范瑞娟，郭書海，李鳳梅

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016）

石油降解菌群的構(gòu)建及其對混合烴的降解特性

范瑞娟1，郭書海2，李鳳梅2

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016）

經(jīng)富集、分離、純化，并經(jīng)選擇性培養(yǎng)基的篩選和對總石油烴（TPH）降解能力的測試，從大慶油田石油污染土壤中獲得6株分別具有環(huán)烷烴、直鏈烷烴和芳烴降解能力的菌株B1、B2、B3、B6、B7和B9。經(jīng)16S rRNA基因序列比對，菌株B1、B2、B6和B7分別屬于嗜氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium sp.）、鞘脂菌屬（Sphingobium sp.）和芽胞桿菌屬（Bacillus sp.），B3和B9屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。通過對接種比例、接種量和生長條件的優(yōu)化，構(gòu)建了微生物降解菌群，并采用該菌群進行混合烴污染土壤的修復(fù)。結(jié)果表明，該菌群對三類烴的去除均具有明顯的促進作用。經(jīng)過40 d的修復(fù)，環(huán)十二烷去除率達74.5%；100 d后，正十六烷和芘的去除率分別達56.9%和60.4%。前10 d修復(fù)過程中，各污染物降解速率最大，之后則逐漸降低，與土壤微生物多樣性、數(shù)量以及活性的變化趨勢相似。

石油污染土壤；條件優(yōu)化；生物修復(fù)；微生物群落

在各種石油污染土壤修復(fù)方法中，生物修復(fù)技術(shù)以其操作簡單、處理費用低、環(huán)境影響小等優(yōu)點而受到人們的重視。多項研究證明生物修復(fù)在脂肪烴和芳香烴的降解中起著重要作用[1-3]。

生物修復(fù)效率的高低取決于多方面的因素，如微生物群落結(jié)構(gòu)、污染物類型、營養(yǎng)物質(zhì)和污染物的生物可利用性，以及土壤理化性質(zhì)，如pH、溫度和水分含量等[4]，其中微生物群落組成對石油降解效率和生物利用途徑等起著決定性的作用[5]。由于土著微生物降解速度慢，修復(fù)周期長，往往需要投加外源性微生物以加速污染物的降解[6]。然而石油是一種組成成分復(fù)雜的化合物，其中包含脂肪烴和多環(huán)芳烴等多種成分，靠單一的微生物菌種很難實現(xiàn)其完全降解。研究表明，將不同降解菌進行組合作為石油烴的降解微生物，其對石油的降解性能明顯高于單菌。Chen等[7]采用Acinetobactersp.YC-X2，Kocuriasp.YC-X 4和Kineococcus sp.YC-X 7構(gòu)建的微生物菌群對稠油污染土壤進行了修復(fù)試驗，結(jié)果表明該混合菌群比單株菌有更好的修復(fù)效果。另有研究表明，相對單菌株而言，Mycobacterium sp.和Sphingomonas sp.組合對菲的降解有促進作用[8]。僅僅接種降解菌而不添加營養(yǎng)物質(zhì)并不能使修復(fù)過程順利進行，必須為微生物提供氮、磷等營養(yǎng)元素，以改善其生長的環(huán)境條件，提高微生物的數(shù)量、多樣性和活性，才可加速污染物的降解[9]。然而有時加入營養(yǎng)物質(zhì)并不能促進有機污染物的生物降解，需要對氮、磷等營養(yǎng)水平進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)才有利于生物修復(fù)的進行[10]。石油烴可在土壤中形成獨立的非水相，不能被微生物直接利用，而使其生物可利用性減小，同時容易產(chǎn)生生物毒害[11]。表面活性劑的加入，可提高石油烴類化合物和其他一些有機化合物的生物可利用性，有助于提高微生物對其利用能力[12]。葉淑紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，非離子表面活性劑吐溫-80對微生物的繁殖和油的降解具有促進作用。

本研究擬從石油污染土壤中篩選具有直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的高效降解菌，構(gòu)建微生物降解菌群，并對影響微生物菌群的環(huán)境條件進行優(yōu)化；以正十六烷、環(huán)十二烷和芘分別作為直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴的代表性污染物，實施污染土壤中總石油烴（TPH）的修復(fù)試驗。研究結(jié)果可為石油烴類污染物的生物降解過程調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 污染物

