陳曦 姜廣路 賈紅彥 張宗德

·論著·

炎性小體中凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白抗結(jié)核分枝桿菌感染作用的研究

陳曦 姜廣路 賈紅彥 張宗德

目的 分析核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)炎性小體在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染小鼠中的免疫保護(hù)作用。方法 選取無(wú)免疫缺陷的野生型(wide type，WT)C57BL/6小鼠、半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠用于體內(nèi)MTB感染實(shí)驗(yàn)，各種系小鼠骨髓和腹腔巨噬細(xì)胞用于體外MTB感染實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)小鼠分為2組：第1組中4種小鼠各感染30只，用于細(xì)菌載量分析、細(xì)胞因子檢測(cè)及生存期評(píng)價(jià)；第2組中4種小鼠各感染15只，用于組織病理學(xué)分析及肺組織細(xì)胞流式分析；實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4周時(shí)各種系小鼠各取1只未感染小鼠作為對(duì)照。檢測(cè)感染小鼠的生存率及肺組織勻漿中細(xì)菌載量；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，測(cè)定未感染野生型小鼠、感染小鼠肺組織勻漿中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-12p40(IL-12p40)、IL-1β和γ-干擾素(IFN-γ)水平；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠感染后肺組織中的浸潤(rùn)細(xì)胞組分及細(xì)胞壞死情況，并以ELISA法分析支氣管灌洗液和血清中壞死相關(guān)因子高遷移率族蛋白1(HMGB-1)和IL-1α的分泌情況；對(duì)感染肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析；采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)半胱天冬酶-1的成熟情況；采用ELISA法測(cè)定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β水平。結(jié)果 感染MTB 24 h后，野生型小鼠骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β水平明顯高于半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠[分別為：(316.29±4.64) pg/ml、(21.30±2.37) pg/ml、(22.99±0.46) pg/ml、(32.61±0.22) pg/ml；F=30.53，P<0.01]；野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β水平也明顯高于半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠[分別為：(2970.36±11.53) pg/ml、(130.48±2.52) pg/ml、(120.24±3.43) pg/ml、(121.66±2.48) pg/ml；F=549.92，P<0.01]。與野生型小鼠相比，半胱天冬酶-/-和NLRP3-/-小鼠未表現(xiàn)出對(duì)MTB抵抗力的降低，感染29周后生存率分別為72.2%(13/18)、66.7%(12/18)、61.1%(11/18)，但ASC-/-小鼠對(duì)MTB高度易感，感染4～12周后全部死亡。感染4周時(shí)，ASC-/-小鼠肺臟細(xì)菌載量較野生型小鼠、半胱天冬酶-1-/-及NLRP3-/-小鼠升高約100倍(菌落計(jì)數(shù)分別為0.93×107±426、5.07×105±221、5.32×105±209、5.26×105±606；F=87.74，P<0.01)，顯微鏡檢表現(xiàn)為急性壞死性肺炎，壞死細(xì)胞數(shù)量明顯增高，伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且全肺細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于野生型小鼠、半胱天冬酶-1-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠[分別為(10 342.64±103.56)×105、(3014.26±22.87)×105、(2919.28±36.75)×105、(2974.77±17.35)×105；F=349.11，P<0.01)；ASC-/-小鼠中與細(xì)胞壞死相關(guān)的血清HMGB-1、支氣管灌洗液HMGB-1和支氣管灌洗液中IL-1α水平較野生型小鼠明顯升高[血清HMGB-1水平分別為(155 893.36±168.30) pg/ml、(5112.56±43.62) pg/ml；t=-206.98，P<0.01；支氣管灌洗液HMGB-1水平分別為(137.80±1.67) ng/ml、(75.16±1.47) ng/ml；t=-21.71，P<0.01；支氣管灌洗液IL-1水平分別為(848.17±4.40) ng/ml、(197.04±2.93) ng/ml；t=-54.78，P<0.01]。結(jié)論 在MTB感染中，ASC分子具有獨(dú)立于炎性小體NLRP3和半胱天冬酶-1的關(guān)鍵保護(hù)性作用。ASC-/-小鼠中肺組織病理異常與增強(qiáng)的細(xì)胞壞死相關(guān)，細(xì)胞過(guò)度壞死引起組織損傷，可能造成的細(xì)菌載量升高及過(guò)度的免疫反應(yīng)都可能導(dǎo)致宿主死亡。

