譚宇 羅薇 曹海峰 房兵 楊秩

ADAM10對小鼠顱頜面膜內(nèi)成骨的影響

譚宇 羅薇 曹海峰 房兵 楊秩

目的探索解聚素樣金屬蛋白酶10（ADAM10）對小鼠顱頜面骨骼膜內(nèi)成骨的影響。方法應(yīng)用組織免疫熒光染色及蛋白免疫印跡研究ADAM10在小鼠顱頜面骨中的不同時間點、不同部位的表達(dá)水平。通過cre-loxp技術(shù)在胚胎小鼠顱頜面骨骼中特異性敲除ADAM10基因，應(yīng)用體視顯微鏡觀察基因敲除小鼠的顱頜面畸形，X線檢查、von Kossa染色檢測基因敲除小鼠骨鈣化情況，雙標(biāo)免疫熒光觀察基因敲除小鼠骨組織細(xì)胞增殖、分化、凋亡能力的改變。結(jié)果組織免疫熒光染色顯示小鼠上、下頜骨成骨活躍區(qū)ADAM10表達(dá)明顯，同時蛋白免疫印跡結(jié)果證實，ADAM10在小鼠出生前后表達(dá)高，成年后表達(dá)明顯降低。大體觀察基因敲除小鼠身體體型較小，顱頜面畸形表現(xiàn)為面中部發(fā)育不足，上下頜骨發(fā)育不足，顱頂塌陷。X線片檢測及von Kosaa染色顯示基因敲除小鼠全身骨骼密度減低，骨組織形成較弱。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)ADAM10基因敲除小鼠下頜骨細(xì)胞增殖、成骨分化能力減低、凋亡增加。結(jié)論ADAM10廣泛表達(dá)于小鼠膜內(nèi)成骨區(qū)域，可能通過影響骨組織細(xì)胞增殖、分化及凋亡來調(diào)控小鼠顱面部膜內(nèi)成骨過程。

解聚素樣金屬蛋白酶10顱頜面骨骼膜內(nèi)成骨

神經(jīng)嵴干細(xì)胞是一群從神經(jīng)管側(cè)面分化而來的多潛能分化細(xì)胞[1]。神經(jīng)嵴干細(xì)胞在顱頜面復(fù)合體形成過程中扮演重要角色，可分化為成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞。顱頜面復(fù)合體大部分組織主要是通過膜內(nèi)成骨或軟骨內(nèi)成骨途徑形成[2]。其中，顱底和下頜骨髁突是通過軟骨內(nèi)成骨途徑形成；大部分顱頜面骨骼，包括上下頜骨都是通過膜內(nèi)成骨方式發(fā)育形成的。膜內(nèi)成骨開始于間充質(zhì)干細(xì)胞聚集，細(xì)胞分化為定向成骨細(xì)胞前體，最終分化為成熟成骨細(xì)胞，并形成骨質(zhì)[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，顱頜面骨骼膜內(nèi)成骨過程，受轉(zhuǎn)化因子、生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外機(jī)制等多途徑調(diào)控，但顱頜面骨骼發(fā)育的機(jī)制仍不清楚。

解聚素樣金屬蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管發(fā)育，以及腫瘤、阿茨海默癥等發(fā)生中作用重大[4-5]。研究表明，ADAM10在小鼠長骨中顯著表達(dá)[6]。ADAM10基因全敲除小鼠在胚胎9.5 d死亡，限制了ADAM10在顱頜面骨骼發(fā)育中作用的研究。因此，本實驗使用ADAM10條件敲除小鼠，以探索ADAM10的功能及其在顱頜面膜內(nèi)成骨中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)管理[SYXK(滬)2012-0007]。小鼠發(fā)育時間按檢到陰栓的當(dāng)日中午定為胚胎0.5 d。本研究動物實驗嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部）標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］、OCT膠（SAKURA公司，日本）、抗ADAM10抗體（Abcam公司，英國）、抗GAPDH抗體（CST公司，美國）、Hoechst（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、BrdU（Sigma公司，美國）、Tunel試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）、驢抗小鼠、驢抗兔熒光二抗（Invitrogen公司，美國）。

