劉慧，蔣安祺，王為木

（1.河海大學水利水電學院，南京 210098；2.河海大學南方地區(qū)高效灌排與農業(yè)水土環(huán)境教育部重點實驗室，南京 210098）

低濃度微納米氧化鋅對中華圓田螺的生態(tài)毒性

劉慧1，2，蔣安祺1，王為木1，2

（1.河海大學水利水電學院，南京 210098；2.河海大學南方地區(qū)高效灌排與農業(yè)水土環(huán)境教育部重點實驗室，南京 210098）

為探討微米氧化鋅與納米氧化鋅對底棲生物生態(tài)毒性效應的影響，以中華圓田螺為受試生物，采用電子順磁共振技術等多種檢測方法，比較研究了肝臟自由基、抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量在14 d暴露時間內的變化規(guī)律。研究發(fā)現：微、納米氧化鋅均可誘導中華圓田螺產生羥基（·OH）自由基；微米氧化鋅暴露抑制SOD活性，納米氧化鋅則顯著誘導SOD活性；納米氧化鋅對田螺肝臟羥基（·OH）自由基、CAT、MDA和Zn富集量的誘導程度高于微米氧化鋅；微、納米氧化鋅均顯著抑制GST活性，但兩者之間差異不顯著。結果表明，納米氧化鋅對中華圓田螺肝臟產生更強的毒性效應，但當微米氧化鋅達到一定濃度后能夠產生和納米氧化鋅相似水平的毒性。

微米氧化鋅；納米氧化鋅；自由基；抗氧化系統；中華圓田螺

氧化鋅是一種寬帶隙半導體材料，在光電子領域有重要作用，也是無機抗菌劑研究的熱點之一。納米氧化鋅作為常見的納米材料還被廣泛應用于陶瓷、油漆等行業(yè)，甚至在化妝品領域也有廣闊的應用前景[1-2]。目前，相關實驗發(fā)現微米氧化鋅在高劑量時可誘導小鼠細胞DNA損傷[3]，但對水生生物毒性的研究還較少，而納米氧化鋅在此方面的研究主要針對細菌、藻類和魚類。研究顯示，低濃度納米氧化鋅對斜生柵藻生長起促進作用，達到一定濃度后表現為抑制作用[4]；納米氧化鋅雖然在魚類體內不具有生物蓄積性，但無法完全清除，高濃度下會有大量Zn積累在魚鰓、腸等部位并出現氧化應激反應，甚至還會導致魚類器官損傷，滲透調節(jié)能力變弱以及免疫系統紊亂[5-6]。

采用電子順磁共振（EPR）技術與自旋捕集技術相結合來捕捉壽命短、穩(wěn)態(tài)濃度低的瞬態(tài)自由基是細胞生物學及生物化學研究中常用的方法，具有靈敏度高、特異選擇性強和分析結果可靠等優(yōu)點[7]。在所有需氧生物體內，都存在一系列抗氧化酶和抗氧化劑，它們的總稱就是抗氧化防御系統，其作用是清除體內過剩的活性氧簇（ROS），保護機體免受過量ROS帶來的傷害[8]。中華圓田螺（Cipangopaludina cahayensis）是國內常見的雜食性大型淡水底棲動物，處于食物鏈低營養(yǎng)級別，且在水中的移動性很小，生活環(huán)境相對固定，可以真實地反映周圍底泥或水體的實際污染狀況[9]，然而目前關于納米顆粒對底棲動物低濃度暴露的生態(tài)毒理學效應的研究還較為少見。

本研究以中華圓田螺為受試生物進行室內試驗，以自由基強度、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）以及肝臟中Zn的富集量為測試指標，研究低濃度下微、納米氧化鋅懸浮液對中華圓田螺的生態(tài)毒理學效應，以期為今后納米氧化鋅的生態(tài)安全性評價提供數據支撐和科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試生物

試驗所用中華圓田螺購自南京市水產市場，其平均體長為（5.41±0.65）cm，平均體寬為（3.85±0.75）cm，平均體重為（43.57±0.45）g。馴養(yǎng)采用曝氣除氯自來水，試驗前馴養(yǎng)14 d，死亡率小于5%。隨機選取個體差異不大的田螺用于暴露試驗。

1.2 儀器與試劑

儀器：EMX 10/12型EPR譜儀（德國Bruker公司）；UV-8000S雙光束紫外/可見分光光度計；HC-3018R高速冷凍離心機；PE-AA800火焰原子吸收光譜儀（鉑金埃爾默儀器有限公司，上海）等。

