梁艷 張曉燕 王小美 宋晶瑩 白雪娟 陽幼榮 張俊仙 王蘭 許飛虹 史迎昌 吳雪瓊

·論著·

四種結核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結核感染的比較研究

梁艷 張曉燕 王小美 宋晶瑩 白雪娟 陽幼榮 張俊仙 王蘭 許飛虹 史迎昌 吳雪瓊

目的 研究、比較4種結核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結核感染的作用，為開發(fā)新型結核病免疫治療制劑提供實驗依據(jù)。方法 將70只BALB/c小鼠采用數(shù)字表法隨機分為7組，每組10只。以6.4×105菌落形成單位(CFU)結核分枝桿菌標準株H37Rv尾靜脈注射感染小鼠后第3天，分別用生理鹽水、pVAX1載體、微卡菌苗、ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA和rv2223cDNA進行肌內注射，每2周1次，共3次，免疫結束后2周殺鼠，分別取肺和脾觀察其病理改變、稱取肺和脾的質量、做菌落計數(shù)。結果 肺組織病理顯示：生理鹽水組肺組織病變嚴重、廣泛；載體組病變也較嚴重、廣泛，但比生理鹽水組略輕；微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組肺組織病變有不同程度減輕，病變局限，部分區(qū)域肺泡結構完整、清晰，細胞分布均勻。與生理鹽水組相比，ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組肺菌落計數(shù)分別減少0.53 lg CFU、0.67 lg CFU、0.41 lg CFU(χ2=27.07，P<0.01)；脾菌落計數(shù)分別減少0.43 lg CFU(t>3.004，P<0.05)、0.34 lg CFU(t<3.004，P>0.05)、0.41 lg CFU(t>3.004，P<0.05)；微卡菌苗組和rv2223cDNA組肺、脾菌落計數(shù)與生理鹽水組比較均有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義(t值均<3.004，P值均>0.05)。結論 結核分枝桿菌增殖期抗原基因rv1291c和rv1419 DNA與ag85aDNA具有相似的抗結核治療效果，而rv2223cDNA無明顯治療作用。

分枝桿菌，結核； 細菌素質粒； 基因組成分； 免疫療法； 療效比較研究； 動物, 實驗

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的世界性傳染病，根據(jù)2016年WHO報道，2015年全球約有1040萬例新發(fā)結核病患者，印度、印度尼西亞、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非6個國家占新發(fā)患者的60%，有58萬例新發(fā)耐多藥結核病(MDR-TB)和利福平耐藥患者，其中印度、中國和俄羅斯聯(lián)邦占新發(fā)耐藥結核病患者的45%[1]。由于耐多藥結核病的流行、化療藥物的不良反應，以及人類免疫缺陷病毒的感染、免疫抑制劑的應用和年老等原因引起的機體免疫功能低下，使難治性結核病增多，抗結核治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是耐多藥結核病、廣泛耐藥結核病(XDR-TB)面臨無藥可治的困難局面。因此，有必要研制新的安全、有效的抗結核藥物。

結核病是一種細菌性傳染性疾病，從另一個角度來看也是一種細胞免疫疾病。抗結核免疫主要是細胞介導的免疫反應。免疫治療可以通過調節(jié)或選擇性地誘導結核病患者免疫系統(tǒng)蘊藏的潛力，來達到治療疾病的目的。近年來通過免疫調節(jié)輔助治療結核病成為研究的熱點之一，免疫治療制劑的研究與開發(fā)成為一個十分重要的研究方向。將外源基因克隆到真核表達載體上，免疫動物，它在機體細胞內能夠表達蛋白抗原，誘導宿主產生細胞免疫應答和體液免疫應答。筆者前期的研究及國內外研究均已證明，結核分枝桿菌基因在結核病預防和治療中具有廣泛的應用前景[2-9]。因此，筆者研究3種新型的結核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結核感染的作用，并與已有的ag85aDNA進行比較，為開發(fā)新型結核病免疫治療制劑提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1. 結核分枝桿菌菌株和基因來源：結核分枝桿菌標準株H37Rv由中國食品藥品檢定研究院提供；微卡菌苗(注射用母牛分枝桿菌)購自安徽智飛龍科馬生物制藥有限責任公司，規(guī)格22.5 μg/支；結核分枝桿菌ag85a、rv1291c、rv1419和rv2223c質粒DNA均由解放軍第三〇九醫(yī)院結核病重點實驗室構建、制備，濃度均為1.0 mg/ml；pVAX1載體購自美國Invitrogen公司，由解放軍第三〇九醫(yī)院結核病重點實驗室制備，濃度為1 mg/ml。