冰凍組織切片機(jī)（SHINVA公司，中國）、體視顯微鏡（Cannon公司，日本）、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）、PCR擴(kuò)增儀（Roche公司，瑞士）。

1.3Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠的獲得

Wnt1基因為顱神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)志性基因。經(jīng)由Wnt1-Cre小鼠和ADAM10flox/flox小鼠兩步交配獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠，即表達(dá)Wnt1基因的細(xì)胞中特異性敲除ADAM10基因的小鼠。第一步，Wnt1-Cre小鼠與ADAM10flox/flox小鼠交配，獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/wt小鼠；第二步，Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠與ADAM10flox/flox小鼠交配，獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠。選擇雄性Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠和雌性ADAM10flox/flox小鼠交配，則可獲得穩(wěn)定的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠群。

1.4 條件性基因敲除小鼠基因型的鑒定

剪取待鑒定小鼠鼠尾約2 mm，提取DNA。在長波紫外光下分析DNA條帶，Wnt1-Cre小鼠基因鑒定結(jié)果為500 bp條帶，ADAM10flox/flox小鼠基因鑒定結(jié)果為400 bp條帶，ADAM10flox/wt小鼠為一條400 bp條帶和一條200 bp條帶（圖1）。

圖1 條件性基因敲除小鼠基因型的鑒定Fig.1Genotype identification of conditional knockout mice

1.5 實驗動物分組

按基因型鑒定結(jié)果，分為顱神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性ADAM10條件敲除小鼠，即Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox，以及同窩對照小鼠ADAM10flox/flox兩組。

1.6 小鼠骨組織冰凍切片制備

取小鼠置于冰上處死。小鼠剝皮處理，使用1× PBS心包灌注，沖洗至沖出液呈現(xiàn)透明。4%多聚甲醛灌注固定，至小鼠四肢及尾部僵直，固定24～48 h。30%蔗糖梯度脫水，OCT膠包埋小鼠頭顱，連續(xù)切片（厚度30 μm）。切片置于60℃烘箱30 min，待冷卻至室溫，-20℃保存。

1.7 免疫蛋白印跡

取E14.5、E17.5、P0、P7及成年小鼠下頜骨骨組織，液氮中研磨后，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，測量蛋白濃度。配制免疫蛋白印跡凝膠，提取蛋白樣品、電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉非特異性蛋白結(jié)合位點，加入封閉緩沖液稀釋的一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入封閉緩沖液稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗，顯色液顯色，膠片顯影，將顯影膠片掃描后使用分析軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。重復(fù)實驗3次，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1.8 免疫熒光

冰凍切片置于搖床上，PBS清洗，5%BSA+3‰Triton封閉打孔，一抗4℃孵育24 h，PBS清洗，加入二抗及Hoechst，37℃避光2 h，PBS避光清洗。熒光封片劑封片，置于-20℃保存。激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

1.9 X線觀察

對E15.5小鼠以5.0 kV、6.0 sec條件拍攝小鼠全身X線片。

1.10von Kossa染色

組織玻片PBS清洗，2%硝酸銀浸染30～60 min，蒸餾水清洗5 min，5%硫代硫酸鈉水溶液處理2 min，自來水清洗5 min，0.1%核固紅染液復(fù)染1～2 min，蒸餾水清洗5～10 sec，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片后，置通風(fēng)櫥中干燥。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)均獨立重復(fù)3次以上，采用兩樣本均數(shù)t檢驗進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計軟件為SPSS Statistics 17.0。

2 結(jié)果

2.1 ADAM10在下頜骨發(fā)育過程中的表達(dá)

免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，下頜骨中可見ADAM10表達(dá)（圖2A），并且ADAM10在胚胎期14.5 d至出生后7 d高表達(dá)，成年后表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖2B）。免疫熒光染色顯示，ADAM10在顱頜面骨膜內(nèi)成骨區(qū)域表達(dá)明顯，如上、下頜骨區(qū)域（圖2C）。

2.2 ADAM10條件敲除小鼠顱頜面骨骼發(fā)育異常

選取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠與其同窩ADAM10flox/flox對照小鼠，進(jìn)行顱頜面的大體形態(tài)觀察對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E15.5的Wnt1-Cre/ ADAM10flox/flox小鼠體型較小，面中部及上、下頜骨發(fā)育不足，顱頂塌陷（圖3）。