大慶原油，其密度為0.882 g·cm-3（20℃），凝固點為25.8℃，粘度為18.9 mPa·s-1（50℃）；以環(huán)十二烷（＞99%，東京化成工業(yè)株式會社）、正十六烷（＞98%，東京化成工業(yè)株式會社）、芘（＞99%，百靈威科技有限公司）分別作為環(huán)烷烴、直鏈烷烴和芳烴的代表性污染物。

1.1.2 試驗土壤

石油污染土壤樣品采自大慶油田。試驗所采用的干凈土壤采自沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所生態(tài)站附近0～30 cm土層，其理化性質(zhì)為：pH 6.22，有機碳6.43 g·kg-1，陽離子交換量21.25 cmol·kg-1，速效氮73.43 mg·kg-1，速效磷7.23 mg·kg-1。將土壤自然風(fēng)干后過2 mm篩，再將正十六烷、環(huán)十二烷和芘均勻混入土壤中，配制成混合烴污染土壤，用于微生物修復(fù)試驗。經(jīng)氣相色譜分析，土壤中正十六烷、環(huán)十二烷和芘的實際濃度分別為4 744.54、947.22、48.81 mg·kg-1。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制參照《微生物學(xué)實驗（第4版）》[14]。

無機鹽培養(yǎng)液（g·L-1）：（NH4）2SO41.5，NaNO31.5，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，pH 7.0。

富集用無機鹽培養(yǎng)基：向上述無機鹽培養(yǎng)液中加入0.5%的石油，pH 7.0。

烷烴降解菌篩選培養(yǎng)基的配制參考Kuba等[15]的方法；芳烴降解菌篩選培養(yǎng)基參考Alley等[16]的方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解菌的篩選

石油降解菌的篩選：稱取5 g石油污染土壤，加至100 mL富集用無機鹽培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，取出5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中；相同條件下轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)3次，將培養(yǎng)液梯度稀釋后，取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，待平板上長出菌落后，挑取不同顏色、不同形態(tài)的單菌落，重新接于富集用無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)；再次進行分離，直至分離出純菌。

直鏈烷烴/環(huán)烷烴降解菌的篩選：將篩選出的石油降解菌株各挑取一環(huán)，分別接種于100 mL直鏈烷烴/環(huán)烷烴降解菌篩選培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（30℃，150 r·min-1），待培養(yǎng)液明顯渾濁后，取1 mL接種于100 mL新鮮的直鏈烷烴/環(huán)烷烴降解菌篩選培養(yǎng)基中。如此重復(fù)三次后，如仍能使培養(yǎng)液變渾濁，則為直鏈烷烴/環(huán)烷烴降解菌[17]。

芳烴降解菌的篩選：采用平板升華法[18]。

1.2.2 單株菌對TPH降解能力分析

將篩選出的各菌株進行活化，挑取一環(huán)接種于100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r· min-1振蕩培養(yǎng)24 h，取6 mL培養(yǎng)液至富集用無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)5 d，用二氯甲烷萃取培養(yǎng)基中殘留污染物3次，合并提取液。將漏斗中塞入脫脂棉，上面放置5～6勺已烘干的無水硫酸鈉（400℃，2～3 h），將提取液進行過濾脫水，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，再用石油醚溶解定容至25 mL，采用紫外分光光度法測定225 nm處吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到殘油含量，計算石油去除率。以同樣條件下不接菌的處理作為對照。

1.2.3 混合菌液與單菌液降解能力對比分析

將篩選出的具有直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的菌株活化后，挑取一環(huán)接種于100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，將各菌液按同比例混合制成混合菌液，分別取混合菌液和單菌液6 mL加至富集用無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d，萃取培養(yǎng)液中殘留石油，計算石油去除率，對比混合菌液與單菌液降解能力。以同樣條件下不接菌的處理為對照。

1.2.4 混合菌群的構(gòu)建及其降解能力分析

按1.2.3中的方法培養(yǎng)所篩選出的具有直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的菌株，采用正交試驗法，將各菌株按不同比例混合，取6 mL培養(yǎng)液加至富集用無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)5 d，萃取培養(yǎng)液中殘留石油，計算石油去除率，分析混合菌群的最佳配比。