試劑：納米氧化鋅（純度99.7%，粒徑50±10 nm）和微米氧化鋅（AR，純度≥99.0%，粒徑≤1 μm）購自阿拉?。ˋladdin）公司，二甲基亞砜（DMSO），α-苯基-N-叔丁基甲亞胺-N-氧化物（PBN），其余試劑均為國產分析純。

1.3 試驗設計

微、納米ZnO懸浮液制備：分別將微米氧化鋅和納米氧化鋅（濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）溶于30 L除氯自來水中，超聲60 min（儀器設置：功率250，頻率40 kHz，溫度24℃）后待用[10-11]。

暴露試驗：將已制備好的懸浮液分別加入體積為40 L的玻璃水缸中，并投放20只田螺，同時設置空白對照。暴露時間為14 d，光照周期為12 h（白晝）/12 h（黑暗），維持水溫（24±2）℃，每2 d投放人工餌料一次。采用靜態(tài)置換法每2 d更換一次溶液，并檢查一次水質。試驗期間，田螺狀況良好無死亡。試驗結束后，將實驗螺取出洗凈，夾破螺殼后分離出肝臟，一部分直接保存于-20℃冰箱中用于測定Zn富集量，另一部分加磷酸緩沖液研磨后經高速冷凍離心機離心30 min，取上清液存放于-20℃冰箱中保存待測。

1.4 指標測定

1.4.1 自由基的捕獲與測定

自由基的捕獲與測定采用Davies等改良方法[12]，即在N2環(huán)境下，用PBN和DMSO制取肝臟勻漿液，而后抽取上清液注入一端封口的毛細管中，迅速放入液氮中保存，待電子順磁共振（EPR）測定。其中EPR譜儀操作參數：測試溫度130 K，微波功率20 mW，微波頻率9.751 GHz，調制頻率100 kHz，調制幅度0.5 G，中心磁場3470 G，掃場時間84 s，時間常數41 ms，掃場寬度200 G，信號為5次疊加[13]。

1.4.2 生化指標測定

采用考馬斯亮藍G250與蛋白質結合的方法測定蛋白質含量[14]；改進的鄰苯三酚自氧化法測定SOD[15]；徐鏡波等[16]的方法測定CAT；Habig[17]改進法測定GST；硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定MDA[18]。

1.4.3 Zn生物積累測定

將中華圓田螺洗凈解剖后取出肝臟，在60℃下烘48 h至樣品恒重。稱取0.5 g左右預處理后的肝臟置于錐形瓶內，加入10 mL優(yōu)級純混酸溶液（濃HNO3∶濃HClO4為5∶1），在電熱板上消煮至白色后用稀HNO3定容至25mL。利用原子吸收光譜儀測定Zn的含量[19]。

1.5 數據處理與分析

數據采用Origin 7.5進行自由基圖譜繪制和分析、SPSS 17.0進行統計分析。運用單因素方差分析方法，采用Duncan法進行多重比較。差異顯著性水平為0.05，結果以標記字母法表示。

2 結果與分析

2.1 中華圓田螺肝臟自由基種類鑒定與變化情況

圖1是中華圓田螺暴露于0.2 mg·L-1微、納米氧化鋅懸浮液14 d時肝臟自由基圖譜。經計算，圖1A暴露于微米ZnO中華圓田螺肝臟捕獲的自由基超精細分裂常數PBN/CH3為aN=15.2 Gauss、aH=3.1 Gauss、g=2.005 8，PBN/OCH3為aN=15.6 Gauss、aH=3.5 Gauss、g=2.005 8；圖1B暴露于納米ZnO中華圓田螺肝臟捕獲的自由基超精細分裂常數PBN/CH3為aN=15.2 Gauss、aH=3.1 Gauss、g=2.005 8，PBN/OCH3為aN=15.4 Gauss、aH=3.3 Gauss、g=2.005 8。兩者均與文獻報道的PBN捕獲甲基和甲氧基的特征參數基本一致[20-21]。根據羥基（·OH）自由基生成甲基和甲氧基的具體反應式：·OH+DMSO→·CH3+PBN→PBN/·CH3+O2→PBN/ ·OCH3，且產生三組雙重峰分類譜線為典型的PBN捕獲自由基形成PBN/·OH的EPR圖譜，可以判斷在氮氣環(huán)境下微、納米氧化鋅均可誘導中華圓田螺肝臟產生羥基（·OH）自由基。兩個自由基圖譜均具有超精細分裂峰的三組峰，以第二組峰的第一個小峰的峰高與峰谷之間信號強度差值的絕對值作為自由基的相對濃度值[20]。該濃度下兩處理組自由基信號強度分別為3 549.8和5 282.2。

