巫川, 王樹濤, 朱婧, 尤宏

哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室, 哈爾濱 150090

作為一種溴系阻燃劑，多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)曾被廣泛用于電子產(chǎn)品、紡織、石油開采等領(lǐng)域中，其在生產(chǎn)及使用過程中，不可避免地會進(jìn)入環(huán)境中[1-2]。PBDEs在大氣、水體、土壤、動物及人體等環(huán)境介質(zhì)中均被檢出[3-6]，其對動物及人體的影響引起了廣泛關(guān)注。PBDEs能夠影響一些蛋白質(zhì)的生理功能，如雌/雄激素效應(yīng)[3-4]、甲狀腺激素效應(yīng)[5]、芳香烴受體效應(yīng)[6]等，同時PBDEs能夠?qū)е律扯拘?、肝腎毒性、神經(jīng)毒性[7-10]等，其中神經(jīng)毒性尤其受到關(guān)注。由于PBDEs能夠?qū)е逻@一系列的毒性，2009年的《斯德哥爾摩公約》中部分PBDEs被列入了持久性有機(jī)污染物的受控名單中[11]，而目前環(huán)境中仍存在著一定量的BDE-47與BDE-209[12]，因此有必要對其進(jìn)行毒性評估。BDE-47與BDE-209能夠以不同的方式導(dǎo)致神經(jīng)毒性。Lucio等[13]的研究表明，BDE-47能夠在體外誘導(dǎo)小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中的氧化應(yīng)激和凋亡細(xì)胞死亡；Zhang等[14]通過培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)進(jìn)行體外研究，考察BDE-209的神經(jīng)毒性，發(fā)現(xiàn)BDE-209在體外能夠抑制NSCs增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，這可能與nF-κB途徑的激活有關(guān)。然而，BDE-47與BDE-209對AChE活性的影響所引起的神經(jīng)毒性卻很少被報道。

AChE與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和成熟密切相關(guān)，其能夠促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育和神經(jīng)再生[15]。在人體中，主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)組織中的AChE可以快速催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解，并導(dǎo)致神經(jīng)沖動傳遞的終止，從而保證人體的正常生理功能[16]。AChE是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶之一，任何影響AChE活性的物質(zhì)都可能導(dǎo)致神經(jīng)毒性[17]。刑厚娟等[18]研究了硝基苯對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)AChE的影響，發(fā)現(xiàn)大鼠具有明顯的神經(jīng)毒性。在研究甲醛對該過程的神經(jīng)毒性方面，Rezvan等[19]發(fā)現(xiàn)AChE活性和神經(jīng)毒性是不可分割的。

BDE-47和BDE-209因與AChE之間的相互作用而導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的研究鮮見報道，且AChE活性變化的神經(jīng)毒性分子機(jī)制還不清楚。動物實驗不僅耗時耗力，也很難從小分子與生物大分子相互作用的角度解釋毒性機(jī)制。熒光光譜可用作研究小分子和蛋白質(zhì)大分子之間的相互作用的有用和快速的方法[20]，可以在更深層次上揭示毒性機(jī)制。本文研究了BDE-47與BDE-209對AChE的活性影響，利用熒光光譜的手段研究了BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的分子作用力類型，旨在揭示PBDEs導(dǎo)致神經(jīng)毒性的致毒通路。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑及配制

Tris-HCl緩沖溶液的配制：用0.2 mol·L-1的Tris和0.1 mol·L-1的HCl配制，其pH值至7.4；AChE溶液的配制：使用pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液作為溶劑，配制成濃度為100 U·L-1的AChE溶液；碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)溶液的配制：稱取ATChI 434 mg，溶于100 mL pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中；DTNB溶液的配制：稱取DTNB 595 mg，溶于100 mL pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液，配制成濃度為0.015 mol·L-1的DTNB溶液；終止劑十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液的配制：稱取SDS 0.4 g，溶于一級水中，配制成濃度為0.4%的SDS溶液；BDE-47溶液的配制：稱取48.6 mg的 BDE-47溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中，配制成濃度為1 000 μmol·L-1的BDE-47母液，實驗時用DMSO稀釋成不同濃度的BDE-47樣液；BDE-209溶液的配制：稱取96 mg的BDE-209溶于DMSO溶液中，配制成濃度為1 000 μmol·L-1的BDE-209母液，實驗時用DMSO稀釋成不同濃度的BDE-209樣液；NaCl的配制：稱取5.844 g NaCl溶于100 mL的蒸餾水中得到1 mol·L-1的NaCl溶液。以上所有試劑均為化學(xué)純，BDE-47和BDE-209購于武漢凱美克化學(xué)科技有限公司，AChE購買于上海源葉生物科技有限公司，其余試劑均購買于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器

