邢亞群，陳衛(wèi)東

·論著·

HPLC-UV測(cè)定法測(cè)定多西他賽注射液藥物含量

邢亞群1，2，陳衛(wèi)東1

目的：建立HPLC-UV法測(cè)定多西他賽注射劑中多西他賽含量。方法:采用 COSMOSIL 5C18-MS-II色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，以0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。結(jié)果: 在選定條件下，多西他賽峰與內(nèi)標(biāo)紫杉醇峰分離良好，兩者峰面積之比與多西他賽濃度在0.5～32 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，r=0. 9999；平均回收率在100.1%～103.9%，RSD<3.7%。結(jié)論:經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，該方法可用于多西他賽注射液中藥物含量測(cè)定。

多西他賽; 紫杉醇; 含量測(cè)定； 高效液相色譜法

多西他賽是已上市的一種紫杉烷類抗癌藥物，主要通過破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂而達(dá)到抗腫瘤效果[1]。多西他賽作為第二代的紫衫烷類藥物，具有廣泛的抗腫瘤活性，多西他賽對(duì)乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等都有良好的臨床療效[2]。目前臨床上多將多西他賽與順鉑、奧曲肽、奧沙立鉑[3-5]等抗癌藥物聯(lián)合使用，來增強(qiáng)治療效果。但多西他賽也能引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制、過敏反應(yīng)、體液潴留、脫發(fā)、乏力、黏膜炎、關(guān)節(jié)痛或肌肉痛、低血壓、胃腸道反應(yīng)與惡心、嘔吐或腹瀉等[6-7]。盡管多西他賽在臨床上較為常用，但其價(jià)格比較昂貴，為指導(dǎo)其臨床用藥安全和合理用藥，本實(shí)驗(yàn)以紫杉醇為內(nèi)標(biāo)，采用HPLC-UV法測(cè)定多西他賽注射液中多西他賽含量，建立了注射用多西他賽含量的方法，從而對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督和檢測(cè)。且該方法能準(zhǔn)確測(cè)定出多西他賽注射液中多西他賽含量，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SPD-15C島津高效液相色譜儀(日本島津公司,批號(hào)465-04200)，G1314A型VWD紫外檢測(cè)器；AB135-S型十萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；XW-80A微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；BCD-225CHC冰箱(合肥美菱股份有限公司)，Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)(密理博(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.2 試劑 多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)626150205)；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100382-201102，純度99.6%)；多西他賽注射液(齊魯制藥有限公司，規(guī)格：1 mL:40 mg,批號(hào)5030021TB)；甲醇(色譜醇，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，批?hào)021141201)；乙腈(色譜純,天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司)；磷酸為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q超純水機(jī)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 COSMOSIL 5C18-MS-II色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精密稱取多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品1.10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻，即得濃度為110 μg/mL的多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，逐級(jí)稀釋配成0.5 μg/mL,1 μg/mL,2 μg/mL,4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL,32 μg/mL的溶液各1100,550,550,550,550,550,550 μL，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為100 μg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 多西他賽供試品的配制 精密移取多西他賽注射液10 μL，用流動(dòng)相稀釋至25 μg/mL，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 專屬性考查 在一定的條件下，取空白輔料加紫杉醇對(duì)照品溶液，空白輔料加多西他賽和紫杉醇對(duì)照品溶液，多西他賽注射液加紫杉醇對(duì)照品溶液，前處理過后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。進(jìn)樣前過0.22 μm濾膜過濾。色譜圖見圖1，輔料，紫杉醇對(duì)照品在多西他賽峰處無干擾。

A:多西他賽注射液加紫杉醇對(duì)照品樣本；B:空白輔料加多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品和紫杉醇對(duì)照品樣本；C:空白輔料加紫杉醇對(duì)照品樣本。圖1 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 于1.5 mLEP管中依次精密加入按“2.2.1”配制好的多西他賽標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度分別為0.5 μg/mL,1 μg/mL,2 μg/mL,4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL,32 μg/mL，并依次加入22 μL，11 μL,11 μL，11 μL，11 μL,11 μL，11 μL內(nèi)標(biāo)紫杉醇溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以多西他賽的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，多西他賽的濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。測(cè)定供試品中多西他賽的線性范圍。得到回歸方程為：y=0.242x-0.02129(r=0.9999),結(jié)果表明：在0.5～32μg/mL范圍內(nèi)，多西他賽濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度 按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍，于1.5 mLEP管中分別加入適量空白輔料，依次精密加入不同濃度的多西他賽標(biāo)準(zhǔn)工作液及紫杉醇溶液，制備成高、中、低濃度(27.2，22.0，13.2 μg/mL)的多西他賽樣品，各6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。各濃度與內(nèi)標(biāo)的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為1.20%，1.20%，3.74%。

2.5.1 重復(fù)性 取同一批供試品，用甲醇溶液(批號(hào)：021150303)平行配置成25 μg/mL的樣品6份，按2.1的色譜條件，依次進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得平均含量(標(biāo)示量%)為114.41%，RSD為0.22%。

2.5.2 中間精密度 取同一批供試品，由不同分析人員，在不同實(shí)驗(yàn)室照2.5.1下的方法，按2.1的色譜條件，依次進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得平均含量(標(biāo)示量%)為109.16%，RSD為0.96%。

