姜錦林，單正軍，2*，周軍英，2，卜元卿，2，田豐

（1.國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2.南京信息工程大學(xué)江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210044）

常用農(nóng)藥對赤子愛勝蚓急性毒性和抗氧化酶系的影響

姜錦林1，單正軍1，2*，周軍英1，2，卜元卿1，2，田豐1

（1.國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2.南京信息工程大學(xué)江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210044）

為評估農(nóng)用化學(xué)品對蚯蚓的毒性，選擇11種常用農(nóng)藥（吡蟲啉、噻蟲啉、阿維菌素、高效氯氰菊酯、吡蚜酮、噻嗪酮、毒死蜱、克百威、草甘膦、阿特拉津和百草枯）標(biāo)準(zhǔn)品和9種常用農(nóng)藥制劑作為受試物，采用人工土壤法研究其對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）的急性毒性效應(yīng)，同時還測定了阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉14 d暴露后對赤子愛勝蚓體內(nèi)抗氧化酶（GST、CAT和T-SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果表明，11種常用農(nóng)藥毒性等級從高到低依次為吡蟲啉＞噻蟲啉＞克百威＞毒死蜱＞阿特拉津＞阿維菌素＞草甘膦＞吡蚜酮＞噻嗪酮＞高效氯氰菊酯和百草枯，其中吡蟲啉、噻蟲啉和克百威對赤子愛勝蚓為中毒，其余為低毒。制劑毒性試驗結(jié)果表明，相對其活性成分，部分農(nóng)藥制劑對赤子愛勝蚓的急性毒性有所增強。此外，0.1 mg a.i.·kg-1的噻蟲啉14 d暴露能顯著抑制蚯蚓體內(nèi)CAT活性，而同樣濃度下T-SOD活性顯著性上升；0.25 mg a.i.·kg-1的阿維菌素暴露14 d則能顯著促進蚯蚓GST活性；阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉分別在0.5、0.1、0.5 mg a.i.·kg-1的暴露水平，可以誘導(dǎo)蚯蚓MDA含量出現(xiàn)顯著性變化。研究表明農(nóng)藥的大量不合理施用會對土壤生物產(chǎn)生不利影響并因此干擾土壤正常的生態(tài)功能。

農(nóng)藥；土壤；蚯蚓；急性毒性；抗氧化系統(tǒng)

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)與使用大國，農(nóng)藥的長期大量使用對我國生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的負(fù)面影響已經(jīng)顯現(xiàn)。近年來，我國農(nóng)藥管理部門開始重視農(nóng)藥的環(huán)境安全管理，但目前國內(nèi)大部分研究基本著眼于農(nóng)藥使用對鳥類、陸生和水生生物的負(fù)面影響，有關(guān)農(nóng)藥對土壤生物及土壤環(huán)境質(zhì)量的影響還未引起足夠重視[1-3]。蚯蚓是土壤大型無脊椎動物的代表，在評價土壤生態(tài)系統(tǒng)的污染方面發(fā)揮了重要作用[1-2，4]。近幾十年來，赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）已經(jīng)被視為陸地生態(tài)毒理研究的模式生物物種，國內(nèi)外學(xué)者對其污染物脅迫下的生態(tài)毒理學(xué)特性進行了大量的研究。蚯蚓急性毒性試驗簡單、快速，能對農(nóng)藥毒性進行初步的評估和篩選，為深入研究農(nóng)藥的慢性毒性和復(fù)合毒性提供基本依據(jù)[2-3，5-7]。需要注意的是，不同農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)、毒性機制，以及其對蚯蚓的主要侵入方式、在蚯蚓體內(nèi)的吸收、分布、代謝速度和在土壤環(huán)境中的分解難易程度等均有所不同，都會影響對蚯蚓的急性毒性。另外，從大多數(shù)生態(tài)毒理試驗結(jié)果來看，在很多情況下相對其他土壤非靶標(biāo)動物而言，蚯蚓死亡率變化對農(nóng)用化學(xué)品暴露并不敏感[1-2，8]，單純應(yīng)用其數(shù)據(jù)進行生態(tài)風(fēng)險評估可能并不能很好地體現(xiàn)農(nóng)藥對土壤生物的影響，況且目前標(biāo)準(zhǔn)土壤無脊椎動物測試物種赤子愛勝蚓的選擇更多是出于其適合于標(biāo)準(zhǔn)化室內(nèi)測試的目的，而不是其對農(nóng)藥的敏感性，即能保護大多數(shù)（95%）土壤生物物種和土壤生態(tài)功能[2，9]。目前農(nóng)藥對土壤生物的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)相當(dāng)匱乏，F(xiàn)rampton等[8]調(diào)研了1950個農(nóng)藥土壤數(shù)據(jù)，其中包括250種農(nóng)藥和67個土壤無脊椎生物類群，但大多數(shù)（96%）的農(nóng)藥數(shù)據(jù)來源少于5個土壤生物物種。調(diào)研結(jié)果顯示，基于急性死亡率數(shù)據(jù)的赤子愛勝蚓對農(nóng)藥是最不敏感的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如彈尾目白符跳（Folsomia candida）。在研究農(nóng)藥對蚯蚓致死效應(yīng)的同時，還需關(guān)注其他毒理效應(yīng)，如農(nóng)藥還能影響蚯蚓的繁殖率和呼吸強度，損傷蚯蚓體（如體表和腸道）超微結(jié)構(gòu)，影響體內(nèi)的一些重要物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、氨基酸和葡萄糖等）含量和酶（乙酰膽堿酯酶、纖維素酶、轉(zhuǎn)氨酶和常見抗氧化系統(tǒng)酶等）活性，影響蚯蚓溶酶體膜穩(wěn)定性，以及造成蚯蚓DNA損傷等[3]。

