楊宇峰，曹 彬

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

【實驗研究】

痰瘀互結(jié)證代謝綜合征動物模型復(fù)制方法研究*

楊宇峰，曹 彬

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

目的:探討痰瘀互結(jié)證代謝綜合征病證結(jié)合動物模型的建立及評價。方法:選用SD大鼠采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素結(jié)合方法造模，并用二陳湯合桃紅四物湯進(jìn)行藥物反證評價模型。結(jié)果:與對照組比較，模型組血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、全血黏度、紅細(xì)胞凝集指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)均明顯升高，用二陳湯合桃紅四物湯干預(yù)后，各指標(biāo)有不同程度的改善。結(jié)論:采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素方法復(fù)制的動物模型與臨床痰瘀互結(jié)證代謝綜合征特征相似，并佐以袪痰化瘀法治療有效，證明該法成功復(fù)制了痰瘀互結(jié)證代謝綜合征病證結(jié)合動物模型。

痰瘀互結(jié);代謝綜合征;動物模型

病證結(jié)合是目前中醫(yī)臨床的重要診療模式，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因病理復(fù)制疾病模型，使模型動物同時具有西醫(yī)疾病和中醫(yī)證候的特征，建立合理、規(guī)范的病證結(jié)合動物模型，有利于全面、客觀地揭示中醫(yī)病證科學(xué)內(nèi)涵，已成為中醫(yī)證候生物學(xué)研究發(fā)展的新方向［1］。

痰瘀互結(jié)是代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)的重要病機(jī)，痰瘀二者既各自獨立又互為因果，貫穿疾病的始終，構(gòu)成了本病發(fā)生發(fā)展的核心［2］，而對其動物模型的研究鮮有報道。我們根據(jù)病證結(jié)合的研究思路，通過高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的多因素造模法，并用二陳湯合桃紅四物湯進(jìn)行藥物反證評價模型，以探討痰瘀互結(jié)證代謝綜合征模型的建立。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心提供(動物合格證號SCXK(遼)2004-0018)。實驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，自由飲水，無不良反應(yīng)，進(jìn)食、飲水和活動正常者納入實驗。動物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，室內(nèi)自然采光，通風(fēng)良好，實驗室全程保持室溫(20±3.0)℃，濕度40%，明暗周期12 h。

1.2 藥物與飼料

二陳湯合桃紅四物湯(半夏、陳皮、茯苓、甘草、當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍、桃仁、紅花)由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心制備，生藥含量4.0 g/mL。高脂高糖飼料由1%膽固醇、1%丙硫氧嘧啶、20%砂糖、10%玉米油、8%蛋黃粉和60%基礎(chǔ)飼料混合而成。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20061011)、鏈脲佐菌素(北京邦定泰克生物技術(shù)公司，STZ-S0130)、人胰島素(INS，ELISA試劑盒:美國ADL公司，RT-110371)。電子天平(大連星海電子衡器有限公司MODELDS-671)，全自動生化分析儀(日本日立7600型)，TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，全自動血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)型)，全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司LBY-N6COMPACT型)。

2 方法

2.1 分組與造模

60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白對照組、模型組、治療組3組各20只。模型組給予高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)12周，第4周行腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)1次?？瞻讓φ战M普通飼料喂養(yǎng)12周，第4周行腹腔注射以等量檸檬酸鈉緩沖液1次。治療組選擇造模成功的大鼠，按大鼠體質(zhì)量灌胃中藥(1 mL/100 mg)，每日1次，共4周。

2.2 標(biāo)本采集

模型組和空白對照組第12周后，治療組灌服中藥4周后進(jìn)行標(biāo)本采集。所有標(biāo)本采集前禁食12 h，空腹眶后靜脈取血，以3000 r/min、4℃離心10 min分離血清，分別送檢。

2.3 檢測項目和方法

2.3.1 肥胖相關(guān)指標(biāo) 測量體質(zhì)量、體長，計算 Lee's指數(shù) =(體質(zhì)量 ×1000)^(1/3)/體長(cm)［3］。

2.3.2 實驗室指標(biāo) 空腹血糖由全自動血糖儀測定，血流流變學(xué)由全自動血液流變儀測定，血脂由全自動生化分析儀測定?？崭寡逡葝u素(FINS)采用酶聯(lián)免疫法檢測，胰島素敏感指數(shù)(ISI)采用李光偉［4］計算方法，以空腹血糖與空腹胰島素乘積倒數(shù)的自然對數(shù)表示，即ISI=Ln1/(FPG ·FINS)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)平均數(shù)之間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

