劉特津，鐘希文，張文霞，陳向英，鮑俊林

（1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400；2．廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528400）

正交試驗(yàn)法優(yōu)化水松葉中總黃酮的提取工藝研究

劉特津1，鐘希文1，張文霞1，陳向英1，鮑俊林2

（1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400；2．廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528400）

目的：采用正交試驗(yàn)法對(duì)水松葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：運(yùn)用紫外分光光度法測(cè)定水松葉的總黃酮含量，采用L9（34）正交試驗(yàn)法考察浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)、固液比各因素對(duì)水松葉的總黃酮含量的影響，優(yōu)化提取條件。結(jié)果：水松葉總黃酮的最佳提取工藝為浸泡時(shí)間30 min，提取時(shí)間2 h，提取2次，固液比1︰20。結(jié)論：該工藝操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可提高水松葉中總黃酮的提取率。

水松葉；總黃酮；正交試驗(yàn)法；提取工藝

水松葉為杉科水松屬植物水松（Glyptostrobus pensilis）的葉，又名水松毛、水松須，是我國傳統(tǒng)中藥，水松葉性寒，味苦，我國民間主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，高血壓、皮炎等[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，水松葉中含有豐富的槲皮苷等黃酮類化合物，且秋季水松葉總黃酮含量比春季水松葉高[2-3]。至目前為止，尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道水松葉中總黃酮提取工藝的優(yōu)化研究，為了提高水松葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)以水松葉中總黃酮的含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出最佳提取工藝，旨在篩選出簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行的水松葉總黃酮的提取方法，為水松葉的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與資料

1.1 儀器

JP-300A高效多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）；JJ200型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；CRLB-15005電爐（肇慶金雅樂電器有限公司）；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）；DK-8D電熱恒溫三孔水槽（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；UV-2550分光光度計(jì)（島津）；實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器。

1.2 材料

水松葉由康美藥業(yè)股份有限公司提供（批號(hào)：150306413），經(jīng)中山市中醫(yī)院鑒定為杉科水松屬植物水松（Glyptostrobus pensilis）的葉；蘆丁對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：10080-200707）；純化水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備取水松葉粗粉10 g，置于150 mL錐形瓶中，加石油醚100 mL，超聲提取30 min，棄去石油醚液，待殘?jiān)鼡]干，粉末置于烘箱中105℃干燥30 min，取出，裝袋，備用。取處理后的水松葉粗粉1 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，然后加熱回流2 h，保持微沸，回流結(jié)束后取出放冷，稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過。濾渣重復(fù)提取1次，濾過，合并濾液，取續(xù)濾液4 mL，置50 mL容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，得水松葉供試品液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，配成濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 波長(zhǎng)的確定取供試品溶液與對(duì)照品溶液各2 mL，置于25 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻繼續(xù)靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，靜置15 min，按紫外-可見分光光度法試驗(yàn)，以相應(yīng)的試劑為空白，在200～600 nm波長(zhǎng)掃描，結(jié)果，蘆丁對(duì)照品溶液與水松葉供試品溶液在509 nm有最大波長(zhǎng)吸收，故確定509 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，見圖1。

圖1 對(duì)照品與供試品波長(zhǎng)掃描圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加水到6.0 mL。分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻繼續(xù)靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，靜置15 min。在509 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)[4]，繪制吸光度-蘆丁質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

回歸結(jié)果表明，蘆丁在0.000～0.040 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)精密量取2.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.1.4”方法操作顯色，定容于25 mL容量瓶中。在509 nm波長(zhǎng)連續(xù)測(cè)定5次吸光度。結(jié)果，RSD＝1.21%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液2.0 mL，按“2.1.4”方法操作顯色，定容于25 mL容量瓶中。分別在0，15，30，45，60 min時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度。結(jié)果，RSD＝0.86%，表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)取供試品溶液2.0 mL，顯色，定容于25 mL容量瓶中，按“2.1.4”方法操作顯色，定容于25 mL容量瓶中。重復(fù)5次。509 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.4%，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn)取水松葉供試品溶液2.0 mL，6份，每份加入2 mL蘆丁對(duì)照品溶液。按“2.1.4”的方法操作顯色，定容于25 mL容量瓶中。于509 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算平均回收率。結(jié)果，平均回收率為97.37%，RSD＝1.1%，表明本法加樣回收率高。見表1。

