王長進(jìn)，徐運(yùn)林，程昕昕，周 毅，余海兵

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

持續(xù)推進(jìn)優(yōu)化玉米種植結(jié)構(gòu)，增加鮮食糯玉米、甜玉米有效供給是農(nóng)產(chǎn)品供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重點(diǎn)。鮮食甜玉米(ZeamayssaccharataSturt.)是玉米屬的一種重要類型，受su1、su2、sh1、sh2、sh4、du、ae、bt1、bt2、se等隱性突變基因的影響，籽粒乳熟期碳水化合物轉(zhuǎn)化為淀粉的效率低，籽粒皺縮干秕，發(fā)芽率差。因此，籽粒營養(yǎng)品質(zhì)性狀是控制甜玉米產(chǎn)量的重要指標(biāo)，也是直接影響種子出苗和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

種子營養(yǎng)品質(zhì)性狀是一種受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。種子中貯存的營養(yǎng)物質(zhì)是影響種子萌發(fā)效率的主要因子，主要包括淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等多種成分。在不同種質(zhì)資源中存在的不同等位基因可能是造成營養(yǎng)品質(zhì)表型差異的重要原因。連鎖定位和關(guān)聯(lián)分析是鑒定表型性狀與分子標(biāo)記或候選基因間關(guān)系的重要分析方法。連鎖定位需要構(gòu)建作圖群體，然后依據(jù)標(biāo)記的重組率確定數(shù)量性狀基因座的位置，其定位準(zhǔn)確度受到群體和標(biāo)記密度的影響。關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)最早應(yīng)用于人類是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)的，通過分析關(guān)聯(lián)群體表型與分子標(biāo)記之間的相關(guān)程度，篩選出與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，并依據(jù)基因組的連鎖不平衡程度確定候選基因區(qū)間[1]。與連鎖定位相比，關(guān)聯(lián)分析具有耗時(shí)短、定位精度高等優(yōu)點(diǎn)。隨著第三代分子標(biāo)記技術(shù)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotde polymorphism，SNP)芯片技術(shù)的快速發(fā)展，基于SNP標(biāo)記技術(shù)的關(guān)聯(lián)分析已在水稻[2]、小麥[3]、玉米[4-5]、擬南芥[6]、大豆[7]等模式植物中廣泛應(yīng)用。

玉米是最早應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析的植物。在種質(zhì)資源分類方面，吳金鳳等[8]利用NJ聚類法將51份玉米自交系劃分為7個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群；史亞興等[9]利用1 031個(gè)SNP標(biāo)記將39份甜玉米自交系劃分為5個(gè)類群。在籽粒品質(zhì)方面，Beló等[10]利用553份玉米自交系和8 590個(gè)SNP標(biāo)記定位到控制玉米籽粒脂肪酸含量的位點(diǎn)，并確定了候選基因fad2； Yang等[11]利用527份玉米自交系定位到控制玉米籽粒油分的74個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。在玉米農(nóng)藝性狀方面，Mao等[12]利用GWAS鑒定到控制玉米苗期干旱性狀、編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因ZZmNAC111；Rashid等[13]對(duì)368個(gè)玉米自交系進(jìn)行高粱霜霉病的全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到26個(gè)SNP與高粱霜霉病顯著相關(guān)。但有關(guān)鮮食甜玉米籽粒營養(yǎng)品質(zhì)的GWAS分析鮮有報(bào)道。本研究利用玉米育種安徽省工程技術(shù)中心提供的不同地理來源的100份甜玉米種質(zhì)資源對(duì)種子的3個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的表型進(jìn)行鑒定，利用均勻覆蓋全基因組的37 297個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，旨在檢測(cè)控制甜玉米籽粒品質(zhì)性狀的主效QTL，挖掘出表現(xiàn)穩(wěn)定的QTL優(yōu)異等位基因，為甜玉米分子標(biāo)記輔助選擇和品質(zhì)育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究利用玉米育種安徽省工程技術(shù)中心提供的包含100份甜玉米自交系的育種資源群體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表型性狀鑒定

在甜玉米自交系果穗吐絲前進(jìn)行套袋，抽雄散粉后人工輔助授粉，在授粉后42 d分別收獲3個(gè)自交果穗，取其中部籽粒混勻，進(jìn)行干燥，待測(cè)。

淀粉含量采用旋光法測(cè)定[14]。蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮蒸餾法測(cè)定[14]。脂肪含量采用索氏抽提法提取測(cè)定[15]。

1.2.2 DNA提取

利用SDS法提取DNA[16]。

1.2.3 SNP質(zhì)量控制

利用北京中玉金標(biāo)記生物技術(shù)股份有限公司根據(jù)玉米基因組開發(fā)的56K SNP芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了減少標(biāo)記之間強(qiáng)LD對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)果的影響，利用Plink軟件計(jì)算成對(duì)SNP間的r2并對(duì)連鎖不平衡強(qiáng)度較高(r2>0.3)的標(biāo)記進(jìn)行過濾，最終共有37 297個(gè)SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。