1.2.5 石油降解菌群影響因素分析

選擇C∶N∶P、pH、表面活性劑以及微生物接種量4個因素，按表1設(shè)計正交試驗，分析微生物菌群最佳降解條件。稱取10 g人工配制的石油污染土壤（石油濃度為5%），加入到裝有30 mL滅菌水的三角瓶中，調(diào)節(jié)不同因素水平，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)5 d，檢測殘余石油量，計算其去除率。

1.2.6 微生物修復(fù)試驗

稱取混合烴污染土壤2 kg，將選出的菌株進行培養(yǎng)，按1.2.4中確定的比例混合、離心，再按1.2.5中確定的比例投加至污染土壤中，根據(jù)1.2.5的條件，調(diào)節(jié)土壤C∶N∶P比例、pH和表面活性劑的量，其中N由NaNO3和（NH4）2SO4提供（1∶1），P由K2HPO4提供。用蒸餾水均勻噴灑土壤并不斷翻動攪拌，使土壤的濕度達到16%～19%（W∶W）。將土壤分層鋪放在土壤塑料盒內(nèi)，每10 d進行采樣分析，試驗共進行100 d。試驗在恒溫（25±1）℃下進行，并定期向土壤箱中噴灑蒸餾水以保持土壤濕度。在相同條件下與未投加微生物和條件優(yōu)化的土壤進行對照。

表1 L16（44）正交設(shè)計Table 1 L16（44）Orthogonal test design

1.3 分析方法

1.3.1 土壤中正十六烷、環(huán)十二烷以及芘含量的測定

將土樣風(fēng)干后研磨，過40目篩，稱取10 g于250 mL磨口三角瓶中，加入30 mL二氯甲烷和丙酮混合溶劑（1∶1），170 r·min-1振蕩提取30 min后再超聲萃取10 min，將提取液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，8000 r· min-1低溫離心2 min，收集上清液，其沉淀物再用30 mL二氯甲烷和丙酮混合溶劑以同樣的方法提取三次，合并提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用正己烷溶解并定容至5 mL，用0.22 μm有機濾膜過濾后，采用氣相色譜法測定正十六烷、環(huán)十二烷和芘的含量。

工作條件和升溫程序：初始溫度80℃，保持1 min，以20℃·min-1升至300℃，保持5 min；進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為300℃；所用檢測器為氫火焰離子檢測器；色譜柱為非極性毛細管柱（TR-1 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為99.99%高純氮，流量1.0 mL·min-1；不分流進樣，進樣量為1 μL。

1.3.2 菌株鑒定

將篩選出的高效菌株交由測序公司進行16S rRNA序列測定，將序列信息輸入NCBI（www.ncbi. nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫進行Blast分析，根據(jù)同源性比對結(jié)果初步鑒定到屬。

1.3.3 微生物群落變化

微生物群落采用PCR-DGGE法進行分析[19]。

土壤基因組DNA采用快速提取試劑盒提?。∕P Biomedicals，LCC.，Ohio，美國）。16S rRNA經(jīng)PCR（MJ Research Inc.，Waltham，MA，美國）擴增后用于后續(xù)的DGGE分析。所用引物為GC-341F（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）及907R（5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′）。

采用Dcode基因突變檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行分析。DGGE電泳所用膠濃度為6%聚丙烯酰胺，變性劑梯度范圍40%～60%，60℃條件下，70 V運行16 h，電泳完成后用0.01%Genefinder染色45 min。用凝膠成像系統(tǒng)捕獲凝膠數(shù)字圖象，并用圖形分析軟件Quantity One 4.4.0進行圖像分析，各泳道圖譜的相似性通過計算Dice系數(shù)進行比較，聚類樹狀圖用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）生成。泳道光密度曲線上的峰面積代表條帶密度，每個條帶密度所占比例用來比較各種群的豐度。采用香儂指數(shù)（H′）[20]來表示微生物多樣性：

式中：Pi為DGGE圖譜中第i條帶的峰密度與所有條帶（S）總峰密度的比值。

1.3.4 脫氫酶活性

脫氫酶活性根據(jù)TTC還原法[21]測定。

1.3.5 可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化

可培養(yǎng)微生物數(shù)量分析采用平板菌落計數(shù)法[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油降解菌群的構(gòu)建