2. 實驗動物：73只6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

二、方法

1. 小鼠結核感染：每只小鼠經尾靜脈注射0.4 ml 含6.4×105菌落形成單位(CFU)的結核分枝桿菌標準株H37Rv菌懸液。

2. 小鼠結核病模型制備情況：感染后3 d，采用數(shù)字表法隨機取3只小鼠進行解剖，肉眼觀察小鼠肺和脾大體病理改變；并進行肺和脾的活菌計數(shù)，方法是取小鼠全肺加生理鹽水研磨，加等體積 4% NaOH 消化30 min后, 倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周；取小鼠脾加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周，進行菌落計數(shù)。

3. 實驗分組：小鼠感染后，采用數(shù)字表法隨機將小鼠分為7組，每組10只小鼠。小鼠感染后第3天開始治療。(1)生理鹽水組：每只小鼠肌內注射100 μl生理鹽水；(2)pVAX1載體組：每只小鼠肌內注射100 μg/100 μl pVAX1載體；(3)微卡菌苗組：每只小鼠肌內注射25 μg/100 μl微卡；(4)ag85aDNA組：每只小鼠肌內注射100 μg/100 μlag85aDNA；(5)rv1291cDNA組：每只小鼠肌內注射100 μg/100 μlrv1291cDNA；(6)rv1419 DNA組：每只小鼠肌內注射100 μg/100 μlrv1419 DNA；(7)rv2223cDNA組：每只小鼠肌內注射100 μg/100 μlrv2223cDNA，各治療組每2周免疫1次，共3次。

4. 肺組織病理學檢查：治療結束后2周，取小鼠肺右葉固定于10%中性福爾馬林，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，鏡下觀察肺組織病理改變。

5. 肺、脾菌落計數(shù)：治療結束后2周，取小鼠肺左葉稱重，加生理鹽水研磨，加等體積 4% NaOH 消化30 min后, 倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周，將得到的肺左葉菌落數(shù)根據(jù)肺左葉和全肺的質量換算為全肺菌落數(shù)；取脾的上半部分稱重，加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃ 溫箱培養(yǎng)4周，將得到的脾的上半部分的菌落數(shù)根據(jù)脾上半部分的質量和全脾的質量換算為全脾菌落數(shù)。

三、 統(tǒng)計學分析

結 果

一、小鼠結核病模型的建立

感染后3 d，全肺平均荷菌量為2.0×106CFU；全脾平均荷菌量為6.8×105CFU。小鼠肺臟均有明顯的壞死，脾臟都有腫大。

二、肺臟組織病理改變

治療結束后2周，小鼠肺組織鏡下病理改變的代表性結果見圖1。生理鹽水組肺組織病變嚴重、廣泛，充血、實變，正常肺泡結構消失，肺泡腔內可見大量的漿液纖維素性滲出，可見大量的淋巴細胞浸潤；pVAX1載體組病變程度也較嚴重、廣泛，但比生理鹽水組略輕；微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組肺組織病變程度較輕，病變局限，可見少量的淋巴細胞浸潤，部分區(qū)域可見正常的肺泡結構，肺泡輪廓相對清晰，細胞分布均勻。

三、 肺組織活菌計數(shù)

生理鹽水組、pVAX1載體組、微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組全肺平均菌落數(shù)依次是(7.33±0.18) lg CFU、(7.23±0.10) lg CFU、(7.08±0.37) lg CFU、(6.80±0.41) lg CFU、(6.66±0.60) lg CFU、(6.92±0.41) lg CFU和(7.13±0.25) lg CFU。與生理鹽水組相比，各治療組中只有ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組全肺平均菌落數(shù)明顯減少(χ2=27.07，P<0.01)，分別減少了0.53 lg CFU、0.67 lg CFU和0.41 lg CFU；微卡菌苗組和rv2223cDNA組雖分別減少了0.25 lg CFU和0.2 lg CFU，但差異無統(tǒng)計學意義(Student-Newman-Keulsq檢驗，P值均>0.05)。結果見圖2。

四、脾組織活菌計數(shù)

生理鹽水組、pVAX1載體組、微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組全脾平均菌落數(shù)依次是(6.92±0.12) lg CFU、(6.81±0.07) lg CFU、(6.65±0.35) lg CFU、(6.49±0.21) lg CFU、(6.58±0.25) lg CFU、(6.51±0.20) lg CFU和(6.65±0.22) lg CFU。與生理鹽水組相比，各治療組中只有ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組全脾平均菌落數(shù)明顯減少(F=4.03，P=0.0019)，分別減少0.43 lg CFU(t>3.004，P<0.05)、0.34 lg CFU(t<3.004，P>0.05)、0.41 lg CFU(t>3.004，P<0.05)；微卡菌苗組和rv2223cDNA組雖分別減少了0.27 lg CFU，但差異無統(tǒng)計學意義(t值均<3.004，P值均>0.05)。結果見圖3。