分枝桿菌，結(jié)核； 巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)類； 自身免疫； 抗生作用； 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

全球約有1/3人口感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，但約 90% 的感染者沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀，只有免疫功能受損的感染者易發(fā)生結(jié)核病[1]。因此，闡明宿主保護(hù)性免疫機(jī)制尤為重要。MTB感染宿主巨噬細(xì)胞后，可促進(jìn)NOD樣受體蛋白(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing card，ASC) 和半胱天冬酶-1蛋白組裝為炎性小體復(fù)合體，隨后半胱天冬酶-1成熟、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18分泌[2-4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，MTB毒力株H37Rv能以NLRP3和ASC依賴的方式，激活半胱天冬酶-1、引起IL-1β分泌[5]。但其他研究顯示，MTB誘導(dǎo)的半胱天冬酶-1激活及IL-1β分泌是非NLRP3和ASC依賴性的[6]。盡管之前的研究顯示小鼠敲除半胱天冬酶-1基因并沒(méi)有增強(qiáng)其對(duì)MTB的易感性[7], 但也有研究證實(shí)半胱天冬酶-1和 ASC基因敲除使小鼠在MTB感染后期易感性部分提高[8]。因此，MTB感染時(shí)炎性小體各組成蛋白發(fā)揮免疫保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。本研究旨在闡述炎性小體及其組分在宿主抵抗MTB感染中的免疫保護(hù)作用。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取無(wú)免疫缺陷的野生型(wide type，WT)C57BL/6小鼠、半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠用于體內(nèi)MTB感染實(shí)驗(yàn)和體外MTB感染實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中，小鼠分為2組：第1組中4種小鼠各感染30只，用于細(xì)菌載量分析、細(xì)胞因子檢測(cè)及生存期評(píng)價(jià)；第2組中4種小鼠各感染15只，用于組織病理學(xué)分析及肺組織細(xì)胞流式分析；并以4種未感染小鼠作為對(duì)照，對(duì)照小鼠每次試驗(yàn)各取1只。體外感染實(shí)驗(yàn)中每次實(shí)驗(yàn)4種小鼠各取1只，收集腹腔巨噬細(xì)胞用于MTB感染，體外感染實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。未感染對(duì)照小鼠及MTB感染小鼠均在無(wú)特異性病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)，每周常規(guī)監(jiān)測(cè)感染小鼠身體狀態(tài)和體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，依據(jù)動(dòng)物倫理委員會(huì)的程序執(zhí)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)操作。

2.儀器與試劑：流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)偶聯(lián)F4/80抗體、抗小鼠Gr1-PE抗體、FITC偶聯(lián)CD4抗體、抗小鼠CD8-PE抗體、核酸染料(7-amino-actinomycin D，7AAD)、重組小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、兔抗半胱天冬酶-1 p10 IgG購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-12p40、IL-1β、IL-1α、IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；γ-干擾素(IFN-γ)、高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB-1)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自加拿大BD Bioscience Pharmingen公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC購(gòu)自加拿大Caltag Laboratories 公司；抗兔IgG 偶聯(lián)過(guò)氧化物酶、超敏電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)檢測(cè)試劑盒(ECL plus)購(gòu)自瑞典GE Healthcare 公司；DNA酶Ⅰ(德國(guó)Sigma公司)，膠原蛋白酶D(德國(guó)Roche公司)，抗鼠β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(日本Sigma-Aldrich公司)，70 μm尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)(美國(guó)BD Biosciences公司)，RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640(美國(guó)Gibco公司)，10%胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；巰基乙酸鹽、苯巴比妥、乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet P-40)、亮肽素、抑肽素A、抗蛋白酶肽、二硫蘇糖醇購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