本研究選擇多種典型品種農(nóng)藥原藥或標(biāo)準(zhǔn)品，以及常見的農(nóng)藥制劑為受試物，應(yīng)用人工土壤法測定受試物對蚯蚓的7 d和14 d死亡率（LC50）。同時，考慮到農(nóng)藥毒性大小和使用的廣泛性，選擇抗生素類殺蟲劑阿維菌素以及新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲啉等作為受試農(nóng)藥，研究其暴露對蚯蚓體內(nèi)各種酶活性的影響，闡明農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)特點。

1 材料和方法

1.1 受試生物

選用環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所生態(tài)毒理實驗室自行保種繁殖的同一批次赤子愛勝蚓為受試生物，供試蚯蚓環(huán)帶明顯，大小、體重一致。抽樣結(jié)果顯示平均每條供試蚯蚓體重為0.382 g。試驗開始前，將新獲得的蚯蚓在試驗條件下于未受污染的土壤中預(yù)養(yǎng)7 d，供試驗用。

1.2 受試農(nóng)藥

受試農(nóng)藥原藥或標(biāo)準(zhǔn)品選用8種殺蟲劑（吡蟲啉、噻蟲啉、阿維菌素、高效氯氰菊酯、吡蚜酮、噻嗪酮、毒死蜱、克百威）和3種除草劑（草甘膦、阿特拉津和百草枯），除百草枯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司外，其余農(nóng)藥原藥購自國內(nèi)農(nóng)藥生產(chǎn)廠家；農(nóng)藥制劑品種有600 g·L-1吡蟲啉懸浮種衣劑、65%吡蟲啉水劑、5%阿維菌素乳油、5%阿維菌素可濕性粉劑、50%吡蚜酮水分散粒劑、37%噻嗪酮懸浮劑、30%毒死蜱水乳劑、41%草甘膦水劑和88.8%草甘膦銨鹽可溶粒劑等9種，均來自國內(nèi)農(nóng)藥生產(chǎn)廠家。參比物質(zhì)選用2-氯乙酰胺（99.8%），購自國內(nèi)化學(xué)試劑廠家。

1.3 試驗方法

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[10]和OECD 207試驗準(zhǔn)則[11]，采用人工土壤法評價受試物對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)。測試農(nóng)藥原藥或標(biāo)準(zhǔn)品時，將受試藥劑用丙酮溶解后拌于10 g石英砂中（當(dāng)部分原藥在丙酮中溶解度較低時，加入1.0%Triton X-100助劑），待丙酮完全揮發(fā)后與490 g人工土壤混勻，加入去離子水使土壤含水量約為30%。在每個標(biāo)本瓶中放500 g人工土，再向其中放入10條蚯蚓。用塑料薄膜扎孔后封住瓶口，然后將標(biāo)本瓶置于（20℃± 2℃、濕度80%～85%）恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，每種農(nóng)藥按一定級差設(shè)置5～7個濃度組，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，同時設(shè)不含藥劑的空白對照組和溶劑對照組，濃度以有效成分（Active ingredient）計，單位mg a.i.·kg-1干土。測試農(nóng)藥制劑時，用制劑配成一定濃度的農(nóng)藥溶液，加入500 g人工土壤并充分拌勻，其余處理同農(nóng)藥原藥或標(biāo)準(zhǔn)品毒性測定試驗。分別于第7 d和第14 d記錄死亡數(shù)及中毒癥狀，如蚯蚓在土壤表面出現(xiàn)扭動掙扎、體態(tài)松弛、環(huán)帶腫大、反應(yīng)遲鈍、部分身體出現(xiàn)局部膨起腫大等。

1.4 蚯蚓酶液提取及生理生化指標(biāo)測定

用于蚯蚓生理生化指標(biāo)測定試驗的受試農(nóng)藥均為農(nóng)藥原藥。

蚯蚓勻漿緩沖液包括50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA，250 mmol·L-1蔗糖，調(diào)節(jié)pH至7.6。將蚯蚓勻漿緩沖液置于4℃冰箱保存，備用。取清腸后的蚯蚓1～2條，稱重并剪碎，取適量按照1∶10（W/V）加入蚯蚓勻漿緩沖液，迅速勻漿，制成10%的組織勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入10 mL離心管，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液。蚯蚓粗酶液于-80℃凍存，每個處理組都分成四份用來測定抗氧化系統(tǒng)酶活性。以上操作均在4℃下進行。