表1 水松葉樣品溶液加樣回收率

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定浸泡時(shí)間（A），提取時(shí)間（B），提取次數(shù)（C）和固液比（D）4個(gè)因素為考察因素，以樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知極差RB＞RC＞RA＞RD，即ABCD四個(gè)因素對(duì)水松葉總黃酮含量影響的次序?yàn)锽＞C＞A＞D，即提取時(shí)間對(duì)水松葉總黃酮提取影響最大，提取次數(shù)次之，固液比影響最小。由表4可知，B因素（提取時(shí)間）與C因素（提取次數(shù)）對(duì)總黃酮的提取有顯著性影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A因素（浸泡時(shí)間）與D因素（固液比）影響不顯著。通過正交試驗(yàn)最終確定水松葉總黃酮最佳提取工藝為A2B3C2D2，即浸泡時(shí)間30 min，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，固液比1︰20。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別精密稱取3份水松葉粗粉1.0 g，按最佳工藝條件平行操作，放冷，合并提取液，過濾，取續(xù)濾液4 mL，置于50 mL容量瓶中，按“2.1.4”的方法操作顯色，70%乙醇定容，測(cè)得吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為1.305%，1.312%，1.314%，平均提取率為1.310%，高于正交試驗(yàn)中的任何一組數(shù)據(jù)，表明工藝可行合理。

表2 因素與水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 討論

水松葉為葉類藥材，含有較高的葉綠素等化合物，故在供試品制備時(shí)采用石油醚對(duì)其進(jìn)行脫色素預(yù)處理，盡可能地減少色素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，四個(gè)因素對(duì)水松葉總黃酮含量影響的次序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取次數(shù)＞浸泡時(shí)間＞固液比。最終確定水松葉總黃酮最佳提取工藝條件為A2B3C2D2，即浸泡時(shí)間30 min，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，固液比1∶20。該工藝簡(jiǎn)單可行，為水松葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考，亦為更有效地開發(fā)利用水松葉資源提供了依據(jù)。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版,1975:533.

[2] 向瑛,鄭慶安,張燦奎,等.水松葉的黃酮化合物的研究[J].中草藥,2001,32(7):588-589.

[3] 斯纓,王日韋,龔復(fù)俊,等.水松葉的總黃酮含量研究[J].武漢植物學(xué)研究,2003,21(6):547-549.

[4] 鄧翀,馮改利,楊乖利,等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化杜仲總黃酮提取工藝[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(11):2695-2697.

本文編輯：蘇日力嘎

Optimization of Extraction Procedure for Total Flavonoids from Glyptostrobus Pensilis Leaves by Orthogonal Experiment

Liu Te-jin1, Zhong Xi-wen1, Zhang Wen-xia1, Chen Xiang-ying1, Bao Jun-lin2
(1.Zhongshan Hospital Affiated to Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Zhongshan 528400, China; 2.Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Zhongshan 528400, China)

Objective：To optimize the extraction procedure for total favonoids from Glyptostrobus pensilis leaves by orthogonal experiment.Methods：The total flavonoid content in Glyptostrobus pensilis leaves was determined by ultraviolet spectrometry, and the effects of soaking time, extraction time, extraction frequency, ratio of solid to liquid on the content were investigated by L9(34) orthogonal experiment, based on which the condition for extraction was optimized.Results：The optimal soaking time, extraction time, extraction frequency and ratio of solid to liquid were 30 min, 2 h, 2 times and 1︰20 respectively.Conclusion：The extraction procedure was simple and stable, which increased the extraction rate of total favonoids.

Glyptostrobus Pensilis Leaves; Total Flavones; Orthogonal Experiment; Extraction Procedure

R283

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.01.002

2016 - 08 - 06

中山市衛(wèi)生和計(jì)劃生育局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（編號(hào)：2015J048）

劉特津，男，主管中藥師。研究方向：中藥炮制與鑒定。通訊作者E-mail：tejin6109@163.com