2.1.1 石油降解菌的篩選

經(jīng)過富集、分離和純化，從石油污染土壤中共分離得到10株降解菌B1～B10。采用選擇性培養(yǎng)基進一步篩選可知，10株菌均能在直鏈烷烴降解菌篩選培養(yǎng)基中生長，表明其均能以直鏈烷烴為唯一碳源生長；菌B1、B2、B3、B6、B7和B9能以環(huán)烷烴為唯一碳源生長；菌B2和B3能在芳烴降解菌篩選培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生透明圈，表明其能利用多環(huán)芳烴。

2.1.2 單株菌對TPH的降解能力

單株菌對TPH的降解能力如圖1所示。菌株B2和B3對TPH的降解能力尤為突出，5 d后對TPH的去除率分別達75%和72%；其他菌株降解能力大小依次為B9、B1、B7、B6、B5、B10、B8和B4。綜合分析表明，菌株B1、B2、B3、B6、B7和B9對TPH具有較高的降解能力，而且B2和B3對直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴均具有降解能力，B1、B6、B7和B9對直鏈烷烴和環(huán)烷烴具有降解能力，故選擇菌株B1、B2、B3、B6、B7和B9構(gòu)建微生物混合菌群。

圖1 單株菌對TPH的降解能力Figure 1 Removal rate of TPH by different degrading strains

2.1.3 菌株鑒定

采用16S rRNA基因序列對比，結(jié)果如表2所示。對六株高效菌株B1、B2、B3、B6、B7和B9進行鑒定，結(jié)果表明，該六株菌歸為5個不同的屬，其中：B1與嗜氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）多個菌種基因序列相似性達99%以上；B2與苯基桿菌屬（Phenylobacterium sp.）多種基因序列相似性達98%以上；B3和B9與節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）多個菌種基因序列相似性達99%以上；B6與鞘脂菌屬（Sphingobium sp.）多種基因序列相似性達到99%以上；B7與芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）多個菌種基因序列相似性達99%以上。因此，初步鑒定B1、B2、B6和B7分別屬于嗜氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium sp.）、鞘脂菌屬（Sphingobium sp.）和芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）；B3和B9屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。目前，已在石油烴類污染土壤中檢測到多種嗜氫菌屬、苯基桿菌屬、鞘脂菌屬、芽胞桿菌屬和節(jié)桿菌屬的微生物，已發(fā)現(xiàn)的菌株不僅可以降解烷烴、多環(huán)芳烴，還可以降解混合烴[23-26]。

表2 16S rRNA基因序列對比結(jié)果Table 2 Alignment results of 16S rRNA sequences

2.1.4 混合菌液與單菌液降解能力對比分析

由B1、B2、B3、B6、B7和B9構(gòu)成的混合菌株與各單菌株對TPH的去除能力如圖2所示。5 d后，六種單菌體系中，B2對石油的去除率最高，為65.7%，B6對石油的去除率最低，為25.1%。接種復(fù)合菌液，石油的去除率為77.9%，比單菌體系的最高去除率提高了12.2%。石油組成成分復(fù)雜，其中包含脂肪烴和多環(huán)芳烴等多種成分，靠單一的微生物菌種很難實現(xiàn)其全面降解。該結(jié)果表明，將具有不同去除能力的菌種進行混合，作為石油烴的降解微生物，其對石油的降解性能明顯高于單菌。

圖2 混合菌株與單菌株對TPH的去除能力Figure 2 Removal rate of TPH by mixed bacteria and single degrading strains

2.1.5 混合菌群的構(gòu)建及其降解能力分析

根據(jù)六因素三水平正交試驗L27（36）對所選六株菌投加比例進行優(yōu)化。不同投加比例下各菌群對TPH的降解能力如表3所示。從極差分析結(jié)果可知，所選出的六株菌中，B2對混合菌群降解TPH的影響最大，然后依次為B3、B7、B1、B9和B6。菌株B2和B3對環(huán)烷烴、直鏈烷烴和芳烴均具有降解能力，而且菌株B2和B3對TPH的降解能力明顯高于其他菌株。這可能是B2和B3菌株對混合菌群降解TPH影響最大的主要原因。