2.3 ADAM10條件敲除小鼠上、下頜骨骨鈣化、骨沉積異常

選取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠與其同窩ADAM10flox/flox對照小鼠的全身X線觀察對比發(fā)現(xiàn)，Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠骨骼較小、骨密度降低，兩組差異顯著（圖4A、B）。

von Kossa染色觀察發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠上、下頜骨骨形成區(qū)域骨小梁紊亂，上、下頜骨黑色染色區(qū)域較少，即成骨組織形成較弱，與對照組相比差異顯著（圖4C、D）。

2.4 ADAM10條件敲除小鼠下頜骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡異常

通過免疫熒光對Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠及對照組進(jìn)行成骨分化相關(guān)標(biāo)記物檢測發(fā)現(xiàn)，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠在顱頜面的成骨細(xì)胞標(biāo)記物OCN表達(dá)降低，成骨分化能力減弱，與對照組相比差異顯著（圖5A、D）。BrdU標(biāo)記和免疫熒光檢測顯示，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目較少，但與對照組無顯著差異（圖5B、E）。Tunel原位檢測試劑盒檢測小鼠下頜骨組織的細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠下頜骨凋亡細(xì)胞明顯增加，與對照組差異顯著（圖5C、F）。

圖2 ADAM10在下頜骨發(fā)育過程中的時空表達(dá)（*：P＜0.05）Fig.2Expression of ADAM10 in mice during intramembranous ossification(*:P＜0.05)

圖3ADAM10條件性基因敲除小鼠顱頜面發(fā)育異常Fig.3Conditional knockout of ADAM10 triggered craniofacial dysmorphia

圖4 ADAM10條件基因敲除小鼠骨密度、骨鈣化降低（*：P＜0.05）Fig.4Reduced maxilla and mandibular calcification in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

圖5 ADAM10條件基因敲除小鼠下頜骨細(xì)胞分化、增殖及凋亡能力的改變（*：P＜0.05）Fig.5Cell proliferation,apoptosis and osteoblast differentiation in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

3 討論

本研究中，我們主要探索ADAM10在小鼠顱頜面骨，特別是下頜骨發(fā)育中的作用。結(jié)果顯示，ADAM10特異性高表達(dá)于顱頜面骨骼膜內(nèi)成骨區(qū)域，并且在生長發(fā)育不同階段表達(dá)量變化顯著。ADAM10條件性敲除小鼠呈現(xiàn)顱頜面骨及軟組織發(fā)育異常。細(xì)胞學(xué)研究表明，ADAM10條件性敲除小鼠下頜骨前成骨細(xì)胞成骨能力降低、下頜骨區(qū)域細(xì)胞凋亡增加。表明ADAM10在顱頜面骨骼發(fā)育中具有重要作用。

Dallas等[6]在新生小鼠脛骨中發(fā)現(xiàn)，ADAM10特異性高表達(dá)于關(guān)節(jié)軟骨和骨干骺端。本研究有類似發(fā)現(xiàn)，ADAM10在上、下頜骨成骨區(qū)域特異性高表達(dá)，但在成年小鼠中表達(dá)顯著降低，提示ADAM10可能參與上、下頜骨膜內(nèi)成骨過程。

ADAM10功能紊亂可導(dǎo)致多種嚴(yán)重病理結(jié)果。Isozaki等[7]研究表明，ADAM10在關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及癌癥組織中高表達(dá)。Woods等[8]發(fā)現(xiàn)ADAM10相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)流失，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和遷移。Pliássova等[9]報道，ADAM10與阿茨海默癥發(fā)病密切相關(guān)。研究表明，ADAM10在中樞神經(jīng)、心血管系統(tǒng)、小腸及腎皮質(zhì)等發(fā)育中具有重要作用[10-12]。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，ADAM10影響破骨細(xì)胞功能，造成骨骼異常[13]。

