhì)和口感較好，粳稻發(fā)展較快，種植區(qū)域已經(jīng)從東北向華東、華中、華南地區(qū)延伸[9]。湖北省在繼江蘇、安徽等省進行“秈改粳”后，也開始了水稻的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整。20世紀70年代，湖北粳稻由于產(chǎn)量潛力較低而逐漸被雜交秈稻取代，鑒于此，要擴大湖北省粳稻種植面積，需要培育適應湖北省稻區(qū)光溫條件、產(chǎn)量潛力更高的新品種。

Gn1a基因編碼細胞分裂素氧化酶，可以降低幼穗原基中分裂素的表達水平，從而減少穗部穎花數(shù)量，而Gn1a基因功能缺失的單倍型會導致穗粒數(shù)增多[8]。本研究針對粳稻的產(chǎn)量性狀，利用設計的Gn1a基因分子標記，篩選Gn1a基因功能缺失的粳稻種質(zhì)資源，采用雜交育種并結(jié)合分子標記選擇的方法，將目的基因?qū)胧荏w品種，對優(yōu)良品種進行穗粒數(shù)改良，旨在提高產(chǎn)量潛力，培育粳型中稻新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

HK05418為湖北省農(nóng)業(yè)科學院育成的感溫型大穗粳稻品系，作為大穗型Gn1a基因供體親本；秀水113、秀水134為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學院育成的優(yōu)質(zhì)感光型晚粳品種，對稻瘟病抗性較好，分蘗較多，中小型穗型；秀水519為嘉興市農(nóng)業(yè)科學院育成的早熟優(yōu)質(zhì)粳稻品種，作為生產(chǎn)對照材料；上海粳1號和上海粳2號為上海市農(nóng)業(yè)科學院育成的優(yōu)質(zhì)晚粳品系，用作引物篩選。

1.2 引物設計

根據(jù)Ashikari等[8]報道的Gn1a基因編碼區(qū)的突變位點，在缺失突變區(qū)的兩端設計PCR擴增引物，經(jīng)過引物篩選，選擇分辨率較高的擴增引物作為該性狀的候選分子標記。

1.3 基因檢測方法

采用改良的CTAB法[10]提取水稻葉片總DNA。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應在PE公司9700型熱循環(huán)儀上進行，擴增反應物的總體積為15 μL，其中包括1×PCR緩沖液，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各為50 pmol，水稻基因組DNA 1.5 ng/μL，Taq酶1 U（TaKaRa公司產(chǎn)品）。反應程序為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于6%非變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染操作參照李進波等[11]的改良方法。

1.4 產(chǎn)量性狀調(diào)查

考察單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和實粒數(shù)，并統(tǒng)計結(jié)實率。統(tǒng)計小區(qū)的播始歷期和單株的實收產(chǎn)量。

1.5 米質(zhì)分析

主要統(tǒng)計糙米的堊白粒率和堊白度，觀察比較米粒的透明度和油分、光澤等品質(zhì)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gn1a基因分子標記在親本材料中的多態(tài)性

用primer 3.0的在線引物設計程序，根據(jù)目標基因編碼區(qū)內(nèi)的缺失突變位點，設計了PCR擴增引物（Gn1aF：5′gctatctatcagctgccttc3′，Gn1aR：5′cctgctctt gcttcattatc3′）。用所設計的引物在大穗品系HK05418和小穗型品種秀水113、秀水134、上海粳1號、上海粳2號等品種間進行多態(tài)性驗證，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠5 V/cm電壓分離，不含Gn1a基因的小穗型品種擴增出了較大的產(chǎn)物條帶（日本晴參考序列為167 bp，圖1），而大穗品系HK05418擴增出較小的PCR產(chǎn)物條帶（圖2）。

2.2 分離群體的標記檢測

將秀水134/HK05418組合F2分離世代的單株表型和基因型進行對比驗證，結(jié)果表明，含大穗基因型（Gn1a）單株的平均穗粒數(shù)為187.8～205.6粒，明顯多于小穗基因型（gn1a）單株的129.2～162.8粒，即基因型與表型共分離，證明Gn1a基因確實是該分離群體中控制穗粒數(shù)的主效基因（圖3）。

2.3 大穗材料的培育

2009年夏季在武漢配制秀水134/HK05418的F1組合，2010年春在海南、2010年夏在武漢連續(xù)用秀水134作為母本進行回交，得到BC2F1，然后連續(xù)自交。在上述回交和自交世代采用標記輔助選擇，選擇含大穗Gn1a基因型的單株進行回交和自交，于2012年夏得到目標基因純合、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的BC2F4家系。

在自交世代，除了進行大穗性狀選擇，同時進行生育期的選擇。由于秀水134是晚粳品種，發(fā)育特征表現(xiàn)為較強的感光性，而HK05418為感溫性品種，兩者雜交后代出現(xiàn)了感溫性和感光性的分離，攜帶發(fā)育感溫基因的單株在海南生育期較長，而在武漢則較短；攜帶感光發(fā)育基因的單株則相反。針對熟期進行單株選擇的策略是在海南選擇長熟期（感溫型）單株，在武漢選擇短熟期單株，以此方法淘汰掉含有發(fā)育感光基因型的單株。再經(jīng)自交穩(wěn)定后，育成適合湖北省稻區(qū)的大穗、早熟、矮稈的粳型中稻新品系C3068（圖4）。

2.4 綜合農(nóng)藝性狀評價

與親本對照相比，育成的大穗新品系株高較低，熟期較早，穗粒數(shù)較多（圖5，表1），達到了品種改良的主要目的。新品系外觀品質(zhì)明顯優(yōu)于HK05418，接近秀水134（圖6）。

經(jīng)過2013-2014年武漢和仙桃兩地品種比較試驗表明，新品系豐產(chǎn)性較好，結(jié)實率與對照品種相比略低，但每穗實粒數(shù)和單株實粒數(shù)明顯高于對照（表1）。

2.5 稻瘟病抗性鑒定

2013年將大穗粳稻新品系在宜昌和恩施病區(qū)進行稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明，新品系的葉瘟和穗瘟抗性達到抗和中抗水平，與對照水平相當（表2）。

3 討論

本研究采用自行設計的Gn1a基因的分子標記，對優(yōu)質(zhì)晚粳品種秀水134進行穗粒數(shù)改良，同時對熟期和抗性進行了篩選，得到了大穗、早熟、矮稈、抗稻瘟病的優(yōu)質(zhì)粳型中稻新品系。研究結(jié)果表明，通過Gn1a基因的分子標記輔助選擇進行穗粒數(shù)改良是有效的。

水稻產(chǎn)量一般由單位面積內(nèi)穗數(shù)、平均穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等因子決定，而這些產(chǎn)量決定因子都是由數(shù)量性狀基因控制的，傳統(tǒng)的育種方法很難進行有效的后代選擇，必須借助于可靠的標記選擇。同時，各個因子間也會存在復雜的互作和協(xié)同變化現(xiàn)象，例如，穗粒數(shù)增加可能會導致結(jié)實率下降；生育期縮短會導致分蘗數(shù)和穗粒數(shù)的下降。因此，在利用分子標記進行目標性狀的選擇時，兼顧其他相關性狀的變化及選擇仍然非常重要。同時保證一定規(guī)模的選擇群體也是必要的，這樣為打破不利連鎖提供了可能。

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