3.菌株及培養(yǎng)條件：MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)菌，應(yīng)用玻璃珠震蕩以分散成團(tuán)細(xì)菌，靜置30 min；收集上層懸浮菌液，于-80 ℃小份保存。菌液凍融后，150×g離心2 min，去除殘存的細(xì)菌團(tuán)，上層懸液用于感染實(shí)驗(yàn)。菌液10倍稀釋后，接種于7H10瓊脂培養(yǎng)板，于3周后計(jì)數(shù)克隆形成單位(CFU)。

4.腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞收集及體外MTB感染：體外感染實(shí)驗(yàn)中，首先收集小鼠腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞。小鼠腹腔注射3 ml巰基乙酸鹽培養(yǎng)基溶液，3 d后收集腹腔巨噬細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640洗滌后，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37 ℃孵育3 h，再次洗滌，貼壁細(xì)胞用于MTB感染。從小鼠股骨和脛骨中收集骨髓細(xì)胞，在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和100 ng/ml GM-CSF的RPMI 1640 培養(yǎng)基中孵育5 d，RPMI 1640洗滌，貼壁細(xì)胞用于MTB感染。

在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)/孔鋪板，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為5，感染3 h。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌后在含有10%胎牛血清的RPMI 1640中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，用于細(xì)胞因子檢測(cè)和免疫蛋白印跡分析。

5.MTB體內(nèi)感染及細(xì)菌載量測(cè)定：在預(yù)實(shí)驗(yàn)中3只野生型小鼠在苯巴比妥麻醉下，鼻腔接種30 μl H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株[菌液濃度5×103～5×104菌落形成單位(CFU)/ml]，24 h后處死小鼠，檢測(cè)小鼠肺組織中細(xì)菌載量，驗(yàn)證MTB接種劑量。體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中MTB感染方法同預(yù)實(shí)驗(yàn)，第1組小鼠感染1、2、3、4周后分別從4種小鼠中各取3只，處死后收集肺、肝、脾，PBS勻漿。依次以10倍法稀釋組織勻漿，接種于7H10培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，3周后計(jì)數(shù)菌落。感染4周后，收集小鼠臟器的同時(shí)，每只小鼠以700 μl PBS沖洗氣道、收集支氣管灌洗液，并收集小鼠血清。收集的臟器組織勻漿、血清及支氣管灌洗液用于細(xì)胞因子檢測(cè)。剩余感染小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，用于生存期觀察。

6.組織病理學(xué)分析：體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中第2組小鼠感染4周后，每種小鼠各取3只，收集小鼠肺臟，經(jīng)10%福爾馬林固定后，取部分組織分別進(jìn)行HE染色、Zeil-Neilson 染色。

7.肺組織細(xì)胞流式分析：體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中第2組小鼠感染1、2、3、4周后，每種小鼠各取3只，深度麻醉，以PBS灌洗雙肺，直至肺組織完全變白。取出雙肺，剪碎為1～2 mm3的小塊，置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mg/ml 和20 ng/ml DNA酶Ⅰ的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃輕搖孵育1 h，組織消化液經(jīng)70 μm尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，收集單細(xì)胞懸液。NH4Cl/Tris溶液裂解紅細(xì)胞后，臺(tái)盼藍(lán)溶液染色死亡細(xì)胞，全部肺臟細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次，濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，依據(jù)染色抗體的說(shuō)明書進(jìn)行染色。染色后洗滌2次，以1%福爾馬林固定，流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)中所用染色抗體為F4/80-FITC、Gr1-PE、CD4-FITC、CD8-PE和7AAD。應(yīng)用CellQuest 軟件(美國(guó)BD公司)分析數(shù)據(jù)。