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟自由基強度的變化如圖2所示。從圖可以看出，微、納米氧化鋅誘導·OH自由基信號強度均高于對照組，其中0.2～1 mg·L-1微米氧化鋅和0.1～1 mg·L-1納米氧化鋅暴露信號強度顯著高于對照組。兩者隨濃度增加均表現為先升高后降低的變化趨勢，最大信號值均出現在0.5 mg·L-1暴露水平下，但納米氧化鋅誘導產生自由基強度為微米氧化鋅的3.09倍、對照組的7.37倍。

2.2 中華圓田螺肝臟Zn富集量情況

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟Zn的富集量情況如表1所示。從表中可以明顯看出，Zn的富集量隨暴露濃度的增加逐漸升高，除0.1 mg·L-1微米氧化鋅處理外，其他處理組富集量均與對照組差異顯著。兩處理組暴露濃度與富集量之間均存在顯著的線性相關，分別為：y=0.094 3x+0.109 3，R2=0.933 5；y= 0.108 3x+0.090 9，R2=0.940 4。但納米氧化鋅暴露Zn含量均高于同濃度微米氧化鋅暴露。

2.3 中華圓田螺肝臟SOD活性變化情況

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟SOD活性的變化如圖3所示。由圖可知，0.1～0.5 mg·L-1微米氧化鋅暴露SOD活性呈顯著抑制狀態(tài)，1～2 mg·L-1暴露組與對照組無顯著差異。納米氧化鋅暴露SOD活性隨濃度升高呈先增加后降低的變化趨勢，0.1～0.2 mg·L-1暴露與對照無顯著差異，1 mg·L-1時SOD活性達到最大值，為對照組的2.99倍。

表1 微、納米氧化鋅暴露下中華圓田螺肝臟Zn的富集量（mg·kg）Table 1 Zinc contents in liver of Cipangopaludina cahayensis exposed to micro/nano ZnO（mg·kg-1）

2.4 中華圓田螺肝臟CAT活性變化情況

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟CAT活性的變化如圖4所示。微、納米氧化鋅暴露下CAT活性均處于顯著誘導狀態(tài)，且納米氧化鋅對CAT活性的誘導程度大于微米氧化鋅。兩者暴露下CAT活性均隨ZnO濃度增加逐漸增加，在2 mg·L-1達到最大值。其中，0.1～0.2 mg·L-1微、納米氧化鋅暴露與0.5～1 mg·L-1納米氧化鋅暴露CAT活性均無顯著差異。

2.5 中華圓田螺肝臟MDA含量變化情況

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟MDA含量的變化如圖5所示。由圖可以看出，0.1～0.5 mg· L-1微米氧化鋅暴露MDA含量未發(fā)生顯著變化，濃度達到1～2 mg·L-1時MDA含量出現顯著誘導，分別為對照組的28.67倍和33.45倍；納米氧化鋅暴露MDA含量顯著增加，且隨濃度增大呈先增加后降低的變化趨勢，1 mg·L-1時出現最大值，為對照組的91.71倍。

2.6 中華圓田螺肝臟GST活性變化情況

微、納米氧化鋅暴露14 d中華圓田螺肝臟GST活性的變化如圖6所示。由圖可知，兩者暴露GST活性均處于顯著抑制狀態(tài)，在0.5 mg·L-1暴露水平下抑制程度最弱，但兩者之間差異不顯著。

3 討論

有研究指出顆粒尺寸大小會影響其對生物的生態(tài)毒性效應。Pradhan等[22]的研究表明，無脊椎碎食者的攝食速率會隨納米顆粒尺寸的下降而抑制效果增強。有學者同樣發(fā)現尺寸較?。ǎ?0 nm）的納米TiO2顆粒在低濃度暴露下對藻類的生長抑制程度高于尺寸較大的顆粒[23]。但也有實驗結果發(fā)現微、納米ZnO對線蟲的24 h半致死劑量沒有顯著差異[24]。