1.2.4 關(guān)聯(lián)分析

采用SPAGeDi進(jìn)行親緣關(guān)系分析，并計(jì)算親緣關(guān)系值的矩陣(K矩陣)[17]。Structure 2.2軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，通過ΔK確定群體亞群數(shù)目，最適K值重復(fù)運(yùn)算計(jì)算Q矩陣。在TASSEL 2.1[18]軟件中，采用一般線性模型，將Q矩陣作為協(xié)變量(Q，GLM)，對(duì)甜玉米的淀粉、蛋白、脂肪含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(P≤0.05表示標(biāo)記與性狀間存在顯著關(guān)聯(lián))[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS軟件和PASW18.0軟件對(duì)關(guān)聯(lián)群體籽粒營養(yǎng)品質(zhì)性狀進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜玉米群體結(jié)構(gòu)分析

利用Plink軟件對(duì)56 000個(gè)SNP標(biāo)記中的連鎖不平衡強(qiáng)度較高(r2>0.3)的標(biāo)記進(jìn)行過濾，得到37 297個(gè)SNP標(biāo)記，均勻覆蓋甜玉米每條染色體，且每條染色體上的SNP密度為7.65～21.08 Mb-1，多態(tài)信息含量為0.194～0.195，不同染色體的基因多樣性變幅是0.361～0.377，平均值為0.371。

選取過濾后的標(biāo)記進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析(圖1)：當(dāng)K為2時(shí)，對(duì)應(yīng)的ΔK值最大，然后ΔK迅速下降并趨于平緩。因此，可以將這100份甜玉米劃分為2個(gè)亞群，其中，亞群1包括92份種質(zhì)，亞群2包括8份種質(zhì)。

表1 甜玉米10條染色體PIC值和基因多態(tài)性

Table1PIC values and gene diversity in 10 chromosome of sweet corn

染色體ChromosomeSNP數(shù)目SNP quantity長度Length/bpSNP密度SNP density/Mb-1多態(tài)信息含量 PIC 基因多樣性Gene diversity0149302326775616.44 0.1940.376021795247936377.65 0.1950.3610347022976739020.44 0.1940.3690447491970587819.24 0.1940.3740543942306749820.27 0.1940.3720634462439628620.36 0.1950.3680734002400642119.95 0.1940.3720836761896184121.08 0.1940.3770931023386524020.38 0.1940.3731031031739812720.75 0.1950.373總計(jì)Total37297645950889186.57 0.1940.371

2.2 甜玉米自然群體種子品質(zhì)表型數(shù)據(jù)分析

淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪含量是甜玉米種子的主要營養(yǎng)成分。從表2可以看出，甜玉米種子中3種營養(yǎng)成分含量變幅較大，其中淀粉含量變幅為53.91%～73.70%，蛋白質(zhì)含量變幅為8.96%～18.01%，脂肪含量變幅為5.53%～18.50%，進(jìn)一步表明甜玉米自交系種子主要營養(yǎng)品質(zhì)性狀差異較大。偏度系數(shù)表明，淀粉含量、蛋白質(zhì)含量呈正態(tài)分布。

2.3 關(guān)聯(lián)分析

利用GLM-Q檢測(cè)到與甜玉米種子淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)14個(gè)(表3)，分別分布在1、2、3、4、5、6、7、8號(hào)染色體上，能夠解釋表型變異的13.34%～20.90%。其中，在3、4、5號(hào)染色體上分別檢測(cè)到2個(gè)SNP位點(diǎn)，在8號(hào)染色體上檢測(cè)到4個(gè)SNP位點(diǎn)。在-log10P>3.50水平下，檢測(cè)到顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)3個(gè)，3號(hào)染色體上qSTA-3-1位于Affx-115329496處，貢獻(xiàn)率最大，約為20.90%。

共檢測(cè)到控制甜玉米種子蛋白質(zhì)含量的SNP位點(diǎn)15個(gè)，主要分布在1、2、4、8、9號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為3.45%～51.69%。在-log10P>18水平下，檢測(cè)到顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)5個(gè)，其中：1號(hào)染色體上qPRO-1-1位于Affx-91181539，貢獻(xiàn)率達(dá)到51.69%；9號(hào)染色體上qPRO-9-2位于Affx-115333989處，貢獻(xiàn)率高達(dá)45.25%(表4)。

甜玉米種子脂肪含量關(guān)聯(lián)分析共定位到20個(gè)SNP位點(diǎn)，分別位于1、3、4、5、6、7、8、9、10號(hào)染色體上，能夠解釋表型變異的13.69%～17.89%，在-log10P>3.50水平下，檢測(cè)到顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)1個(gè)，位于5號(hào)染色體上的Affx-91137282處，qFAT-5-1對(duì)表型變異的解釋率為17.06%(表5)。

表2 甜玉米自然群體種子主要品質(zhì)性狀表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Table2Phenotypes statistical analysis of seed quality in sweet corn natural population

表3 甜玉米種子淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)

Table3Significant markers associated with starch content of sweet corn

表4 甜玉米種子蛋白質(zhì)含量顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)

Table4Significant markers associated with protein content of sweet corn

表5 甜玉米種子脂肪含量顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)