T-SOD活性測定采用鄰苯三酚自氧化法[12]，酶活性單位定義為每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量；CAT活性測定采用徐鏡波等[13]的方法，一個單位的CAT活性定義為25℃下，100 s內(nèi)使過氧化氫分解1/2時的酶蛋白量；GST活性測定采用Habig法[14]，一個GST活力單位（U·mg-1蛋白）定義為每毫克蛋白質(zhì)，扣除非酶反應(yīng)，每分鐘使GSH濃度下降1 μmol·L-1。

脂質(zhì)過氧化水平的測定參照Miller等[15]的方法，根據(jù)膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）與硫代巴比妥酸（TBA）的定量反應(yīng)來測定MDA的含量。反應(yīng)體系包含8.1%SDS 0.2 mL、20%醋酸緩沖液1.5 mL、1%TBA 1.5 mL、蒸餾水1 mL，pH為3.5。沸水浴1 h，冷卻后3000 r·min-1離心15 min，取上清液532 nm測吸光度，MDA以nmol TBARS·mg-1蛋白表示，毫摩爾消光系數(shù)155 mmol-1·cm-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 16.0的Probit回歸方法計算農(nóng)藥對蚯蚓的半數(shù)致死濃度值（LC50）及其95%置信限（CI）。采用《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[10]中的標(biāo)準(zhǔn)對農(nóng)藥對蚯蚓的毒性進行分級。

蚯蚓的生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)，在滿足正態(tài)分布（Shapiro-Wilk test）和方差齊性（Levene′s test）的前提條件下，采用方差分析（ANOVA）和S-N-K檢驗分析處理之間的差異顯著性，否則采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis test）來檢驗處理之間差異的顯著性。星號（*）代表處理組的數(shù)據(jù)與空白對照組相比有顯著性差異。所有統(tǒng)計均采用SPSS 16.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見農(nóng)藥原藥（或標(biāo)準(zhǔn)品）對蚯蚓的急性毒性評價

如表1所示，在研究農(nóng)藥品種中，除了吡蟲啉、噻蟲啉和克百威對赤子愛勝蚓是中毒外，其余農(nóng)藥對赤子愛勝蚓皆是低毒，溶劑對照組顯示所用最高劑量對蚯蚓存活無影響。應(yīng)用參比物質(zhì)2-氯乙酰胺對方法進行了驗證，14 d-LC50數(shù)據(jù)在正常范圍（20～80 mg a.i. ·kg-1）內(nèi)。

2.2 常見農(nóng)藥制劑對蚯蚓的急性毒性評價

表2是9種農(nóng)藥制劑對赤子愛勝蚓的急性毒性測試結(jié)果。對比表1，可以看出，部分農(nóng)藥制劑（65%吡蟲啉水劑、5%阿維菌素乳油、5%阿維菌素可濕性粉劑、50%吡蚜酮水分散粒劑、37%噻嗪酮懸浮劑和30%毒死蜱水乳劑）增強了制劑活性成分對赤子愛勝蚓的毒性。

2.3 阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉對赤子愛勝蚓生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 阿維菌素對赤子愛勝蚓生理生化指標(biāo)的影響

由圖1可以看出，赤子愛勝蚓在不同濃度阿維菌素的土壤中暴露14 d之后，體內(nèi)的GST活性出現(xiàn)了明顯的變化，濃度為0.25 mg a.i.·kg-1的土壤中出現(xiàn)了顯著性誘導(dǎo)（P＜0.05），其他濃度組中活性有所下降，并在25、50 mg a.i.·kg-1濃度組出現(xiàn)了顯著性抑制（P＜0.05）；而CAT活性在所有阿維菌素處理組均出現(xiàn)了極顯著抑制；赤子愛勝蚓的T-SOD活性在所有處理組并沒有出現(xiàn)顯著性的變化。

2.3.2 吡蟲啉對赤子愛勝蚓生理生化指標(biāo)的影響

如圖2所示，赤子愛勝蚓在含0.1～5 mg a.i.·kg-1吡蟲啉的土壤中暴露14 d，其體內(nèi)GST活性相比對照組無顯著性變化，但在吡蟲啉濃度為10 mg a.i.·kg-1時出現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)（P＜0.05）；赤子愛勝蚓的CAT活性在不同濃度的吡蟲啉作用下相比對照空白樣出現(xiàn)了下降，在5～10 mg a.i.·kg-1處理組出現(xiàn)了顯著性抑制作用（P＜0.05）；與此相應(yīng)，T-SOD活性在5～10 mg a.i.·kg-1處理組出現(xiàn)了顯著性誘導(dǎo)（P＜0.05）。

注：單位mg a.i.·kg-1中“a.i.”表示農(nóng)藥原藥或制劑中的有效成分（Active ingredient）。下同。Note：“a.i.”in the unit of“mg a.i.·kg-1”indicates the active ingredient in pesticide technicals or formulations.The same below.