圖1 治療結束后2周各組小鼠肺組織病理檢查結果(HE ×100)(a)生理鹽水組； (b) pVAX1載體組；(c) 微卡菌苗組；(d) ag85a DNA組；(e) rv1291c DNA組；(f) rv1419 DNA組；(g) rv2223c DNA組

圖2 治療結束后2周各組小鼠肺菌落計數(shù)結果

圖3 治療結束后2周各組小鼠脾菌落計數(shù)結果

討 論

結核病保護性免疫主要是細胞免疫, 誘導細胞免疫反應的抗原主要存在于結核分枝桿菌的細胞壁、細胞質和培養(yǎng)濾液中, 其中分泌蛋白和細胞壁表面的蛋白是主要的免疫保護性抗原, 能誘導機體產生較強的免疫應答，將成為新疫苗研究的首選靶抗原[10]。結核分枝桿菌rv1419基因由474 bp組成，編碼一個由157個氨基酸組成的蛋白質，是分子質量最小的凝集素[11]，該蛋白屬于蓖麻毒素B型三葉草形蛋白質家族[12]，存在于結核分枝桿菌H37Rv培養(yǎng)濾液中，而非結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中則不存在[13]。這種凝集素可以調節(jié)多種生物過程，比如細胞與細胞間的黏附、細胞的有絲分裂和固有免疫過程等，尤其是在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮重要作用。劉銀萍等[14]用生物信息學的方法預測結核分枝桿菌Rv1419是一個T細胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原。在活動性肺結核的患者中，Rv1419蛋白可刺激外周血單個核細胞產生大量的γ-干擾素(IFN-γ)，此外，在活動性肺結核患者的血清中，Rv1419也顯示產生了高滴度的IgG抗體，并且抗體滴度在結核病有效治療后隨之下降[15]。結核分枝桿菌rv2223c基因由 1563 bp組成，編碼一個由 520 個氨基酸組成的脂肪酶；Lun和Bishai[16]通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)Rv2223c氨基酸序列與Rv2224c同源性為51.2%，相似性為64.6%，它們含有相同的結構域，而且活性位點甘氨酸-酪氨酸-絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸(G-Y-S-Y-G)殘基是完全保守的，推測Rv2223c功能可能與Rv2224c相同，是一個具有羧酸酯酶活性的分泌蛋白。結核分枝桿菌rv1291c基因由 336 bp 組成，編碼一個由 111 個氨基酸組成的分泌蛋白。McMurry等[17]應用Rv2223c和Rv1291c多肽分別刺激PPD陽性者，然后通過酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測發(fā)現(xiàn)分別有48%和12%的PPD陽性者的T細胞分泌IFN-γ，通過ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)分別有11%和15%的PPD陽性者外周血單個核細胞分泌IFN-γ。鑒于上述3種抗原均能誘導機體產生Th1型細胞因子，因此本研究將這3種蛋白的編碼基因克隆入真核表達載體。

鑒于微卡菌苗是一個已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批文的免疫調節(jié)劑，多年臨床輔助結核病治療結果表明其能增強結核病患者的細胞免疫功能，使結核病患者體質量增加，加快痰菌陰轉、病灶吸收及空洞縮小、閉合的速度[18-21]；而Ag85A是結核分枝桿菌和BCG主要的分泌性蛋白，筆者前期研究[2-5]和國內外學者的研究[6-8]表明，ag85aDNA具有較好的免疫原性、治療作用和免疫保護作用。因此，本研究選擇微卡菌苗和ag85aDNA作為陽性對照，通過結核感染動物模型評價3種新型的結核分枝桿菌基因的免疫治療作用，以篩選具有免疫治療作用的基因，為開發(fā)新型結核病疫苗奠定實驗基礎。