直觀分析表明，14號試驗中石油去除率最高，為94.9%。將六株菌三個水平處理下的石油平均去除率用圖3表示，發(fā)現(xiàn)B1∶B2∶B3∶B6∶B7∶B9=1∶1∶2∶0.5∶2∶0.5時石油去除率應(yīng)為最高（對應(yīng)于15號試驗），而15號試驗中TPH去除率為90.4%，低于14號試驗。因此，再次以14號和15號配比進行降解條件的驗證試驗，結(jié)果表明，5 d后，14號試驗中TPH去除率為95.6%，15號試驗中TPH去除率為91.5%。綜合分析，最佳的菌株投加比例應(yīng)為B1∶B2∶B3∶B6∶B7∶B9=1∶1∶2∶0.5∶1∶2。不同投加比例的菌群對石油降解能力存在差異的原因可能是菌群中各菌株在生長過程中存在既相互影響又相互制約的關(guān)系，當(dāng)各菌株的數(shù)量達到一定比例時才能發(fā)揮最大的優(yōu)勢[27]。

2.1.6 石油降解菌群影響因素分析

根據(jù)四因素四水平正交試驗L16（44）對C∶N∶P、pH、表面活性劑以及微生物接種量等進行優(yōu)化，結(jié)果如表4所示。從極差分析結(jié)果可知，影響石油降解的四個因素中，接種量對石油降解效果影響最大，其后依次為pH、C∶N∶P和表面活性劑添加量。

表3 混合菌群的構(gòu)建及其降解能力Table 3 Construction of the mixed flora and its degradatdion ability

直觀分析表明，15號試驗中石油去除率最高，達到49.5%。將各因素不同水平處理下石油烴的平均去除率用圖4表示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C∶N∶P比例為100∶5∶1、pH為7、吐溫-80添加量為50 mg·kg-1、微生物降解菌群接種量為2%時，石油去除率應(yīng)為最高，而這一配比并未出現(xiàn)在正交表中。因此，以該配比進行降解條件的驗證試驗，結(jié)果石油去除率達58.3%，高于正交試驗中的石油去除率，說明該配比為最優(yōu)組合。綜合考慮土壤中污染物、有機碳、速效氮和速效磷的濃度，通過調(diào)整使最終C∶N∶P比例為10∶5∶1，即NaNO3和（NH4）2SO4（1∶1）用量為6.01 g·kg-1，K2HPO4的用量為1.21 g·kg-1。

2.2 微生物群落變化

土壤中微生物群落變化如圖5所示。根據(jù)聚類分析（圖5b），0 d各自聚為一類，10 d和40 d聚為一類，而70 d和100 d聚為一類。根據(jù)多樣性分析（圖5 a），在試驗進行的前10 d，土樣中微生物多樣性明顯升高，可能的原因是微生物混合菌與氮磷營養(yǎng)物的添加使土壤降解菌多樣性迅速上升。70 d后多樣性有所降低，但100 d后，土樣中微生物多樣性仍高于初始值，說明所優(yōu)化的土壤環(huán)境適宜微生物的生長，使其保持良好的多樣性。

表4 多因素正交試驗結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal test

2.3 微生物活性及可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化

微生物活性和可培養(yǎng)微生物數(shù)量隨時間變化情況如圖6所示。試驗過程中，微生物活性和數(shù)量均呈先上升后下降的趨勢，與微生物多樣性變化趨勢一致。在試驗進行的前10 d，微生物活性和數(shù)量顯著升高（P＜0.01），之后則有所降低。試驗初期向土壤中添加了營養(yǎng)物質(zhì)，使土壤中營養(yǎng)物質(zhì)充足，且C∶N∶P比例符合微生物生長的需要，故微生物活性和數(shù)量迅速上升，而后期隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和一些有毒中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，微生物活性和數(shù)量降低[28]。

2.4 環(huán)十二烷、正十六烷、芘含量變化

圖6 微生物活性及可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化Figure 6 Changes of culturable bacterial numbers and dehydrogenase activity

土壤中正十六烷、環(huán)十二烷和芘的含量隨時間變化情況如圖7所示。40 d后，土壤中環(huán)十二烷含量由初始的947.22 mg·kg-1降至140.89 mg·kg-1，去除率達85.1%，對照組去除率僅為10.6%（圖7a）。經(jīng)過100 d的修復(fù)，土壤中的正十六烷含量由初始的4 744.54 mg·kg-1降至1 585.37 mg·kg-1，去除率達66.6%，而對照組去除率僅為9.7%（圖7b）。100 d后，土壤中芘的含量由48.81 mg·kg-1降至28.91 mg·kg-1，去除率達71.8%，對照組去除率為11.4%（圖7c）。