表2 常見9種農(nóng)藥制劑對赤子愛勝蚓的急性毒性評價Table 2 Parameter estimates for the acute toxicity of 9 pesticide formulations to E.fetida

2.3.3 噻蟲啉對赤子愛勝蚓生理生化指標(biāo)的影響

如圖3所示，赤子愛勝蚓體內(nèi)GST活性在50 mg a.i.·kg-1的濃度組出現(xiàn)了極顯性抑制（P＜0.01）；而CAT活性在所有噻蟲啉濃度組中均出現(xiàn)了極顯著的抑制作用（P＜0.01），且抑制程度隨著濃度上升而加重；T-SOD活性變化表明，0.1～5 mg a.i.·kg-1的濃度范圍內(nèi)，噻蟲啉對赤子愛勝蚓的T-SOD活性有顯著性誘導(dǎo)作用（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3.4 阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉對赤子愛勝蚓體內(nèi)MDA的影響

從圖4可以看出，赤子愛勝蚓的MDA含量在阿維菌素濃度為0.5 mg a.i.·kg-1時顯著性上升（P＜0.05），表明0.5 mg a.i.·kg-1的阿維菌素對蚯蚓造成了氧化損傷；但在更高濃度組中MDA含量下降，并在50 mg a.i.·kg-1時出現(xiàn)了顯著性下降（P＜0.05）。最低的吡蟲啉暴露濃度（0.1 mg a.i.·kg-1）即可使赤子愛勝蚓的MDA的含量受到極顯著抑制（P＜0.01），且總體上隨著濃度升高抑制作用加大。土壤噻蟲啉在0.5～50 mg a.i.·kg-1的濃度范圍內(nèi)均能極顯著抑制赤子愛勝蚓MDA含量（P＜0.01）。

3 討論

蚯蚓急性毒性測試可快速地對農(nóng)藥生態(tài)毒性予以初步的判斷，探明農(nóng)藥與蚯蚓短時間接觸引起的損傷作用，明確農(nóng)藥毒性作用途徑和劑量-效應(yīng)關(guān)系，并可為農(nóng)藥慢性毒性試驗（如繁殖毒性測試）和田間試驗的濃度設(shè)計提供依據(jù)。因此，急性毒性試驗在蚯蚓的生態(tài)毒理學(xué)研究中具有重要的作用[2-3，5-7]。在我國農(nóng)藥登記與環(huán)境安全性評價中，一般采用人工土壤法作為農(nóng)藥對蚯蚓的急性毒性試驗方法，蚯蚓死亡率（14 d-LD50/LC50）是最常用的評價農(nóng)藥對蚯蚓毒性的指標(biāo)[5，16-17]。

從本研究選擇的20種農(nóng)藥對蚯蚓的急性毒性來看，吡蟲啉、噻蟲啉和克百威等幾種殺蟲劑對赤子愛勝蚓毒性較大，在向土壤施用時需注意其對土壤生物可能具有的不利影響。阿維菌素和高效氯氰菊酯等雖然對水生生物毒性高，但是在土壤中降解相對較快，對蚯蚓的急性毒性低，因此對土壤生物長期影響可能較小。另外，相對活性成分來說，部分農(nóng)藥制劑（65%吡蟲啉水劑、5%阿維菌素乳油、5%阿維菌素可濕性粉劑、50%吡蚜酮水分散粒劑、37%噻嗪酮懸浮劑和30%毒死蜱水乳劑）增強了活性物質(zhì)對赤子愛勝蚓的毒性，說明助劑使用有可能造成農(nóng)藥對土壤生物毒性的增強。有關(guān)助劑對環(huán)境生物的風(fēng)險，曾有學(xué)者對2010—2011年間擬申請登記的368個農(nóng)藥制劑的劑型、助劑品種、作用、含量等基本數(shù)據(jù)進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)只有190個農(nóng)藥制劑提供了助劑信息，助劑類型以乳化劑、溶劑、分散劑等為主，每種農(nóng)藥制劑中含有3～4種助劑成分，平均含量介于1%～99%，助劑使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于農(nóng)藥活性成分；乳油、水乳劑、懸浮劑等農(nóng)藥劑型中含有甲苯、二甲苯、環(huán)己酮和烷基酚聚氧乙烯醚等高毒性成分，其助劑本身或其代謝產(chǎn)物具有三致效應(yīng)、內(nèi)分泌干擾作用、繁殖損失和神經(jīng)毒性等健康風(fēng)險[18]。因此，我國管理部門需要重視助劑的規(guī)范使用，提出切實有效的管理和評價方法。另外，600 g·L-1吡蟲啉懸浮種衣劑對蚯蚓的急性毒性相對原藥有所降低，可能是因為種衣劑里的成膜劑會在一定時間內(nèi)成膜而使藥液緩慢釋放，造成農(nóng)藥活性成分的生物有效性有所降低，表現(xiàn)為這種劑型對蚯蚓急性毒性降低。