模型組經(jīng)高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素注射干預(yù)后4只大鼠未成模，治療組灌服中藥過程中和空白對照組各有1只大鼠死亡。

3.1 一般狀態(tài)

造模后模型表現(xiàn)出食少懶動、體質(zhì)量增加、嗜睡、乏力倦怠、體毛光亮度減退、尾巴青紫等痰瘀互結(jié)癥狀。

3.2 血液流變學(xué)結(jié)果

表1顯示，模型組血漿比黏度、全血比黏度、血沉、紅細(xì)胞壓積、血漿纖維蛋白原、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);治療組以上指標(biāo)均顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血液流變學(xué)變化比較(±s)

表1 各組大鼠血液流變學(xué)變化比較(±s)

注:與對照組比較:△P＜0.05;與模型組比較:#P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 血漿比黏度(mPa·s)紅細(xì)胞聚集指數(shù)對照組 19 1.09±0.12 5.32±1.21 1.83±0.09 37.14±2.67全血比黏度(mPa·s)血沉(mm/h)紅細(xì)胞壓積(%)血漿纖維蛋白原(g/L) 3.71±0.96 2.13±0.08模型組 16 1.86±0.06△ 9.65±2.68 4.37±1.06△ 57.18±3.76△ 5.34±2.28△ 3.84±1.06△治療組 15 1.50±0.04# 8.93±1.74# 3.83±0.08# 41.90±2.53# 4.16±1.62# 2.43±0.09#

3.3 血糖、血脂結(jié)果

表2顯示，模型組空腹血糖、餐后2 h血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白均明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);治療組以上指標(biāo)均顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血糖、血脂的變化比較(±s，mmol/L)

表2 各組大鼠血糖、血脂的變化比較(±s，mmol/L)

注:與對照組比較:△P＜0.05;與模型組比較:#P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 空腹血糖 餐后血糖 甘油三酯 低密度脂蛋白 總膽固醇對照組 19 5.63±2.80 8.71±2.37 0.75±0.04 2.14±0.18 3.12±0.81模型組 16 12.74±7.62△ 18.38±8.10 1.86±0.09△ 3.60±1.72△ 5.67±2.70△治療組 15 6.18±2.56# 10.59±4.13# 0.82±0.08# 2.33±0.74# 3.65±1.02#

3.4 肥胖相關(guān)指標(biāo)及胰島素、胰島素敏感指數(shù)變化比較

表3顯示，模型組體質(zhì)量、Lee's指數(shù)及血清胰島素顯著升高，胰島素敏感指數(shù)顯著下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);治療組體質(zhì)量、Lee's指數(shù)及血清胰島素明顯降低，胰島素敏感指數(shù)明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清胰島素及胰島素敏感指數(shù)變化比較(±s)

表3 各組大鼠血清胰島素及胰島素敏感指數(shù)變化比較(±s)

注:與對照組比較:△P＜0.05;與模型組比較:#P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 體質(zhì)量(g) Lee's指數(shù)(g/cm) INS(mu/L)ISI對照組 19 304.13±23.80 198.40±16.38 26.41±18.26 －5.52±0.68模型組 16 438.74±37.12△ 376.27±20.34△ 43.60±26.74△ －9.88±2.37△治療組 15 343.45±28.20# 310.61±19.28# 29.54±20.73# －6.20±1.84#