筆者首次發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌增殖期抗原rv1291c、rv1419編碼基因對小鼠結核模型具有治療作用，減少肺、脾結核分枝桿菌載量，能減輕結核病變程度。從肺、脾細菌載量和肺組織病變程度來看，ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA組肺、脾組織活菌數(shù)均顯著減少，表明ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA均能調動機體免疫力，在體內具有一定的抑菌和殺菌作用，能顯著減輕肺病理損傷。但此次動物實驗顯示的治療效果不如筆者以前的研究報道[2]；2008年筆者的動物實驗顯示，ag85aDNA可減少結核感染小鼠肺、脾活菌數(shù)達1.3 lg CFU和1.0 lg CFU，同時肺部病變程度也明顯減輕。Zhu等[22]報道ag85bDNA也可減少結核感染小鼠肺、脾活菌數(shù)達0.7 lg CFU和1.2 lg CFU，同時肺部病變程度也減輕。Hu 等[23]聯(lián)合應用表達3種分泌蛋白 Ag85B、MPT64 和 MPT83 的DNA組也能使結核感染牛的肺菌落數(shù)減少10倍，從而減輕肺部病變。這些報道均證明，部分結核分枝桿菌基因克隆在真核表達載體上對結核病具有較好的免疫治療作用，聯(lián)合應用能夠獲得更好的療效，這為未來開發(fā)聯(lián)合基因疫苗提供了實驗依據(jù)。雖然不同批次的動物實驗獲得的結果不完全一樣，但經過多次動物實驗或臨床應用已證明ag85aDNA和微卡菌苗均具有較好的抗結核效果[2-7, 18-20]；本研究顯示rv1291cDNA、rv1419 DNA的抗結核療效與ag85aDNA相似，而rv2223cDNA與微卡菌苗相似，盡管本次動物實驗未能顯示出微卡菌苗和rv2223cDNA的治療效果，但也不能排除rv2223cDNA具有一定的免疫治療作用。盡管微卡菌苗未表現(xiàn)出明顯減少細菌載量的作用，但是從微卡菌苗的肺組織病理上看，其病變程度還是比較輕的，是有一定治療作用的，其原因可能在于此次感染小鼠的菌量較大。

總之，筆者新發(fā)現(xiàn)2種結核分枝桿菌增殖期抗原編碼基因rv1291c、rv1419對結核分枝桿菌具有抑制或殺滅作用，能減輕結核病變程度，對小鼠結核感染模型具有治療作用，可作為治療結核病新疫苗的候選靶標，未來將對rv1291c、rv1419基因進行更深入的研究。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva: World Health Organization, 2016.

[2] Liang Y, Wu XQ, Zhang JX, et al. The treatment of mice infected with multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosisusing DNA vaccines or in combination with rifampin. Vaccine, 2008, 26(35):4536-4540.

[3] 吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等. 結核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗免疫治療作用的研究. 中國免疫學雜志, 2002, 18(1):17-22.

[4] Liang Y, Wu X, Zhang J, et al. Treatment of multi-drug-resistant tuberculosis in mice with DNA vaccines alone or in combination with chemotherapeutic drugs. Scand J Immunol, 2011, 74(1):42-46.

[5] 梁艷，吳雪瓊，張俊仙，等. 結核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗抗結核作用的研究. 中國防癆雜志, 2012, 34(3): 181-183.

[6] Ha SJ, Jeon BY, Kim SC, et al. Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice withMycobacteriumtuberculosis. Gene Therapy, 2003, 10(18):1592-1599.

[7] Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VLD, et al. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature, 1999, 400(6741):269-271.

[8] Huygen K, Content J, Denis O, et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nat Med,1996, 2(8):893-898.

[9] Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, et al. DNA vaccines. Annu Rev Immunol，1997, 15: 617-648.

[10] 吳雪瓊. 結核分枝桿菌保護性抗原的研究進展. 中華結核和呼吸雜志, 2006, 29(5): 340-342.

[11] Singh DD, Chandran D, Jeyakani J, et al. Scanning the genome ofMycobacteriumtuberculosisto identify potential lections. Protein pept lett, 2007,14(7): 683-691.

[12] Patra D, Srikalaivani R, Misra A, et al. Cloning, expression, purification, crystallization and preliminary X-ray studies of a secreted lectin (Rv1419) fromMycobacteriumtuberculosis. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2010, 66(Pt 12):1662-1665.

[13] Nogueira L, Cardoso FC, Mattos AM, et al.MycobacteriumtuberculosisRv1419 encodes a secreted 13 kD a lectin with immunological reactivity during human tuberculosis. Eur J Immunol, 2010, 40(3): 744-753.

[14] 劉銀萍, 王全立, 張俊仙, 等. 結核分枝桿菌 Rv1419 蛋白抗原表位的預測. 中國防癆雜志, 2015, 37(1): 52-55.

[15] Paetzel M, Dalbey RE, Strynadka NC. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature, 1998, 396(6707): 186-190.