圖3噻蟲啉對赤子愛勝蚓GST、CAT和T-SOD活性的影響

Figure 3 Effects of thiaclopridon the activities of GST，CAT and T-SOD in E.fetida

圖4阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉對赤子愛勝蚓MDA含量的影響

Figure 4 Effects of abamectin，imidacloprid and thiacloprid on the MDA contents in E.fetida

需要注意的是，雖然人工土壤法測定的多數(shù)農(nóng)藥品種對蚯蚓毒性等級較低，根據(jù)急性毒性數(shù)據(jù)結(jié)果，在常規(guī)施用劑量的條件下，大多數(shù)農(nóng)藥暴露并不會引起蚯蚓的快速死亡效應(yīng)，但蚯蚓在土壤中長期接觸農(nóng)藥所產(chǎn)生的慢性毒性仍然是不可忽視的，有可能引起除致死效應(yīng)之外的其他不利效應(yīng)，最典型就是對蚯蚓的生長和繁殖具有抑制效應(yīng)。有機磷殺蟲劑暴露對蚯蚓具有較顯著的生長毒性影響，研究發(fā)現(xiàn)5 mg a.i.· kg-1的毒死蜱暴露8周后對蚯蚓生長有不利影響[19]，而蚯蚓體重下降也是氯氰菊酯、草甘膦和百草枯中毒的典型癥狀之一[1-2]。許多農(nóng)藥在低濃度下還能顯著抑制蚯蚓的繁殖[1]。此外，雖然除草劑品種很少對蚯蚓產(chǎn)生直接毒性，但蚯蚓以攝食土壤中的有機質(zhì)為生，而雜草是有機質(zhì)的重要來源之一，因此除草劑可能通過影響雜草的生長而對蚯蚓產(chǎn)生間接作用[7]。隨著我國農(nóng)藥登記管理制度的日益完善，應(yīng)逐步引入類似于美國、歐盟和OECD現(xiàn)行的以多層次農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評價為理念的農(nóng)藥登記管理制度[1]。

多數(shù)情況下僅研究蚯蚓死亡率對農(nóng)藥暴露的響應(yīng)是不夠的，在研究農(nóng)藥對蚯蚓致死效應(yīng)的同時，還需關(guān)注其他毒理效應(yīng)[1，3]。農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS），過量ROS存在則誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)的抗氧化機制和酶保護機制的產(chǎn)生，如誘導(dǎo)SOD和CAT等酶活性發(fā)生改變[20]。阿維菌素由鏈霉菌中灰色鏈霉菌Streptomyces avermitilis發(fā)酵產(chǎn)生，為高效、廣譜的抗生素類殺蟲劑，由一組十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物組成，對螨類和昆蟲具有胃毒和觸殺作用，其作用機制是干擾神經(jīng)生理活動，刺激釋放γ-氨基丁酸，而氨基丁酸對節(jié)肢動物的神經(jīng)傳導(dǎo)有抑制作用；吡蟲啉和噻蟲啉為典型的新煙堿類殺蟲劑，具有獨特的作用機制，其作用靶標(biāo)為乙酰膽堿受體（nAChRs）。鑒于目前針對這幾種殺蟲劑對土壤生物的毒理研究相對較少，本研究選擇抗氧化系統(tǒng)的幾個常見生理生化指標(biāo)對暴露于含受試農(nóng)藥的土壤環(huán)境中的赤子愛勝蚓進行研究，結(jié)果表明除吡蟲啉之外，蚯蚓體內(nèi)的GST、CAT和TSOD對阿維菌素和噻蟲啉暴露均十分敏感，發(fā)生顯著性變化的濃度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LC50值。吡蟲啉暴露下抗氧化酶之所以不敏感，可能是因為抗氧化酶常被用作污染物對生物影響的早期預(yù)警指標(biāo)，在過高的暴露濃度下這些指標(biāo)反而變化不敏感。有趣的是，Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)蚯蚓暴露在2 mg a.i.·kg-1吡蟲啉的人工土壤中1、6、14 d后，體內(nèi)SOD和CAT活性顯著提高，而本研究中含5 mg a.i.·kg-1吡蟲啉的人工土壤則對蚯蚓CAT活性產(chǎn)生顯著性抑制作用。從各個酶學(xué)指標(biāo)對農(nóng)藥暴露的響應(yīng)規(guī)律來看，蚯蚓組織的T-SOD活性在一定濃度的兩種新煙堿類殺蟲劑暴露下均出現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)，有助于蚯蚓對體內(nèi)超氧陰離子的去除，但較高濃度的不同農(nóng)藥暴露下，蚯蚓CAT活性均出現(xiàn)抑制。CAT是生物體內(nèi)催化過氧化氫分解成氧和水的酶，其活性的抑制將導(dǎo)致過氧化氫自由基的累積，有可能對蚯蚓造成過氧化損傷?？寡趸到y(tǒng)在污染物脅迫下的變化是一個較為復(fù)雜的變化，在農(nóng)藥脅迫下，抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶如SOD、CAT、POD和GST的變化指示了蚯蚓體內(nèi)正在進行的解毒反應(yīng)過程。污染物脅迫下，酶活性在蚯蚓體內(nèi)受到非常復(fù)雜的調(diào)控，它的變化與作用劑量和作用時間的關(guān)系非常密切[22]。正因為如此，雖然敏感的酶活性變化在污染物早期預(yù)警研究中很早就受到關(guān)注，但一直較難應(yīng)用到實踐當(dāng)中，對其研究可以為污染物毒性作用特點提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