活性氧的產生是生物體對外源性污染物脅迫響應的路徑之一，污染物可以通過活性氧進一步誘導生物體發(fā)生氧化應激和氧化損傷。在本實驗中，微、納米氧化鋅均誘導田螺產生·OH自由基，且納米氧化鋅誘導產生自由基信號強度高于微米氧化鋅，與在鯽魚腹腔注射微、納米氧化鋅后肝臟中測得羥基自由基顯著誘導的結論相同[25]。金霏霏等[26]選用體外暴露的方式同樣在鯽魚肝臟中發(fā)現了納米氧化鋅顯著誘導產生ROS，Zhao等[27]用斑馬魚作為受試生物在20、50、100 mg·L-1納米氧化鋅暴露下得出ROS誘導程度分別為對照組的179%、194%和244%的結論。這表明誘導產生ROS是ZnO對水生生物致毒的重要原因，且隨ZnO濃度增加表現出一定的劑量-效應關系，同時納米氧化鋅暴露下生物受到的氧化脅迫大于微米氧化鋅，也表明顆粒粒徑大小會影響其對生物的毒性。

SOD、CAT和GST作為抗氧化防御系統的一部分，在清除活性氧以及機體的保護性防御中發(fā)揮著巨大的作用。在本實驗中華圓田螺暴露于兩種尺寸的ZnO懸浮液中，機體受到一定程度的污染物脅迫，表現出大量·OH自由基的產生，三種抗氧化酶也表現出不同的變化情況。實驗結果顯示，在微米氧化鋅暴露下SOD活性處于抑制狀態(tài)，可能如Ntasham Frankin所述析出的鋅離子以及光催化會對其產生較大影響，從而引起細胞功能下降[28-29]。熊道文等[30]在7 d的急性暴露實驗中也發(fā)現常規(guī)ZnO會造成斑馬魚SOD活性顯著降低，僅為對照組的48.7%，田文靜等[31]的實驗結果則表明釋放鋅的處理組斑馬魚胚胎SOD活性表現出逐漸降低趨勢。而納米氧化鋅暴露則顯著誘導SOD活性，與Zhao等[27]和劉林等[32]研究斑馬魚胚胎和肝臟中SOD活性顯著增加且存在一定劑量依賴性的變化情況相似。胡正雪等[25]則發(fā)現微米ZnO對鯽魚肝臟和腦部SOD活性均無明顯影響，而1 mg·L-1和12.5 mg·L-1納米氧化鋅暴露顯著抑制鯽魚肝臟和腦部SOD活性。兩種尺寸氧化鋅暴露下CAT活性均呈誘導狀態(tài)，且兩者均隨濃度增大活性逐漸增加，與熊道文等[30]在斑馬魚腮部、消化道中得到的CAT活性誘導程度為對照組153.6%、253.0%的結果相似。在0.2～1 mg·L-1微米氧化鋅暴露下活性氧濃度才出現顯著升高，此時SOD活性處于抑制狀態(tài)、CAT表現出顯著誘導情況，這表明在ZnO低毒性影響下CAT起防御作用略大。而在0.1～0.5 mg·L-1納米氧化鋅脅迫下SOD和CAT活性均表現出與自由基強度相同的變化規(guī)律，表明此條件下需SOD和CAT聯合作用，共同消除活性氧對田螺造成的脅迫作用。而當濃度達到1 mg·L-1時，活性氧濃度大幅下降至對照組相似水平，SOD和CAT仍處于誘導狀態(tài)，可能是由于兩種酶的大量產生使得ROS得到了消除，機體開始向穩(wěn)定狀態(tài)恢復。以上結果表明，生物物種的差別以及器官的不同均會影響抗氧化酶對ZnO的反應，但ZnO顆粒尺寸的大小確實會對其產生毒性的高低造成影響。在本實驗中，GST活性表現出顯著抑制狀態(tài)，且GST活性在微、納米氧化鋅暴露之間的差異不顯著，與斑馬魚暴露96 h后腸組織中GST活性的變化情況有相似之處[33]。這表明GST作為第二階段解毒酶未發(fā)揮明顯作用，其抑制情況可能因為受到脂質過氧化的傷害，但關于GST活性具體表現為抑制狀態(tài)的原因還不明確，有待進一步研究。