圖7 土壤中環(huán)十二烷（a）、正十六烷（b）和芘（c）含量變化Figure 7 Changes of the contents of cyclododecane（a），n-hexadecane（b）and pyrene（c）in soil

該菌群對土壤中三類烴的去除均具有明顯的促進作用。石油組成成分復(fù)雜，靠單一的微生物菌種很難實現(xiàn)其完全降解。本研究構(gòu)建了包含環(huán)烷烴、直鏈烷烴和多環(huán)芳烴降解能力的降解菌群，而由于不同的微生物具有不同的代謝途徑[29]，該菌群綜合了各菌株在降解不同烴類組分的過程中所體現(xiàn)出的優(yōu)勢，實現(xiàn)了石油烴類污染物的高效降解。

在試驗進行的前10 d，各類污染物降解速率均最快，后期則逐漸降低，與土壤微生物多樣性、數(shù)量以及活性變化趨勢一致。試驗初期，微生物混合菌與營養(yǎng)物的投加解決了土壤中營養(yǎng)缺乏與微生物活性低下的問題，故降解菌數(shù)量、活性與污染物去除率均迅速上升，而隨著微生物多樣性、數(shù)量和活性的降低，污染物去除率也隨之下降。據(jù)此，可根據(jù)微生物活性和污染物降解速率的變化趨勢，尋找污染物降解節(jié)點，適時調(diào)節(jié)微生物群落和活性，使污染物保持較高的降解速率。另外，試驗初期，土壤中積累的中間產(chǎn)物較少，故污染物減少速率較大，而隨著中間產(chǎn)物的積累，不但要進行環(huán)十二烷、正十六烷和芘的轉(zhuǎn)化，還要進行中間產(chǎn)物的進一步氧化，使得污染物減少速率降低[30]。該研究結(jié)果可為石油烴類污染物的生物降解過程調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

3 結(jié)論

從大慶油田石油污染土壤中篩選得到6株分別具有直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的菌株，通過對接種比例、接種量的優(yōu)化，構(gòu)建了微生物降解菌群，并對其環(huán)境條件進行了優(yōu)化，所優(yōu)化的土壤環(huán)境適宜微生物的生長。該菌群對去除土壤中由環(huán)十二烷、正十六烷和芘所構(gòu)成的混合烴類污染物具有明顯的促進作用，各類污染物的降解速率均呈現(xiàn)先高后低的趨勢，與微生物多樣性、數(shù)量以及活性變化趨勢相似。該研究結(jié)果有望為石油烴類污染物的生物降解過程調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Lladó S,Covino S,Solanas A,et al.Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil[J].Journal of Hazardous Materials,2013,248/ 249（6）：407-414.

[2]Moliterni E,Rodriguez L,Fernández F J,et al.Feasibility of different bioremediation strategies for treatment of clayey and silty soils recently polluted with diesel hydrocarbons[J].Water,Air&Soil Pollution,2012, 223（5）：2473-2482.

[3]李鳳梅,郭書海,張燦燦,等.多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其在焦化場地污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用[J].環(huán)境污染與防治,2016,38（4）：1-5.

LI Feng-mei,GUO Shu-hai,ZHANG Can-can,et al.Isolation of PAHs degrading bacteria and its application to mediation of pulluted soil in coking site[J].Environmental Pollution＆Control,2016,38（4）：1-5.

[4]Boopathy R.Factors limiting bioremediation technologies[J].BioresourceTechnology,2000,74（1）：63-67.

[5]Grace Liu P W,Chang T C,Whang L M,et al.Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil：Effects of strategies and microbial community shift[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65（8）：1119-1127.

[6]Reddy M V,Devi M P,Chandrasekhar K,et al.Aerobic remediation of petroleum sludge through soil supplementation：Microbial community analysis[J].Journal of Hazardous Materials,2011,197（24）：80-87.

[7]Chen J,Yang Q Y,Huang T P,et al.Enhanced bioremediation of soil contaminated with viscous oil through microbial consortium construction and ultraviolet mutation[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27（6）：1381-1389.