2.6 回收率 按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍，于空白輔料中加入適量的多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品工作液和紫杉醇溶液用流動(dòng)相配制成高、中、低、濃度(30.0，20.0，10.0μg/mL)的樣品，各6份，經(jīng)處理后依次進(jìn)樣測(cè)得多西他賽峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，多西他賽峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值對(duì)應(yīng)的多西他賽濃度和真實(shí)濃度的比值即為該儀器方法的回收率。按內(nèi)標(biāo)法分別測(cè)定并計(jì)算回收率及RSD。平均回收率分別為：103.07%，103.92%，109.78%；RSD分別為：3.48%，4.12%，4.05%。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍，取“2.5.1”項(xiàng)下制備的25 μg/mL的樣品，置于室溫下，于不同時(shí)間(0,2,4,6,8，16,24 h)分別依次進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明RSD均小于1%。

3 多西他賽含量測(cè)定

按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍，取“2.2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，平行進(jìn)樣三次，結(jié)果各批樣品中多西他賽標(biāo)示百分含量分別為94.50%，109.78%，109.16%。結(jié)果表明，多西他賽含量符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

4 討論

4.1 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 通過查閱文獻(xiàn)得知，大部分文獻(xiàn)表明多西他賽在220～240 nm波長(zhǎng)段有最大紫外吸收[8-11]，其中，謝玲玲等[12]通過紫外全波長(zhǎng)掃描后確定出230 nm為多西他賽檢測(cè)波長(zhǎng)，而內(nèi)標(biāo)紫杉醇則在227 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，本實(shí)驗(yàn)綜合這兩項(xiàng)結(jié)果，分別測(cè)定了在230 nm和227 nm兩處的出峰情況，結(jié)果表明在230 nm處，多西他賽與紫杉醇分離度最好，多西他賽響應(yīng)值最高，出峰時(shí)間適中。于是本實(shí)驗(yàn)選擇230 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 流動(dòng)相的選擇 剛開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選擇先檢測(cè)出多西他賽的出峰條件，依據(jù)劉芳、王淑君等[13]的研究,分別嘗試了用甲醇-水70：30、甲醇-水80:20做流動(dòng)相，結(jié)果表明無論在兩者中的哪一個(gè)出峰條件下，多西他賽都能與甲醇峰完好分離，完全出峰且峰型良好，并且出峰時(shí)間適中。但加入內(nèi)標(biāo)紫杉醇與多西他賽混合溶液后，兩者在上述條件下不能完全分離，于是選擇調(diào)動(dòng)有機(jī)相比例，但基本還是無法完全分離。后來嘗試根據(jù)王麗麗、陳蘭、吳瓊等[14-16]的研究,選用乙腈-水做流動(dòng)相，調(diào)整到合適比例乙腈-水50：50后，雖然兩者能完全分離，但是峰型拖尾嚴(yán)重，考慮選擇在水相中加入0.1%的磷酸改善峰型，結(jié)果兩者能完全分離且峰型完美，基本無拖尾現(xiàn)象?；谝陨咸剿鳁l件，最終確定選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相，洗脫類型為等度洗脫。

4.3 內(nèi)標(biāo)的選擇 通過查閱文獻(xiàn)得知，大部分藥物含量測(cè)定都沒有用到內(nèi)標(biāo)，但為了使含量測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確，盡量消除實(shí)驗(yàn)操作條件的干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇了內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行多西他賽的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，多西他賽是紫杉醇類抗腫瘤藥物，是從漿果紫杉針葉中提取的前體物再經(jīng)半合成改造而成，其基本結(jié)構(gòu)類似紫杉醇[17]，與紫杉醇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)基本相同，所以選擇紫杉醇作為多西他賽含量測(cè)定的內(nèi)標(biāo)。

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Determination of docetaxel in docetaxel injection by HPLC-UV

XINGYa-qun,CHENWei-dong.

(CollegeofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei,Anhui230038,China)

Objective:To establish an HPLC-UV method for determining docetaxel in docetaxel injection．Methods:The separation was performed on the COSMOSIL 5C18-MS-II (4.6mm×250mm,5μm).The mobile phase consisted of 0.1%mol/L phosphoric acid (A) and acetonitrile (B) with an isocratic elution at a flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃，and the detection wavelength was at 230 nm.Results:Under the described condition,docetaxe was completely separated from paclitaxel.Good linear relationship was observed between the peak area ratio of docetaxel and paclitaxel and concentration in the range of 0.5～32μg/mL，r= 0.9999.The average recovery of docetaxel ranged from 100.1% to 103.9%.The relative standard deviations were less than 3.7%.Conclusion:It is confirmed by the methodology validation that the quantification method is applicable to the quality control of docetaxel of docetaxel for injection．

Docetaxel; Paclitaxel; Content determination; HPLC

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230038；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)學(xué)院 藥劑科，安徽 蚌埠 233000

邢亞群(1972-)，女，副主任藥師，大學(xué)。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.02.007

R 927.2

A

1008-7044(2017)02-0142-03

2016-10-27)