相當(dāng)多的研究證據(jù)表明，污染物對生物毒性的一個重要體現(xiàn)就是指示過氧化損傷的脂質(zhì)過氧化（LPO）水平的上升[23]。本研究中，蚯蚓組織LPO水平通過測定MDA含量來體現(xiàn)。在不同農(nóng)藥14 d暴露后，僅在0.5 mg a.i.·kg-1阿維菌素暴露組觀察到MDA含量的顯著性上升，表征蚯蚓受到了氧化損傷，但是在高濃度組（50 mg a.i.·kg-1），MDA含量出現(xiàn)了顯著性下降。該現(xiàn)象在新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲啉暴露組里尤為顯著，可能與高濃度農(nóng)藥脅迫下，蚯蚓組織細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的損傷以及自由基水平的變化密切相關(guān)[24-25]。農(nóng)藥對蚯蚓的毒性可以表現(xiàn)在多個方面，近年來的研究發(fā)現(xiàn)包括農(nóng)藥在內(nèi)的多種化學(xué)物質(zhì)會對蚯蚓表皮和中腸造成損害。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)蚯蚓受到吡蟲啉傷害后，表皮分泌細(xì)胞開始增多，膠原纖維開始擴張并在角質(zhì)層內(nèi)形成空泡，上角質(zhì)層增厚，同時也會對蚯蚓的中腸造成傷害，使蚯蚓中腸細(xì)胞變形，高濃度時甚至出現(xiàn)裂解。因此，氧化應(yīng)激和抗氧化損傷僅僅是蚯蚓對農(nóng)藥的毒性響應(yīng)之一，對于對土壤生物具有潛在高風(fēng)險的農(nóng)藥，未來需要開展更多的致毒機制方面的研究[26]。

4 結(jié)論

受試的11種農(nóng)藥原藥（或標(biāo)準(zhǔn)品）對蚯蚓的急性毒性等級從高到低依次為吡蟲啉＞噻蟲啉＞克百威＞毒死蜱＞阿特拉津＞阿維菌素＞草甘膦＞吡蚜酮＞噻嗪酮＞高效氯氰菊酯和百草枯，其中吡蟲啉、噻蟲啉和克百威對蚯蚓的毒性分級為中毒，其余均為低毒。部分農(nóng)藥制劑（65%吡蟲啉水劑、5%阿維菌素乳油、5%阿維菌素可濕性粉劑、50%吡蚜酮水分散粒劑、37%噻嗪酮懸浮劑和30%毒死蜱水乳劑）增加了農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的毒性。赤子愛勝蚓的GST（顯著性誘導(dǎo)）和CAT（顯著性抑制）活性對阿維菌素暴露較為敏感（0.25 mg a.i.·kg-1）；CAT（抑制）和T-SOD（誘導(dǎo)）在5 mg a.i.·kg-1吡蟲啉暴露下出現(xiàn)顯著性變化；0.1 mg a.i. ·kg-1噻蟲啉暴露下，蚯蚓CAT（抑制）和T-SOD（誘導(dǎo)）活性即產(chǎn)生顯著性變化。另外，阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲啉分別在0.5、0.1、0.5 mg a.i.·kg-1的暴露水平，可以誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MDA含量出現(xiàn)顯著性變化。

[1]姜錦林,程燕,卜元卿,等.農(nóng)藥對蚯蚓的生長和繁殖毒性及其在生態(tài)風(fēng)險評價中的應(yīng)用[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2014,35（9）：23-32.

JIANG Jin-lin,CHENG Yan,BU Yuan-qing,et al.Effects of pesticides on the growth and reproduction of earthworm and its application in ecological risk assessment[J].Pesticide Science and Administration,2014, 35（9）：23-32.

[2]Shahla Y,D′souza S.Effects of pesticides on the growth and reproduction of earthworm：A review[J].Applied and Environmental Soil Science, 2010（3）：1-9.

[3]左海根,林玉鎖,龔瑞忠.農(nóng)藥污染對蚯蚓毒性毒理研究進展[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境,2004,20（4）：68-72.