8.細(xì)胞因子及半胱天冬酶-1測(cè)定：按照ELISA試劑盒的操作程序，分別測(cè)定腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清、肺組織勻漿、支氣管灌洗液和血清中的TNF-α、IL-12p40、IL-1β、IL-1α、IFN-γ和HMGB-1。為檢測(cè)半胱天冬酶-1，感染巨噬細(xì)胞洗滌后，進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解液成分為：PBS、1%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、1 μg/ml 亮肽素、1 μg/ml 抑肽素A、1.5 μg/ml抗蛋白酶肽和2 mmol/L二硫蘇糖醇。裂解產(chǎn)物中檢測(cè)半胱天冬酶-1前體、培養(yǎng)上清液中檢測(cè)其活性形式(p10)。樣品分別進(jìn)行免疫蛋白印跡分析，以兔抗半胱天冬酶-1 p10 IgG、抗兔IgG偶聯(lián)過(guò)氧化物酶、ECL Plus顯色?？故螃?actin單克隆抗體用于對(duì)照內(nèi)參β-actin檢測(cè)。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。本研究中所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. MTB感染巨噬細(xì)胞中炎性小體活化機(jī)制：首先測(cè)定了野生型小鼠、半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠和 NLRP3-/-小鼠骨髓和腹腔巨噬細(xì)胞感染MTB 24 h后IL-1β的分泌。結(jié)果顯示，野生型小鼠骨髓巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-1β，明顯高于半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠、NLRP3-/-小鼠和未感染小鼠巨噬細(xì)胞分泌水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。免疫印跡分析顯示，只在感染的野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到半胱天冬酶-1的成熟形式半胱天冬酶-1(p10)，見圖1。

2.各種系小鼠感染H37Rv后細(xì)菌載量和生存情況：低劑量的鼻內(nèi)感染(約200 CFU/只)可引起ASC-/-小鼠快速死亡。感染3周后，ASC-/-小鼠體質(zhì)量逐漸下降，感染4～12周后全部死亡(表2)；感染4周后肺組織細(xì)菌載量，較其他小鼠高約100倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。但半胱天冬酶-1-/-和 NLRP3-/-小鼠與野生型小鼠感染后依然能夠控制體內(nèi)急性感染，感染29周后的生存率分別達(dá)到66.7%(12/18)、61.1%(11/18)和72.2%(13/18)，見表2、圖2。

表1 各種系小鼠巨噬細(xì)胞感染MTB前后白細(xì)胞介素-1β分泌情況的比較

圖1 各種系小鼠腹腔巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后半胱天冬酶-1表達(dá)

感染后時(shí)間野生型小鼠[只(生存率,%)]ASC-/-小鼠[只(生存率,%)]半胱天冬酶-1-/-小鼠[只(生存率,%)]NLRP3-/-小鼠[只(生存率,%)]感染4周18(100.0)18(100.0)18(100.0)18(100.0)感染5周18(100.0)12(66.7)18(100.0)18(100.0)感染7周18(100.0)4(22.2)18(100.0)18(100.0)感染9周18(100.0)3(16.7)18(100.0)18(100.0)感染12周18(100.0)0(0.0)18(100.0)18(100.0)感染26周18(100.0)0(0.0)18(100.0)18(100.0)感染27周15(83.3)0(0.0)18(100.0)16(88.9)感染28周13(72.2)0(0.0)15(83.3)11(61.1)感染29周13(72.2)0(0.0)12(66.7)11(61.1)感染30周12(66.7)0(0.0)12(66.7)7(38.9)

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ASC-/-小鼠感染4周后肺組織表現(xiàn)為胸膜粘連，伴有巨大、融合結(jié)節(jié)，而半胱天冬酶-1-/-和NLRP3-/-小鼠與野生型小鼠表現(xiàn)一致。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)ASC-/-小鼠存在嚴(yán)重的急性壞死性肺炎，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。但野生型小鼠、NLRP3-/-和半胱天冬酶-1-/-小鼠肺組織中，雖然伴有浸潤(rùn)性細(xì)胞，但組織結(jié)構(gòu)破壞不明顯，表現(xiàn)為典型的肉芽腫。受損肺組織Zeil-Neilson染色結(jié)果與細(xì)菌載量結(jié)果一致，ASC-/-小鼠炎癥細(xì)胞內(nèi)、外均存在大量MTB(圖 3)。