4 討論

痰瘀互結(jié)是MS的重要病機(jī)，貫穿于本病全程。痰濁是MS形成的病理基礎(chǔ)，MS患者由于飲食過多、喜嗜膏梁厚味、過逸少動易壅滯中焦之氣，有礙脾胃升降，樞機(jī)不得斡旋，運化失職，水濕不化，津液不布，痰濁內(nèi)生，痰濁邪氣隨氣血周流，引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)各種代謝功能紊亂，從而表現(xiàn)為MS的各種證候?，F(xiàn)代研究證明，痰濁多反映現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的高脂血癥和高凝狀態(tài)，而高血脂和高凝狀態(tài)正是MS的最主要危險因素［5］。痰證患者多存在脂質(zhì)代謝紊亂，血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白異常升高［6］。血糖與中醫(yī)證素痰的關(guān)系也較密切，痰濁從病理機(jī)制上與西醫(yī)胰島素抵抗有一致性［7］，胰島素抵抗的病理過程正是“化失其正，則臟腑病，津液敗，而血氣即成痰涎”的痰濁形成過程［8］。由此可見，MS與“痰”無論在發(fā)病原因還是致病機(jī)理上都有密切關(guān)系。瘀血是MS發(fā)展的關(guān)鍵因素，瘀血與痰濕具有相關(guān)性。正如虞摶《醫(yī)學(xué)正傳》中指出:“津液稠黏，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁?！别鲅铚绊懥伺K腑功能和水谷精微的正常代謝，又進(jìn)一步加重痰濕形成惡性循環(huán)、膠結(jié)不解，最后累及各個系統(tǒng)。可見，“痰濕內(nèi)盛，血濁為瘀”痰瘀互結(jié)是MS病機(jī)演變的核心。文獻(xiàn)報道指出，臨床血瘀證患者存在血糖、血脂、血液流變學(xué)、纖溶及血管內(nèi)皮系統(tǒng)異常［9］，血瘀證與炎癥、血流動力學(xué)、血小板功能、微循環(huán)等方面密切相關(guān)［10］，其中血液流變學(xué)改變是血瘀證發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，可作為血瘀證微觀辨證的依據(jù)［11］。有學(xué)者進(jìn)一步指出，痰滯血瘀，血瘀則痰滯，痰瘀互結(jié)與血脂及血液流變各指標(biāo)呈正相關(guān)，膽固醇、甘油三酯、血漿比黏度、全血比黏度和紅細(xì)胞壓積增高，是造成痰瘀互結(jié)的生化物質(zhì)基礎(chǔ)［12-13］，體現(xiàn)了中醫(yī)“痰濁”“瘀血”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生化指標(biāo)上的聯(lián)系性。

本研究采用病證結(jié)合動物模型復(fù)制方法，根據(jù)中醫(yī)的病因病機(jī)與臨床證候，通過喂食高脂高糖飼料，致痰瘀病理產(chǎn)物形成，從病因病機(jī)學(xué)的角度模擬痰瘀互結(jié)的發(fā)生。兼顧疾病在西醫(yī)病理生理層面的客觀表現(xiàn)，通過腹腔注射鏈脲佐菌素產(chǎn)生胰島素抵抗。模型表現(xiàn)出食少懶動、體質(zhì)量增加、嗜睡、乏力倦怠、體毛光亮度減退、尾巴青紫等與該證候的臨床表現(xiàn)具有一致性。同時，模型血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、全血黏度、紅細(xì)胞凝集指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)等指標(biāo)明顯升高，與臨床痰瘀互結(jié)MS生化物質(zhì)基礎(chǔ)改變具有高度一致性。佐以袪痰化瘀法治療，能顯著改善其糖脂代謝異常和血流流變學(xué)指標(biāo)，逆轉(zhuǎn)其病理損傷，從藥物反證的角度全面評價說明痰瘀互結(jié)MS模型復(fù)制成功。

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Study on the Replication of Animal Model of Metabolic Syndrome with Phlegm and Blood Stasis Syndrome

YANG Yu-feng，CAO Bin
(Liaoning Universtity of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

Objective:To explore the establishment and evaluation of animal model of the syndrome of metabolic syndrome of phlegm and blood stasis syndrome．Methods:We made animal models through combination of high fat and high glucose diet with STZ，then disproved model through Er Chen decoction and Taohong Siwu decoction．Results:Compared with control group，blood glucose，total cholesterol，triglyceride，low density lipoprotein，whole blood viscosity，erythrocyte aggregation index and insulin sensitivity index were significantly higher in the model group．All indexes have different degrees of improvement after the intervention with Er Chen decoction and Taohong Siwu decoction．Conclusion:We have successfully established an animal model similar to the metabolic syndrome characteristics of the clinical phlegm and blood stasis syndrome．

Phlegm and blood stasis syndrome;Metabolic syndrome;Arimal moder

R-332

A

1006-3250(2017)01-0060-03

2016-06-10

遼寧省百千萬人才工程培養(yǎng)項目(遼人社〔2014〕229號)

楊宇峰(1979-)，男(回族)，遼寧凌源人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合糖尿病及代謝綜合征的臨床與研究。