ZUO Hai-gen,LIN Yu-suo,GONG Rui-zhong.Toxicology of pesticide pollution to earthworms[J].Rural Eco-Environment,2004,20（4）：68-72.

[4]Beeby A.What do sentinels stand for?[J].Environmental Pollution,2001,112（2）：285-298.

[5]蔡道基,張壬午,李治祥,等.農(nóng)藥對蚯蚓的毒性與危害性評估[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境,1986,2（2）：14-18.

CAI Dao-ji,ZHANG Ren-wu,LI Zhi-xiang,et al.Toxicity and hazard assessment of pesticides on earthworm[J].Rural Eco-Environment,1986, 2（2）：14-l8.

[6]龔鵬博,李健雄,郭明昉,等.蚯蚓生態(tài)毒理試驗現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].生態(tài)學(xué)雜志,2007,26（8）：1297-1302.

GONG Peng-bo,LI Jian-xiong,GUO Ming-fang,et al.Present status and development trend of earthworm eco-toxicological test[J].ChineseJournal of Ecology,2007,26（8）：1297-1302.

[7]王彥華,俞衛(wèi)華,楊立之,等.22種常用除草劑對蚯蚓（Eisenia fetida）的急性毒性[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2012,7（3）：317-325. WANG Yan-hua,YU Wei-hua,YANG Li-zhi,et al.Acute toxicity of twenty-two commonly used herbicides to earthworm（Eisenia fetida）[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2012,7（3）：317-325.

[8]Frampton G K,Jansch S,Scott-Fordsmand J J.Effects of pesticides on soil invertebrates in laboratory studies：A review and analysis using species sensitivity distributions[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2006,25（9）：2480-2489.

[9]J?nsch S,Amorim M J,R?mbke J.Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species[J].Environmental Reviews,2005,13（2）：51-83.

[10]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 31270.15—2014化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則第15部分：蚯蚓急性毒性試驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of PRC,Standardization Administration of PRC.GB/T 31270.15—2014 Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides.Part 15：Earthworm acute toxicity test[S].Beijing：China Standards Press,2014.

[11]Organization for Economic Co-operation and Development（OECD）. Guideline for testing of chemicals.No.207,Earthworm acute toxicity test[S].Paris：OECD,1984.

[12]Marklund S,Marklund G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].European Journal of Biochemistry,1974,47（3）：169-174.

[13]徐鏡波,袁曉凡.過氧化氫酶活性及活性抑制的紫外分光光度測定[J].環(huán)境化學(xué),1997,16（1）：73-76.

XU Jing-bo,YUAN Xiao-fan.The determination of enzymic activity and its inhibition on catalase by ultraviolet spectrophotometry[J].Environmetnal Chemistry,1997,16（1）：73-76.

[14]Habig W H,Pabst M J,Jakoby W B.Glutathione stransferases：The first enzymatic step in mercapturic acid formation[J].Journal of Biological Chemistry,1974,249（22）：7130-7139.

[15]Miller D M,Aust S D.Studies of ascorbate-dependent,iron catalyzed lipid peroxidation[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1989, 271（1）：113-119.

[16]van Gestel C A M,van Dis W A.The influence of soil characteristics on the toxicity of four chemicals to the earthworm Eisenia fetida andrei（Oligochaeta）[J].Biology and Fertility of Soils,1988,6（3）：262-265.

[17]van Gestel C A M,van Dis W A,van Breemen E M,et al.Development of a standardized reproduction toxicity test with the earthworm species Eisenia fetida andrei using copper,pentachlorophenol,and 2,4-dichloroaniline[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,1989,18（3）：305-312.

[18]卜元卿,王暫暢,智勇,等.農(nóng)藥制劑中助劑使用狀況調(diào)研及風(fēng)險分析[J].農(nóng)藥,2014,53（12）：932-936.

BU Yuan-qing,WANG Zan-chang,ZHI Yong,et al.Investigation and risk analysis of pesticide inert ingredients in pesticide products[J].A-grochemicals,2014,53（12）：932-936.

[19]Zhou S P,Duan C Q,Fu H.Toxicity assessment for chlorpyrifos-contaminated soil with three different earthworm test methods[J].Journal ofEnvironmental Sciences,2007,19（7）：854-858.

[20]Banerjee B D,Seth V,Ahmed R S.Pesticide-induced oxidative stress：Perspective and trends[J].Reviews on Environmental Health,2001, 16（1）：1-40.

[21]Zhang Q M,Zhang B H,Wang C X.Ecotoxicological effects on the earthworm Eisenia fetida following exposure to soil contaminated with imidacloprid[J].Environmental Science and Pollution Research International,2014,21：12345-12353.

[22]王曉蓉,羅義,施華宏,等.分子生物標(biāo)志物在污染環(huán)境早期診斷和生態(tài)風(fēng)險評價中的應(yīng)用[J].環(huán)境化學(xué),2006,25（3）：320-325.