圖2 各種系小鼠低劑量鼻內(nèi)感染H37Rv 后不同時(shí)間的生存率

3.細(xì)胞因子分泌情況：與體外實(shí)驗(yàn)相比，半胱天冬酶-1-/-、ASC-/-和NLRP3-/-小鼠感染MTB后正常分泌IL-1β。盡管ASC-/-小鼠對(duì)MTB易感性升高(肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù)升高)，但肺組織中炎性小體介導(dǎo)的促炎因子如TNF-α、IFN-γ、IL-12p40的產(chǎn)生沒(méi)有受到明顯損傷。與其他小鼠相比，ASC-/-小鼠感染4周后，IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

圖3 各種系小鼠感染4周后病理組織學(xué)染色結(jié)果

免疫指標(biāo)野生型小鼠ASC-/-小鼠半胱天冬酶-1-/-小鼠NLRP3-/-小鼠統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)值P值肺臟組織勻漿菌落計(jì)數(shù)(x±s) 感染1周209±12205±6204±14201±7F=2.940.058 感染2周3992±443846±194002±113931±25F=2.990.081 感染3周0.82×106±3421.10×106±2010.78×106±5170.80×106±201F=5.750.047 感染4周5.07×105±2210.93×107±4265.32×105±2095.26×105±606F=87.74<0.01肺組織勻漿IL-1β(x±s,pg/ml) 陰性對(duì)照58.93±7.9665.33±0.2632.10±1.4754.85±1.12F=0.640.612 感染1周687.91±2.88674.29±3.33632.78±3.94811.67±6.73F=1.130.395 感染2周1509.03±17.541232.11±9.25 1225.97±12.19908.77±14.25F=2.050.186 感染3周2567.26±13.732220.40±19.082316.04±14.812387.16±23.18F=0.970.452 感染4周2214.13±28.204209.36±12.792427.65±21.211943.86±13.83F=146.04<0.01肺組織勻漿TNF-α(x±s,pg/ml) 陰性對(duì)照12.60±1.7410.62±0.9122.97±1.2817.95±0.20F=1.820.221 感染1周254.37±4.60178.66±2.81180.74±2.29182.48±2.22F=1.760.232 感染2周807.81±6.30678.57±13.29717.94±4.01897.56±5.85F=0.830.515 感染3周1565.65±15.241219.86±27.771231.89±16.521368.79±13.62F=2.310.153 感染4周1021.45±10.932642.16±15.151224.68±22.731413.20±11.33F=72.09<0.01肺組織勻漿IL-12p40(x±s,pg/ml) 陰性對(duì)照21.64±1.2011.47±0.759.70±1.1828.58±0.74F=0.220.878 感染1周358.73±1.33274.17±2.83294.86±4.80312.56±1.89F=0.420.745 感染2周930.80±6.91598.38±6.39698.78±6.61745.80±5.11F=3.910.054 感染3周1543.44±6.37 1715.45±9.62 1512.29±16.43 1522.67±14.25 F=3.680.062 感染4周2165.88±17.641876.86±24.29 2589.70±18.33 2712.77±34.94 F=3.660.063肺組織勻漿IFN-γ(x±s,pg/ml) 陰性對(duì)照87.65±2.3743.86±1.2032.19±0.4736.85±0.88F=1.150.385 感染1周278.66±3.13253.42±3.67312.79±1.78290.44±2.17F=0.550.663 感染2周980.86±5.821400.74±18.41 1104.93±9.80 1523.17±8.46 F=1.210.366 感染3周1524.86±10.201873.51±20.35 1237.65±12.69 1496.60±9.31 F=3.210.083 感染4周3652.76±32.943354.63±44.27 3321.34±62.75 3312.75±42.12 F=3.010.094全肺細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s,×105個(gè)) 感染1周193.33±3.10214.56±2.97187.38±3.21207.60±0.31F=2.520.132 感染2周1908.45±8.29 1893.22±17.80 1833.48±9.96 2004.34±4.22 F=1.070.415 感染3周2132.77±10.353812.06±44.93 2033.18±7.34 2058.40±6.66 F=70.52<0.01 感染4周3014.26±22.8710342.64±103.56 2919.28±36.75 2974.77±17.35 F=349.11<0.01