主要儀器為分光光度計(普析通用儀器公司，T6-1650F)和熒光光譜儀(日本JASCO，F(xiàn)P-6500)。

1.2 實驗方法

1.2.1 AChE活性抑制實驗方法

取多個10 mL的試管，洗凈烘干后加入7.65 mL的pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液，再加入50 μL的AChE溶液和100 μL DTNB溶液，同時加入樣品溶液100 μL，每種樣品均用樣品母液稀釋成一系列的不同濃度的樣液，搖勻后放入37 ℃的水浴鍋中預(yù)熱30 min，預(yù)熱結(jié)束后加入100 μL的ATChI溶液，接著在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速加入1 mL的0.4%的終止劑SDS溶液來終止反應(yīng)，然后立即在紫外分光光度計412 nm出測得光度吸收值，并根據(jù)下列公式計算出不同濃度的樣品溶液下的抑制率。

I%=[A對照-(A樣品-A樣品空白)]/A對照×100

(1)式中，I指BDE-47或BDE-209對AChE的抑制率，%；A對照指樣品溶液中沒有加入樣品時的吸光值；A樣品指樣品溶液中加入不同濃度的樣品時的吸光值；A樣品空白指樣品溶液中加入了不同濃度的樣品但沒有加入底物ATChI時的吸光值。為了避免誤差，每個不同濃度的樣品溶液同時做3個平行測試，取其平均值，作為各不同濃度的樣品溶液的平均抑制率。

1.2.2 光譜實驗方法

移取1mL的NaCl溶液、一定量的AChE溶液及樣品溶液與10 mL的比色管中，用Tris-HCl緩沖溶液定容，在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)60 min，在F-7000熒光光譜儀上掃描測得熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度的變化可根據(jù)Stern-Volmer方程[21]判別其猝滅類型。

(2)

式中，F(xiàn)指存在BDE-47和BDE-209時的熒光強(qiáng)度；F0指不存在BDE-47和BDE-209時的熒光強(qiáng)度；Q指BDE-47和BDE-209的濃度，mol·L-1；Ksv指Stern-Volmer猝滅常數(shù)，L·mol-1；Kq指猝滅速率常數(shù)，mol·L-1·s-1；τ0指蛋白質(zhì)的平均壽命(10-8s)[22]。同時，根據(jù)改進(jìn)的Scatchard方程[23]計算出BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。

ΔF/F0/Q=nK-(ΔF/F0)K

(3)

式中，ΔF指加入BDE-47或BDE-209前后的熒光強(qiáng)度的變化；F0指不存在BDE-47和BDE-209時的熒光強(qiáng)度；Q指BDE-47和BDE-209的濃度，mol·L-1；n指結(jié)合位點數(shù)；K指結(jié)合常數(shù)，L·mol-1。計算所得的結(jié)合常數(shù)可用于BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的熱力學(xué)參數(shù)的計算，其計算公式[24]如下：

ln(K2/K1) = ΔH/R(1/T1-1/T2)

(4)

ΔG = -RTlnK

(5)

ΔS = -(ΔG-ΔH)/T

(6)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 BDE-47和BDE-209對AChE的抑制作用

BDE-47和BDE-209對AChE的抑制作用根據(jù)Ellman法[25]測定，其原理是在pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，用ATChI作為底物，此物質(zhì)在AChE作用下可分解成乙酰膽堿，乙酰膽堿可與顯色劑DTNB快速反應(yīng)生成一種黃色陰離子物質(zhì)5-巰基-2-硝基苯乙酸，5-巰基-2-硝基苯乙酸在紫外分光光度計412 nm外有光吸收。

圖1 不同濃度下BDE-47和BDE-209對AChE的抑制影響Fig. 1 Inhibition of BDE-47 and BDE-209 on the AChE activity at different concentrations