顱頜面的大部分骨組織都是由顱神經(jīng)嵴細(xì)胞通過膜內(nèi)成骨發(fā)育而來[14]。ADAM10全身敲除小鼠在胚胎期第9.5天死亡，限制了顱頜面骨骼發(fā)育的相關(guān)研究。既往有研究報道使用Wnt1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠探索特定基因在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞中的作用[18]。因此，本實驗使用Wnt1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在神經(jīng)嵴細(xì)胞中特異性敲除ADAM10，研究ADAM10在顱頜面骨骼發(fā)育中的作用。

本研究中，實驗組小鼠上、下頜骨長度及寬度與對照組相比均顯著減小。X線檢查發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠骨密度明顯降低。von Kossa染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠上、下頜骨膜內(nèi)成骨區(qū)域骨小梁紊亂。這些結(jié)果表明，ADAM10在顱頜面骨骼膜內(nèi)成骨過程中作用重大。

研究證明，ADAM10對多個系統(tǒng)發(fā)育中的干細(xì)胞增殖及分化，具有不可忽視的調(diào)控作用[15-17]。本研究中，我們通過OCN染色發(fā)現(xiàn)，ADAM10基因敲除小鼠成骨細(xì)胞分化顯著降低。然而，細(xì)胞成骨分化降低并不能完全解釋ADAM10基因敲除小鼠骨骼發(fā)育異常。我們進(jìn)一步研究基因敲除小鼠細(xì)胞增殖及凋亡能力的改變，發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠下頜骨細(xì)胞凋亡顯著增加、增殖能力降低。

綜上所述，本研究證實ADAM10在小鼠顱頜面骨膜內(nèi)成骨過程中發(fā)揮重要作用。敲除ADAM10會影響細(xì)胞成骨向分化、增殖及凋亡，進(jìn)而造成顱頜面骨發(fā)育異常。

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（收稿日期：2016年12月21日；修回日期：2016年1月19日）

The Effects of ADAM10 in Craniofacial Intramembranous Ossification of Mice

ObjectiveTo explore the effects of ADAM10 in craniofacial intramembranous ossification of mice.Methods The expression pattern of ADAM10 in mice mandibular was detected by immunofluorescence assay and western blot.Creloxp technique was used to detect the function of ADAM10 in intramembranous ossification areas during craniomaxillofacial development.ADAM10 conditional knock-out mice was evaluated by X-ray and von Kossa staining.The cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were detected by immunofluorescence assay.ResultsImmunofluorescence assay revealed that ADAM10 was primarily distributed in the maxillary and mandibular skeletal genesis zones.ADAM10 was abundantly expressed from E14.5 to postnatal day 7(P7)and was significantly decreased during adulthood.On E15.5,the ADAM10 cKO mice exhibited a shorter snout,flatter posterior skull and smaller maxilla and mandible,compared with the control littermates.The X-ray examination and von Kossa staining shown that the ADAM10 cKO embryos exhibited significantly reduced mineral bone deposition in the maxilla and mandible.Immunofluorescence shown that cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were impaired in ADAM10 cKO mice.ConclusionADAM10,widely expressed in osteogenesis area of mice,can affect the intramembranous bone formation by regulating cell proliferation,differentiation and apoptosis.

ADAM10;Maxillofacial bone;Intramembranous bone formation

R336

A

1673－0364（2017）01－0013－05

TAN Yu1,LUO Wei2,CAO Haifeng3, FANG Bing3,YANG Zhi3．
1 The Second Dental Center,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Department of Orthodontics,Shanghai Stomatological Hospital,Shanghai 200011,China;3 Department of Oral&Cranio-maxillofacial Science,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FANG Bing(E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn); YANG Zhi(E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com).

2016年7月24日；

2016年9月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.004

上海市科委面上項目（14ZR1424100）；國家自然科學(xué)基金青年項目（81000451）；上海市衛(wèi)生局青年科研項目（2010y142）；上海市教委優(yōu)秀青年教師項目；上海市第九人民醫(yī)院優(yōu)青項目；上海市衛(wèi)計委青年項目（20154Y0181）；上海市口腔病防治院面上項目（SSDC-2013-01）。

201900上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔第二門診部（譚宇）；200001上海市上海市口腔病防治院口腔正畸科（羅薇）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔顱頜面科正頜正畸中心（曹海峰，房兵，楊秩）。

房兵（E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn）；楊秩（E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com）。

注：譚宇、羅薇為共同第一作者。