注 “-”：實(shí)驗(yàn)中未使用此種小鼠

4.細(xì)胞流式分析及細(xì)胞壞死相關(guān)因子分泌情況：ASC-/-小鼠感染MTB 4周后，細(xì)胞總數(shù)較其他種系小鼠明顯增高；流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)ASC-/-小鼠肺組織中F4/80+-Gr1+全肺巨噬細(xì)胞和F4/80--Gr1+全肺中性粒細(xì)胞明顯升高，與組織學(xué)結(jié)果一致；但ASC-/-小鼠全肺CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞總數(shù)與其他小鼠沒(méi)有明顯差異，見表3。感染4周后，與野生型小鼠相比，ASC-/-小鼠血清和支氣管灌洗液中HMGB-1和IL-1α的水平也明顯升高(表3)，與此結(jié)果一致的是顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ASC-/-小鼠肺組織中存在大量壞死細(xì)胞及大量細(xì)胞碎片(臺(tái)盼藍(lán)染色，圖3)，但野生型小鼠感染MTB 4周后沒(méi)有發(fā)生壞死性肺炎。

討 論

本研究證實(shí)，半胱天冬酶-1以依賴 NLRP3和ASC的方式成熟，巨噬細(xì)胞分泌IL-1β需要NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1炎性小體活化。這與之前的研究結(jié)果一致[2]，還發(fā)現(xiàn)在宿主抵抗MTB感染的保護(hù)性免疫中，接頭蛋白分子ASC以不依賴NLRP3和半胱天冬酶-1的方式發(fā)揮關(guān)鍵作用。McElvania Tekippe等[9]也發(fā)現(xiàn)在MTB感染中，ASC分子對(duì)于宿主保護(hù)性免疫和肉芽腫形成是至關(guān)重要的。另外，Dorhoi等[10]發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、NOD樣受體(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)和β-葡聚糖受體(Dectin-1)信號(hào)下游存在另外一種接頭蛋白——胱天蛋白酶募集域蛋白(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)，CARD9缺失的小鼠對(duì)MTB高度易感，感染肺組織的病理表現(xiàn)類似于ASC-/-小鼠。與缺失髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)或CARD9的小鼠相比，缺失一個(gè)或多個(gè)TLRs 和(或)NOD2受體的小鼠結(jié)核易感性并未明顯升高。因此，本研究支持Dorhoi提出的“對(duì)于控制MTB感染，‘接頭分子’可能比‘受體’重要”這一科學(xué)假設(shè)[10]。

本研究未發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶-1-/-小鼠對(duì)MTB易感性增高，這與較早的研究結(jié)果一致[7]，但在Mayer-Barber等[8]的研究中，與野生型小鼠相比，ASC-/-和 半胱天冬酶-1-/-小鼠對(duì)MTB更易感。可能的原因是小鼠基因背景、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突蚓甓玖Φ纫蛩夭槐M相同，導(dǎo)致半胱天冬酶-1-/-小鼠感染后出現(xiàn)不同結(jié)果。該推測(cè)已經(jīng)在對(duì)結(jié)核病患者的研究中得到證實(shí)，即NLRP3炎性小體編碼基因的多態(tài)性與結(jié)核病的活動(dòng)性相關(guān)[11-12]；另外，MTB感染可引起NLRP3 炎性小體編碼基因的甲基化修飾，抑制了炎性小體蛋白表達(dá)[13]，提示MTB對(duì)宿主免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控也會(huì)影響易感性。ASC-/-小鼠對(duì)MTB易感性升高，提示ASC分子具有不可或缺的、獨(dú)立發(fā)揮保護(hù)性免疫作用的特點(diǎn)。

反應(yīng)性氮類、IFN-γ、TNF-α、IL-12p40和IL-1β在小鼠控制MTB感染中起到關(guān)鍵作用[14]。本研究中，NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1分子對(duì)IL-1β分泌單獨(dú)發(fā)揮作用，該結(jié)果與之前報(bào)道一致[8-9]。值得關(guān)注的是，與MyD88-/-小鼠相比，ASC-/-小鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β分泌增強(qiáng)，且升高程度相似[7]，提示體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)的對(duì)于細(xì)胞因子分泌發(fā)揮重要作用的接頭分子的缺失，在體內(nèi)感染過(guò)程中可由復(fù)雜的替代途徑來(lái)彌補(bǔ)。本結(jié)果進(jìn)一步表明鼻內(nèi)感染模型中，至少在感染早期，ASC-/-小鼠不能控制MTB感染不能歸因于下游炎性小體依賴性或獨(dú)立性的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的缺失。