如圖1所示，BDE-47與BDE-209在一定濃度范圍內(nèi)均能夠抑制AChE分解乙酰膽堿，隨著BDE-47與BDE-209濃度的增加，兩者的抑制效率均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。其中BDE-47濃度從50 μmol·L-1增加到400 μmol·L-1時，BDE-47對AChE的抑制率從8.6%逐步升高到最大值22.3%；當(dāng)濃度進(jìn)一步增大，從400 μmol·L-1增加到800 μmol·L-1時，BDE-47對AChE的抑制率不增反減，從22.3%降低到9.2%；BDE-209濃度從50 μmol·L-1升高到200 μmol·L-1時，BDE-209對AChE的抑制率從5.8%逐步升高到最大值11.2%；當(dāng)濃度進(jìn)一步增大，從400 μmol·L-1增加到800 μmol·L-1時，BDE-209對AChE的抑制率不增反減，從11.2%降低到0.4%；這說明BDE-47與BDE-209對AChE具有一定的抑制作用，抑制作用的強(qiáng)弱與BDE-47和BDE-209的濃度有一定的關(guān)系，由于AChE的活性中心位于球形表面形成的凹陷結(jié)構(gòu)的底部，這個凹陷俗稱為峽谷[26]，而這個峽谷區(qū)并不是平滑的，它還有一個如同瓶頸一般的收縮區(qū)域[27]，在低濃度條件下，BDE-47和BDE-209分子可能順利的通過這個峽谷與AChE的活性中心相結(jié)合從而抑制了AChE的活性，而在高濃度條件下，BDE-47和BDE-209分子可能因相互碰撞不能順利的通過這個區(qū)域與活性中心相結(jié)合，從而達(dá)不到抑制AChE活性的作用。相同濃度下，BDE-47對AChE的抑制率始終大于BDE-209，說明AChE對BDE-47更加敏感。

溫度不僅可以影響酶的活性，也可能影響小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合。圖2結(jié)果表明，不同溫度下的BDE-47和BDE-209對AChE活性的抑制均有一定影響。在300 K條件下，BDE-47和BDE-209對AChE活性抑制的影響規(guī)律與310 K條件下的規(guī)律一致，但在300 K條件下，BDE-47和BDE-209在每種濃度條件下對AChE活性抑制率均出現(xiàn)了一定的增強(qiáng)作用，這表明溫度的增加不利于BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合。

2.2 BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的熒光光譜分析

BDE-47和BDE-209對AChE的活性實驗表明BDE-47和BDE-209對AChE具有一定的抑制作用，即BDE-47和BDE-209能夠與AChE相互作用。BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的熒光光譜圖如圖3所示?？梢?，BDE-47和BDE-209對AChE的熒光性均有一定的猝滅作用，隨著BDE-47和BDE-209濃度的增加，猝滅作用增強(qiáng)；同時，隨著BDE-47和BDE-209濃度的增加，在BDE-47-AChE和BDE-209-AChE體系中，其最大吸收峰的位置均產(chǎn)生了一定的藍(lán)移。在BDE-47-AChE體系中，BDE-47的濃度從0 μmol·L-1升高到50 μmol·L-1，最大吸收峰的位置從336 nm藍(lán)移到了333 nm；在BDE-209-AChE體系中，BDE-209的濃度從0 μmol·L-1升高到50 μmol·L-1，最大吸收峰的位置從336 nm藍(lán)移到了334 nm。這表示在加入BDE-47和BDE-209后，BDE-47和BDE-209與AChE的相互作用使AChE的發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了變化，從而變得更加疏水，即疏水作用變強(qiáng)[23]。

BDE-47和BDE-209能夠猝滅AChE的熒光，而熒光的猝滅類型有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[28]，通過Stern-Volmer方程可以確定BDE-47和BDE-209對AChE熒光的猝滅類型。在300 K和310 K穩(wěn)定條件下，根據(jù)線性回歸方程分別求得了Kq、Ksv。由圖4可以看出，在BDE-47和BDE-209選定的濃度范圍內(nèi)，根據(jù)線性回歸方程，隨著溫度的升高，猝滅曲線的斜率降低，各個溫度下的猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而降低，這表明BDE-47和BDE-209對AChE的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅[23]。

圖2 不同溫度下BDE-47與BDE-209對AChE活性抑制的影響Fig. 2 Inhibition of BDE-47 and BDE-209 on the AChE activity at different temperatures

根據(jù)圖4的線性方程可以求出Kq、Ksv值，在300 K和310 K條件下，BDE-47對AChE的Kq、Ksv值分別為1.04×1012和0.91×1012L·mol-1·s-1、1.04×104和0.91×104L·mol-1；在300 K和310 K條件下，BDE-209對AChE的Kq、Ksv值分別3.5×1012和3.5×1012L·mol-1·s-1、3.5×104和3.3×104L·mol-1。小分子與蛋白質(zhì)作用的最大碰撞猝滅速率常數(shù)(Kq)為2.0×1010L·mol-1·s-1，大于這個值時小分子對蛋白質(zhì)的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅[29]。BDE-47和BDE-209對AChE的Kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，因此，BDE-47和BDE-209對AChE的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