·OH自由基的生成與MDA含量雖不完全同步，但變化有一定正相關性，且SOD的最大誘導為對照組的299%，遠低于活性氧生成量，顯著超出抗氧化防御能力，因此田螺機體出現氧化應激，表現出嚴重的脂質過氧化損傷。在微米氧化鋅暴露時MDA含量僅在1～2 mg·L-1時發(fā)生大幅度增加，但納米氧化鋅暴露中華圓田螺肝臟MDA含量顯著增加，與其他學者關于鯽魚、斑馬魚和白亞口魚等水生動物的結果相似[10，34-35]，這說明微米氧化鋅與納米氧化鋅均可因活性氧的生成造成中華圓田螺細胞膜發(fā)生脂質過氧化，影響細胞功能正常發(fā)揮[36]，且納米氧化鋅造成的損傷程度大于微米氧化鋅，與ROS產生量保持一定的正相關。

本實驗的結果還顯示，隨著ZnO濃度的增加中華圓田螺肝臟中Zn富集量表現出顯著的線性相關，且兩種尺寸暴露下Zn富集量存在顯著差異，這表明納米ZnO更容易造成Zn在田螺肝臟中的積累。但有實驗結果顯示，納米氧化鋅在水中析出Zn2+的濃度較低，釋放率不超過5%[37]，而環(huán)境中Zn2+濃度通常大于10 mg·L-1，遠高于納米氧化鋅溶解極限[28]，但Zn2+釋放程度大小對田螺具體影響程度以及Zn的富集是以Zn的何種形態(tài)、通過哪種途徑進入到肝臟中還需通過進一步實驗得出。

4 結論

氧化鋅顆粒粒徑的大小會影響其對生物的生態(tài)毒性，在本實驗中表現為納米氧化鋅對中華圓田螺的生態(tài)毒性高于微米氧化鋅；不同濃度下微、納米氧化鋅對中華圓田螺的毒性有一定差異，0.5～1 mg·L-1為生態(tài)毒性發(fā)生改變的閾值范圍，且較高濃度微米氧化鋅表現出與低濃度（0.1～0.2 mg·L-1）納米氧化鋅暴露相似的影響；微、納米氧化鋅對中華圓田螺肝臟自由基強度、SOD、CAT活性、MDA含量以及Zn富集量均有一定影響，因此可以考慮采用該指標體系評價氧化鋅對底棲生物的生態(tài)毒性。

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Ecotoxicity of low concentration micro/nano ZnO exposure on Cipangopaludina Cahayensis

LIU Hui1,2,JIANG An-qi1,WANG Wei-mu1,2
（1.College of Water Conservancy and Hydropower,Hohai University,Nanjing 210098,China;2.Key Laboratory of High-Efficient Irrigation and Drainage and Agricultural Water and Soil Environment in Southern China,Ministry Education,Nanjing 210098,China）

Cipangopaludina Cahayensis was chosen as a test species to investigate the effects of micro and nano ZnO.The free radicals generation was determined by EPR and several antioxidant enzyme such as SOD,CAT,MDA,GST were measured.The study found that,micro/ nano ZnO could both induce the production of hydroxyl free radicals（·OH）in Cipangopaludina Cahayensis.The intensity of free radical, bioaccumulation of Zn under nano ZnO exposure were higher than micro ZnO exposure.SOD activities were inhibited under micro ZnO except 1～2 mg·L-1,and were significantly induced under nano ZnO exposure.Micro/nano ZnO exposure induced the CAT activities and activities were higher with nano ZnO exposure.Furthermore,nano ZnO and 1～2 mg·L-1micro ZnO induced the synthesis of MDA,suggested that more severe oxidative stress were caused by nano ZnO under the same concentration.However,the inhibition of GST activity was both significantly under micro/nano ZnO exposure and there was no obvious difference between them.The results showed that nano ZnO resulted in greater toxic effects on Cipangopaludina Cahayensis,and that higher micro ZnO could produce a similar toxicity to a lower concentration of nano ZnO.

micro ZnO;nano ZnO;free radicals;antioxidant system;Cipangopaludina Cahayensis

X171.5

A

1672-2043（2017）03-0474-07

10.11654/jaes.2016-1334

劉慧，蔣安祺，王為木.低濃度微納米氧化鋅對中華圓田螺的生態(tài)毒性[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（3）：474-480.

LIU Hui,JIANG An-qi,WANG Wei-mu.Ecotoxicity of low concentration micro/nano ZnO exposure on Cipangopaludina Cahayensis[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（3）：474-480.

2016-10-19

劉慧（1972—），女，山東龍口人，副教授，博士，研究方向為生態(tài)毒理學。E-mail：liuhui@hhu.edu.cn

國家自然科學基金青年科學基金項目（51109060）

Project supported：The Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China（51109060）