[8]Chen J L,Au K C,Wong Y S,et al.Using orthogonal design to determine optimal conditions for biodegradation of phenanthrene in mangrove sediment slurry[J].Journal of Hazardous Materials,2010,176（1）：666-671. [9]喬俊,陳威,張承東.添加不同營養(yǎng)助劑對石油污染土壤生物修復(fù)的影響[J].環(huán)境化學(xué),2010,29（1）：6-11.

QIAO Jun,CHEN Wei,ZHANG Cheng-dong.Bioremediation of petroleum contaminated soil by various nutrient amendments[J].Environmental Chemistry,2010,29（1）：6-11.

[10]鐘毅,李廣賀,張旭,等.污染土壤石油生物降解與調(diào)控效應(yīng)研究[J].地學(xué)前緣,2006,13（1）：128-133.

ZHONG Yi,LI Guang-he,ZHANG Xu,et al.A study of the bioremediation effects on the petroleum contaminated soil[J].Earth Science Frontiers,2006,13（1）：128-133.

[11]McCray J E,Bai G,Maier R M,et al.Biosurfactant-enhanced solubilization of NAPL mixtures[J].Journal of Contaminant Hydrology,2001, 48（1）：45-68.

[12]Bueno-Montes M,Springael D,Ortega-Calvo J J.Effect of a nonionic surfactant on biodegradation of slowly desorbing PAHs in contaminated soils[J].Environmental Science&Technology,2011,45（7）：3019-3026.

[13]葉淑紅,丁鳴,馬達,等.微生物修復(fù)遼東灣油污染濕地研究[J].環(huán)境科學(xué),2005,26（5）：143-146. YE Shu-hong,DING Ming,MA Da,et al.Research of Microbio-remediation of oil-contaminated wetland in Liaodong Bay[J].Environmental Science,2005,26（5）：143-146.

[14]沈萍,陳向東.微生物學(xué)實驗[M].四版.北京：高等教育出版社, 2010. SHEN Ping,CHEN Xiang-dong.Experiment of microbiology[M].4th Edition.Beijing：Higher Education Press,2010.

[15]Kuba T,Loosdrecht M C M V,Heijnen J J.Phosphorus and nitrogen removal with minimal COD requirement by integration of denitrifying dephosphatation and nitrification in a two-sludge system[J].Water Research,1996,30（7）：1702-1710.

[16]Alley J F,Brown L R.Use of sublimation to prepare solid microbial media with water-insoluble substrates[J].Applied&Environmental Microbiology,2000,66（1）：439-442.

[17]李大平,李福德.LHG1菌株的分離和降解環(huán)己烷的研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,1999,5（S1）：136-138.

LI Da-ping,LI Fu-de.Isolation of strain LHG1 and its biodegradation of cyclohexane[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biol-ogy,1999,5（S1）：136-138.

[18]高野萌,楊雪蓮,李鳳梅,等.高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其降解特性[J].生態(tài)學(xué)雜志,2016,35（6）：1539-1546.

GAO Ye-meng,YANG Xue-lian,LI Feng-mei,et al.Isolation of heavy PAH-degrading bacteria and their characteristics of degradation[J]. Chinese of Journal of Ecology,2016,35（6）：1539-1546.

[19]Muyzer G,De Waal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology,1993,59（3）：695-700.

[20]Lear G,Harbottle M J,van der Gast C J,et al.The effect of electrokinetics on soil microbial communities[J].Soil Biology and Biochemistry, 2004,36（11）：1751-1760.

[21]Megharaj M,Singleton I,McClure N,et al.Influence of petroleum hydrocarbon contamination on microalgae and microbial activities in a long-term contaminated soil[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2000,38（4）：439-445.

[22]Randall J D,Hemmingsen B B.Evaluation of mineral agar plates for the enumeration of hydrocarbon-degrading bacteria[J].Journal of Microbiological Methods,1994,20（2）：103-113.

[23]Borah D,Yadav R N S.Biodegradation of complex hydrocarbon by a novelBacilluscereusstrain[J].JournalofEnvironmentalScience&Technology,2014,7（7）：176-184.

[24]Li F,Zhu L Z,Wang L W,et al.Gene expression of an Arthrobacter in surfactant-enhanced biodegradation of a hydrophobic organic compound[J].Environmental Science&Technology,2015,49（6）：3698-3704.