[16] Lun S, Bishai WR. Characterization of a novel cell wall-anchored protein with carboxylesterase activity required for virulence inMycobacteriumtuberculosis. J Biol Chem, 2007, 282(25): 18348-18356.

[17] McMurry J,Sbai H, Gennaro ML, et al. AnalyzingMycobacteriumtuberculosisproteomes for candidate vaccine epitopes. Tuberculosis, 2005,85(1): 95-105.

[18] 王倩，張潔，黃淑萍，等.母牛分枝桿菌菌苗輔助治療復治性及耐多藥結核的Meta分析.中國藥房, 2008,19(11): 838-841.

[19] 初乃惠，羅永艾，朱莉貞，等. 化療加免疫長療程方案治療耐多藥結核病的隨機對照研究.中國防癆雜志, 2009,31(1):10-14.

[20] 范妙儀, 陳雪融, 王可, 等. 母牛分枝桿菌菌苗輔助治療復治肺結核的Meta 分析. 中國循證醫(yī)學雜志, 2007, 7 (6): 449-455.

[21] Stanford JL, Bahr GM, Rook GA, et al. Immunotherapy withMycobacteriumvaccaeas an adjucant to chemotherapy in the treatment of pulmonary tuberculosis. Tubercle, 1990, 71(2): 87-93.

[22] Zhu DY, Jiang S, Luo XD. Therapeutic effects of Ag85B and MPT64 DNA vaccines in a murine model ofMycobacteriumtuberculosisinfection. Vaccine, 2005, 23(37): 4619-4624.

[23] Hu XD, Chen ST, Yua DH, et al. Immunotherapy with combined DNA vaccines is an effective treatment forM.bovisinfection in cattle. Vaccine, 2009, 27(9): 1317-1322.

(本文編輯：范永德)

A comparative study on four kinds of genes encoding the antigens in proliferation phase againstMycobacteriumtuberculosisinfection in mice

LIANGYan,ZHANGXiao-yan,WANGXiao-mei,SONGJing-ying,BAIXue-juan,YANGYou-rong,ZHANGJun-xian,WANGLan,XIUFei-hong,SHIYing-chang,WUXue-qiong.

ArmyTuberculosisKeyLaboratory,TuberculosisResearchInstitute，the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email：wu-xueqiong@263.net

Objective To compare the anti-tuberculosis effects of four kinds of genes encoding the antigens in proliferation phase ofM.tuberculosisin mouse tuberculosis (TB) model, and provide experimental basis for developing new TB immunotherapy agents. Methods Seventy female BALB/c mice were infected via the tail vein with 6.4×105CFUs ofM.tuberculosisH37Rv, then randomly divided into 7 groups and treated as follow at the third day after infection：saline, plasmid vector pVAX1,M.vaccaevaccine,ag85aDNA,rv1291cDNA,rv1419 DNA andrv2223cDNA, which were injected intramuscularly 3 times at two-week intervals. The mice were sacrificed at two weeks after the final immunization. The lungs and spleens from the mice were taken and their pathological changes, weights and number of mycobacterial colony were examined. Data were expressed as means and standard deviations. Results The lung histopathological examination showed that the lesions were severe and extensive in saline group, lighter in plasmid vector pVAX1 group than those in saline group, slight and limited in theM.vaccaevaccine,ag85aDNA,rv1291cDNA,rv1419 DNA andrv2223cDNA groups with relatively clear and normal structure of alveoli. Compared with saline group,ag85aDNA group,rv1291cDNA group andrv1419 DNA group reduced the pulmonary bacterial loads respectively by 0.53 lg CFU, 0.67 lg CFU and 0.41 lg CFU (χ2=27.07，P<0.01); spleen bacterial loads respectively by 0.43 lg CFU (t>3.004,P<0.05), 0.34 lg CFU (t<3.004,P>0.05), and 0.41 lg CFU (t>3.004,P<0.05);M.vaccaevaccine andrv2223cDNA groups also decreased lung and spleen bacterial loads, but there were not significant differences (t<3.004，allP<0.05). ConclusionM.tuberculosisrv1291candrv1419 genes encoding the antigens in proliferation period had better immunotherapeutic effects on TB, which were similar toag85aDNA in mice.Rv2223cDNA had not obvious immunotherapeutic effect.

Mycobacteriumtuberculosis； Bacteriocin plasmids； Genome components； Immunotherapy； Comparative effectiveness research； Animals, laboratory

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.005

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX-10003-008)

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室 結核病診療新技術北京市重點實驗室

吳雪瓊，Email：wu-xueqiong@263.net

2016-11-11)