之前觀察到MyD88和CARD9缺失小鼠雖然獲得性免疫不受影響，能夠正常募集、激活淋巴細(xì)胞，但感染MTB后卻發(fā)生了致命性感染[10，15]。盡管本研究沒(méi)有排除ASC-/-小鼠獲得性免疫存在缺失(主要的肺組織病理學(xué)表現(xiàn)為肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞)，但肺組織中IFN-γ水平?jīng)]有明顯降低。該結(jié)果提示過(guò)度的局部炎癥性反應(yīng)對(duì)感染宿主不僅是有害的，而且也是主要的致死原因。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，MTB感染過(guò)程中凋亡具有保護(hù)性作用[16]；而組織細(xì)胞壞死則可引起致命性細(xì)菌播散[17]。鑒于ASC是參與凋亡途徑的接頭分子[18]，因此，可以假設(shè)ASC分子缺失可能造成感染細(xì)胞發(fā)生壞死，或進(jìn)一步釋放壞死相關(guān)的炎癥因子；細(xì)胞壞死或壞死相關(guān)因子的釋放反過(guò)來(lái)又可能延長(zhǎng)感染部位炎癥反應(yīng)時(shí)間，從而使局部組織出現(xiàn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，甚至組織結(jié)構(gòu)破壞。為了證實(shí)這種可能性，本研究對(duì)肺組織中細(xì)胞的壞死情況進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)了該假設(shè)。

HMGB-1和IL-1α是細(xì)胞壞死的分子標(biāo)志物，尤其 HMGB-1是感染晚期分泌的一種促炎因子，在細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)的膿毒性休克中發(fā)揮主要作用，已證實(shí)HMGB-1能夠提高骨髓細(xì)胞募集、啟動(dòng)和延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)，從而造成過(guò)度的炎癥反應(yīng)。因此，細(xì)胞壞死增多，并伴隨壞死分子標(biāo)志物釋放，可能解釋感染部位炎癥反應(yīng)升高，進(jìn)一步發(fā)生局部組織結(jié)構(gòu)破壞及宿主最終的死亡。另外，細(xì)胞壞死導(dǎo)致的MTB播散，也是肺組織中細(xì)菌載量升高的原因之一。

野生型小鼠感染MTB后肺臟未發(fā)生壞死性肺炎，雖然也觀察到細(xì)胞壞死較不感染小鼠增高，但并沒(méi)有明顯差異。原因之一可能是二者肺組織中能夠引起細(xì)胞壞死的細(xì)胞因子如IL-1α與HMGB-1的水平無(wú)差異，沒(méi)有引起過(guò)度的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死；不僅如此，研究中也證實(shí)了ASC分子對(duì)小鼠肺臟感染MTB后的免疫保護(hù)也起到關(guān)鍵的作用。另外，本研究只觀察了感染4周后的細(xì)胞壞死水平，并未對(duì)感染小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期觀察檢測(cè)。因此，不排除野生型小鼠MTB長(zhǎng)期感染后，肺臟細(xì)胞壞死水平發(fā)生變化。

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(本文編輯：李敬文)

Protection role of ASC in host resistance againstMycobacteriumtuberculosisinfection

CHENXi,JIANGGuang-lu,JIAHong-yan,ZHANGZong-de.