[25]Alkindi S,Rmm A.Effect of biostimulation using sewage sludge,soybean meal,and wheat straw on oil degradation and bacterial community composition in a contaminated desert soil[J].Frontiers in Microbiology, 2016,7（2836）：240.

[26]Martin F,Torelli S,Paslier D L,et al.Betaproteobacteria dominance and diversity shifts in the bacterial community of a PAH-contaminated soil exposed to phenanthrene[J].Environmental Pollution,2012,162：345-353.

[27]李寶明,姜瑞波.營養(yǎng)和環(huán)境條件對微生物菌群降解石油的影響[J].中國土壤與肥料,2008（3）：78-82.

LI Bao-ming,JIANG Rui-bo.Effects of nutrition and environment on oil biodegradation by bacterial community[J].Soil and Fertilizer Sciences in China,2008（3）：78-82.

[28]Chu H Y,Lin X G,Fujii T,et al.Soil microbial biomass,dehydrogenase activity,bacterial community structure in response to long-term fertilizer management[J].Soil Biology and Biochemistry,2007,39（11）：2971-2976.

[29]于慧敏,馬玉超.工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略[J].生物工程學(xué)報,2010,26（9）：1199-1208.

YU Hui-min,MA Yu-chao.Gene knockout strategies for metabolic pathwayregulationinindustrialmicrobes[J].ChineseJournalofBiotechnology,2010,26（9）：1199-1208.

[30]Guo S H,Fan R J,Li T T,et al.Synergistic effects of bioremediation and electrokinetics in the remediation of petroleum-contaminated soil [J].Chemosphere,2014,109：226-233.

Construction of petroleum degrading bacteria consortium and its degradation properties of mixed hydrocarbons

FAN Rui-juan1,GUO Shu-hai2,LI Feng-mei2
（1.College of Biological Science&Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China;2.Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China）

After enrichment,separation,purification,screening by selective medium,and testing by degradation ability of the total petroleum hydrocarbon（TPH）,6 strains（B1,B2,B3,B6,B7and B9）with cyclanes,alkanes,and aromatics degradation ability were obtained.Based on the sequence analysis of 16S rRNA gene,B1,B2,B6and B7were identified asHydrogenophaga sp.,Phenylobacterium sp.,Sphingobium sp. and Bacillus sp.,respectively;B3and B9were identified as Arthrobacter sp..A microbial degradation flora was constructed through the optimization of the inoculum proportion,size,and growth conditions.The degradation flora was then used in the remediation of mixed hydrocarbon-contaminated soil,the results demonstrated an obvious effect of the flora in the degradation of three kinds of hydrocarbons.After 40 d of remediation,the degradation extent of cyclododecane can be reach to 74.5%;and after 100 d,the degradation extents of n-hexadecane and pyrene reached to 56.9%and 60.4%,respectively.There was a significant decrease of pollutants during the first 10 d,and the removal efficiency was reduced along with the experiment,showed a similar variation tendency with microbial diversity,quantity and activity in soil.

petroleum contaminated soil;optimal condition;bioremediation;microbial community

X74

A

1672-2043（2017）03-0522-09

10.11654/jaes.2016-1266

范瑞娟，郭書海，李鳳梅.石油降解菌群的構(gòu)建及其對混合烴的降解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（3）：522-530.

FAN Rui-juan,GUO Shu-hai,LI Feng-mei.Construction of petroleum degrading bacteria consortium and its degradation properties of mixed hydrocarbons[J]. Journal of Agro-Environment Science,2017,36（3）：522-530.

2016-09-30

范瑞娟（1985—），女，寧夏隆德人，博士，講師，主要研究方向為污染防治與環(huán)境修復(fù)。E-mail：fanruijuan@163.com

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2013ZX07202-007）；寧夏高等學(xué)?？蒲许椖浚∟GY2016153）；北方民族大學(xué)重點科研項目（2015KJ34）；北方民族大學(xué)科研項目（2016skky07）

Project supported：Water Pollution Control and Management Key Project of Science and Technology of China（2013ZX07202-007）；The Scientific Research Project of Ningxia Institutions（NGY2016153）；The Key Scientific Research Projects of Beifang University of Nationalities（2015KJ34）；The Scientific Research Projects of Beifang University of Nationalities（2016skky07）