WANG Xiao-rong,LUO Yi,SHI Hua-hong,et al.Application of molecular biomarkers in early diagnosis and ecological risk assessment for water and soil[J].Environmental Chemistry,2006,25（3）：320-325.

[23]Leflaive J,Ten-Hage L.Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters：A comparison of allelopathic compounds and toxins [J].Freshwater Biology,2007,52（2）：199-214.

[24]Yin Y,Wang X R,Sun Y Y,et al.Bioaccumulation and oxidative stress in submerged macrophyteCeratophyllum demersumL.upon exposure to pyrene[J].Environmental Toxicology,2007,23（3）：328-336.

[25]Wang C R,Wang X R,Tian Y,et al.Oxidative stress,defense response, and early biomarkers for lead-contaminated soil in Vicia faba seedlings [J].Environmental Toxicology and Chemistry,2008,27（4）：970-977.

[26]Dittbrenner N,Schmitt H,Capowiez Y,et al.Sensitivity of Eisenia fetida in comparison toAporrectodea caliginosaandLumbricus terrestrisafter imidacloprid exposure：Body mass change and histopathology[J].JournalofSoilsandSediments,2011,11（6）：1000-1010.

Influence of commonly used pesticides on acute toxicity to earthworm Eisenia fetida and alteration of antioxidant enzyme activities

JIANG Jin-lin1,SHAN Zheng-jun1,2*,ZHOU Jun-ying1,2,BU Yuan-qing1,2,TIAN Feng1
（1.Key Laboratory of Pesticide Environmental Assessment and Pollution Control,Nanjing Institute of Environmental Sciences,Ministry of Environmental Protection,Nanjing 210042,China;2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Atmospheric Environment and Equipment Technology（CICAEET）,Nanjing University of Information Science&Technology,Nanjing 210044,China）

In the present study,the acute toxicities of 11 commonly used pesticide technicals（imidacloprid,thiacloprid,avermectin,betacypermethrin,pymtrozine,buprofezin,chlorpyrifos,carbofuran glyphosate,atrazine and paraquat）and other 9 related pesticide formulations on Eisenia fetida were determined by using artificial soil test method.In addition,the several anti-oxidant enzymes（GST,CAT,and T-SOD）activities and MDA contents in Eisenia fetida were also determined after 14-d exposure to imidacloprid,thiacloprid and avermectin to evaluate the oxidative stress induced by pesticides in earthworm.The results show that the acute toxicity order of test pesticides technicals to Eisenia fetida was：imidacloprid＞thiacloprid＞carbofuran＞chlorpyrifos＞atrazine＞avermectin＞glyphosate＞pymtrozine＞buprofezin＞beta-cypermethrin and paraquat.According to the Guidelines of Environmental Safety Evaluation for Chemical Pesticides,imidacloprid,thiacloprid and carbofuran were classified as medium toxic grade to Eisenia fetida under laboratory conditions by using artificial soil test method,while the other 8 pesticides were classified as low toxic grade to Eisenia fetida.The results of the acute toxicities of the pesticide formulations to Eisenia fetida showed that most of the formulations increased the toxicity to Eisenia fetida as compared to their corresponding active ingredients.Besides,the results of physiological and biochemical tests show that the CAT activity in Eisenia fetida was significantly inhibited by exposure to thiacloprid at 0.1 mg a.i.·kg-1soil,while the T-SOD activity in Eisenia fetida was significantly induced by exposure to thiacloprid at the same dose level.The GST activity was significantly induced in Eisenia fetida by exposure to avermectin at 0.25 mg a.i.·kg-1soil.The MDA content in Eisenia fetida was significantly changed by exposure to avermectin,imidacloprid and thiacloprid at 0.5,0.1,and 0.5 mg a.i. ·kg-1,respectively.These results imply that the frequent application of pesticides might have adverse effects on the soil organisms and therefore may disturb the normal ecological function of soil.

pesticides;soil;earthworm;acute toxicity;antioxidant system

X503.22

A

1672-2043（2017）03-0466-08

10.11654/jaes.2016-1095

姜錦林，單正軍，周軍英，等.常用農(nóng)藥對赤子愛勝蚓急性毒性和抗氧化酶系的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（3）：466-473.

JIANG Jin-lin,SHAN Zheng-jun,ZHOU Jun-ying,et al.Influence of commonly used pesticides on acute toxicity to earthworm Eisenia fetida and alteration of antioxidant enzyme activities[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（3）：466-473.

2016-08-23

姜錦林（1984—），男，浙江溫州人，博士，副研究員，從事環(huán)境毒理學(xué)研究。E-mail：jjl@nies.org

*通信作者：單正軍E-mail：szj@nies.org

“十二五”科技支撐計劃（2011BAE06B09）；環(huán)保公益性行業(yè)科研專項（201309026）

Project supported："Twelfth Five-Year"National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China（2011BAE06B09）；Special Fund for Environmental Protection Scientific Research on Public Causes（201309026）