DepartmentofMolecularBiology,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGZong-de,Email:zzd417@163.com

Objective To investigate the role of NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain-containing protein 3) inflammasome in host protective immunity againstMycobacteriumtuberculosis(MTB) infection. Methods Wild type (WT) C57BL/6 mice, mice deficient in either caspase-1,ASC or NLRP3 and the peritoneal macrophages (PECs) and bone-marrow derived macrophages (BMDMs) from corresponding mice were used to performinvitroinfection experiments with MTB. Mice were divided into 2 groups. In the first group, each type 30 mice were infected with MTB to analyze the bacterial loads, the concentration of cytokine and survival of mice. In the second group, 15 mice from each type were also infected with MTB for pathological examination and flow cytometry. At the first, second, third and fourth week after infection, one uninfected mouse from each type was used as control. The survival of mice and bacterial loads was determined from the lung homogenates after challenge of infection by MTB. The level of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-12p40 (IL-12p40), IL-1β and interferon γ (IFN-γ) from lung homogenates was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Lung inflammatory cells were analyzed by flow cytometric analysis and the lung cells necrosis was tested respectively. ELISA determined the level of high-mobility group box 1 (HMGB-1) and IL-1α from bronchial veolar lavage fluid (BALF) and serum. Histopathological analysis was performed. Western blotting was performed to determine the mature of caspase-1 after infected with MTB. The productions of IL-1β in BMDMs and PECs obtained from WT, caspase-1-/-, ASC-/-and NLRP3-/-mice infected by MTB were determined. Results The levels of IL-1β produced by BMDMs and PECst which were obtained from WT mice was significantly higher than those obtained from caspase-1-/-, ASC-/-and NLRP3-/-mices infected with MTB post infection by 24 hour (BMDMs: (316.29±4.64) pg/ml, (21.30±2.37) pg/ml, (22.99±0.46) pg/ml, (32.61±0.22) pg/ml;F=30.53,P<0.01; PECs: (2970.36±11.53) pg/ml, (130.48±2.52) pg/ml, (120.24±3.43) pg/ml, (121.66±2.48) pg/ml;F=549.92,P<0.01). When compared with WT mice, mice deficient in caspase-1-/-and NLRP3-/-exhibited no decrease in the resistance to MTB infection, and the survival rates after infection of 29 weeks were 72.2% (13/18), 66.7% (12/18) and 61.1% (11/18), respectively. In contrast, the mice deficient in ASC-/-showed high susceptibility to MTB infection, which resulted into 100% of mortality rate during 4-12 weeks after infection. By the forth week after infection, the bacterial burden in the lungs of mice deficient in ASC-/-(0.93×107±426) was 100 times higher than those of WT mice (5.07×105±221), mice deficient in caspase-1-/-(5.32×105±209) and NLRP3-/-(5.26×105±606), respectively (F=87.74,P<0.01). Morphological analysis revealed that the number of the lung cells in the lungs of ASC-/-mice ((10 342.64±103.56)×105) were increased significantly than that from WT mice ((3014.26±22.87)×105), caspase-1-/-((2919.28±36.75)×105) and NLRP3-/-group ((2974.77±17.35)×105) after the infection by 4 weeks, respectively (F=349.11,P<0.01). The concentrations of HMGB-1 and IL-1α associated with necrosis were further detected by ELISA, and our data revealed that the concentrations of HMGB-1 in serum (155 893.36±168.30) pg/ml) and BALF (137.80±1.67 ng/ml) and IL-1a in BALF (848.17±4.40 ng/ml) of mice deficient in ASC-/-were significantly higher than those of WT mice (5112.56±43.62 pg/ml,t=-206.98,P<0.01 for HMGB-1 in serum; 75.16±1.47 ng/ml,t=-21.71,P<0.01 for HMGB-1 in BALF; and 197.04±2.93 ng/ml；t=-54.78，P<0.01 for IL-1α in BALF), respectively. Conclusion Our findings demonstrate that ASC molecule plays a protective role against MTB infection, which is independent from NLRP3 and caspase-1. The unusual presentations in the lungs of mice deficient in ASC-/-are associated with the increased necrosis. The excessive tissue damage may result in the increased bacterial burden and immune response, thereby leading to the mortality of hosts deficient in ASC-/-.

Mycobacteriumtuberculosis; Macrophage inflammatory proteins; Autoimmunity; Antibiosis; Animals, laboratory

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.003

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2015ZX10004801-003)；重大傳染病防治協(xié)同創(chuàng)新中心科技項(xiàng)目(PXM2015_014226_000058)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所分子生物學(xué)研究室

張宗德，Email：zzd417@163.com

2016-07-06)