Table5Significant markers associated with fat content of sweet corn

序號(hào)No.QTL序號(hào)QTL IDSNP染色體Chromosome位置Position-log10P貢獻(xiàn)率Contribution rate/%1qFAT-5-1Affx-9113728251879614161.26×10-417.06 2qFAT-5-2Affx-908299095927988453.13×10-415.47 3qFAT-9-1Affx-11533223691163385473.44×10-415.60 4qFAT-5-3Affx-9128306251325999713.91×10-415.08 5qFAT-10-1Affx-9007067010462557424.52×10-414.68 6qFAT-10-2Affx-9037425510545984764.52×10-414.68 7qFAT-10-3Affx-9109614710548678144.52×10-414.68 8qFAT-1-1Affx-9096290912956589234.72×10-414.61 9qFAT-10-4Affx-9109788610459631454.80×10-414.72 10qFAT-10-5Affx-9016085710548677134.87×10-414.69 11qFAT-1-2Affx-1153315981652435155.58×10-417.89 12qFAT-10-6Affx-9129081010664084286.08×10-414.30 13qFAT-6-1Affx-9067240961480439876.21×10-414.12 14qFAT-3-1Affx-9109074331910080676.37×10-414.64 15qFAT-1-3Affx-9009999012553703856.65×10-414.00 16qFAT-7-1Affx-9118114971672303537.03×10-415.05 17qFAT-6-2Affx-905323646404341817.30×10-414.24 18qFAT-8-1Affx-9099956381104459367.56×10-414.47 19qFAT-10-7Affx-9117929310964770087.58×10-414.04 20qFAT-4-1Affx-904824134700196037.93×10-413.69

3 結(jié)論與討論

種子的營養(yǎng)品質(zhì)是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，主要包括淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等。本研究發(fā)現(xiàn)，甜玉米種子中3種營養(yǎng)成分含量變幅較大，其中淀粉含量變幅為53.91%～73.70%，蛋白質(zhì)含量變幅為8.96%～18.01%，脂肪含量變幅為5.53%～18.50%，這種表型變異可能是不同種質(zhì)資源中存在的等位基因差異造成的。

群體的表型變異是全基因組關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)。群體內(nèi)不同材料之間表型變異越豐富，群體的重組率越高，連鎖不平衡就越低，越適于進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。本研究發(fā)現(xiàn)，100份甜玉米自交系可劃分為兩個(gè)亞群，其中亞群1包括92份種質(zhì)，亞群2包括8份種質(zhì)。利用56K SNP基因芯片獲得了均勻覆蓋甜玉米基因組的37 297個(gè)高質(zhì)量SNPs，PIC值集中在0.19，基因多樣性變幅集中在0.36～0.38。

全基因組關(guān)聯(lián)分析是通過掃描覆蓋整個(gè)基因組的大量標(biāo)記對(duì)群體的目標(biāo)性狀進(jìn)行分析，以期關(guān)聯(lián)到控制目標(biāo)性狀的位點(diǎn)。玉米是較早進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的植物，前人已經(jīng)對(duì)玉米產(chǎn)量、株高、抗病性等多個(gè)性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析[20-24]。其中，2001年Thornsberry等[21]關(guān)聯(lián)定位到控制玉米自交系開花期的dwarf8基因；2011年Kump等[22]關(guān)聯(lián)檢測(cè)到控制影響葉枯病的32個(gè)QTL；2012年Farfan等[23]利用346個(gè)玉米自交系定位到控制產(chǎn)量、株高、開花期的10個(gè)QTL。Hu等[24]對(duì)282個(gè)玉米自交系進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，利用2 271 584個(gè)SNP對(duì)玉米萌發(fā)過程的抗寒性進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到17個(gè)位點(diǎn)與抗寒性有關(guān)。Liu等[25]利用263個(gè)玉米自交系56 110個(gè)均勻分布的SNP對(duì)淀粉含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)定位，發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP與淀粉含量顯著相關(guān)，預(yù)測(cè)了淀粉合成相關(guān)的候選基因77個(gè)，其中APS1基因與淀粉合成緊密相關(guān)。本研究利用GLM-Q模型關(guān)聯(lián)定位到控制甜玉米籽粒淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量的SNP位點(diǎn)14、15和20個(gè)，能夠解釋表型變異的3.45%～51.69%。其中，在-log10P>3.50水平下，位于3號(hào)染色體上Affx-115329496處的qSTA-3-1對(duì)淀粉含量貢獻(xiàn)率最大，約為20.90%；與Liu等[25]關(guān)聯(lián)定位的3號(hào)染色體上關(guān)聯(lián)位點(diǎn)較一致。

種子全基因組蛋白質(zhì)功能研究是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)主要受生化反應(yīng)(通路、細(xì)胞、組織等)、環(huán)境條件、多功能性等多面的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在-log10P>3.50水平下，位于甜玉米1號(hào)染色體Affx-91181539處的qPRO-1-1位點(diǎn)和9號(hào)染色體上Affx-115333989處的qPRO-9-2與籽粒蛋白質(zhì)含量顯著關(guān)聯(lián)。