BDE-47和BDE-209對AChE的熒光猝滅類型確定后，根據(jù)改進(jìn)的Scatchard方程來計算出BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。由表1得，BDE-47與AChE在300 K、310 K下的結(jié)合常數(shù)分別為4.26×104L·mol-1和3.68×104L·mol-1，BDE-209與AChE在300 K、310 K下的結(jié)合常數(shù)分別為4.23×104L·mol-1和3.66×104L·mol-1。BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的增加而減小，這表明升高溫度可能減弱了BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合作用；2個溫度下的BDE-47與AChE的結(jié)合常數(shù)均大于BDE-209與AChE的結(jié)合常數(shù)，這表明BDE-47更易與AChE相互作用，同時闡明了BDE-47對AChE的抑制率始終大于BDE-209的原因。2個溫度下，BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合位點數(shù)均接近于1，表示BDE-47和BDE-209與AChE的只有一個結(jié)合位點。

圖3 不同濃度下BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的熒光光譜注: [AChE]=10 U·L-1, [BDE-47]=0, 1, 2, 3, 4, 5×10-5 mol·L-1, T=300 K, pH=7.4, λex=280 nm。Fig. 3 Fluorescence spectra of BDE-47 and BDE-209 interacting with AChE at different concentrationsNote: [AChE]=10 U·L-1, [BDE-47]=0, 1, 2, 3, 4, 5×10-5 mol·L-1, T=300 K, pH=7.4, λex=280 nm.

圖4 不同溫度下BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的Stern-Volmer方程Fig. 4 Stern-Volmer equation for the interaction of BDE-47 and BDE-209 with AChE at different temperatures

小分子物質(zhì)與大分子蛋白質(zhì)之間的相互作用通常分為疏水作用力、范德華引力、氫鍵作用和靜電作用力[30-31]。根據(jù)不同溫度下的結(jié)合常數(shù)可以計算出BDE-47和BDE-209與AChE之間的熱力學(xué)參數(shù)，依據(jù)熱力學(xué)學(xué)參數(shù)的正負(fù)值可以判斷出BDE-47和BDE-209與AChE之間作用力類型，其計算結(jié)果如表2所示。其中，ΔH在溫度相差不大時可以被認(rèn)為是不變的，ΔG<0說明BDE-47和BDE-209與AChE的作用過程是一個自發(fā)進(jìn)行的過程；ΔH<0，說明二者的反應(yīng)過程是放熱反應(yīng)，升高溫度不利于BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合；ΔS>0是大分子與小分子物質(zhì)之間的作用力為疏水作用力的特征[31, 32]。有表2可知，ΔG<0、ΔH<0和ΔS>0，說明BDE-47和BDE-209與AChE主要存在著疏水相互作用，但因純粹的疏水作用不僅表現(xiàn)為ΔS>0，而且ΔH≌0，而本實驗中ΔH<0，因此它們之間的作用力不能用單一的疏水作用力解釋，可能存在其他作用力。相對于范德華引力，ΔS和ΔH均為負(fù)值，因此BDE-47和BDE-209與AChE與反應(yīng)體系中不應(yīng)存在范德華引力。

綜上所述，BDE-47與BDE-209在一定濃度范圍內(nèi)均能夠抑制AChE的活性，隨著濃度的增加，兩者的抑制效率均呈現(xiàn)出先增加后降低的規(guī)律，其中BDE-47濃度為400 μmol·L-1時抑制率達(dá)到最大，為22.3%；BDE-209濃度為200 μmol·L-1時抑制率達(dá)到最大，為11.2%。同種濃度下的BDE-47對AChE的抑制率始終大于BDE-209，這表明AChE對BDE-47更加敏感。BDE-47和BDE-209與AChE之間的相互作用力主要為疏水作用力，同時不存在范德華引力作用，表明BDE-47更易與AChE相互作用。溫度是影響B(tài)DE-47和BDE-209與AChE的相互作用的重要因素，溫度升高不利于二者與AChE的結(jié)合。BDE-47和BDE-209抑制AChE活性很可能是導(dǎo)致神經(jīng)毒性通路之一。

表1 不同溫度下BDE-47和BDE-209與AChE的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)Table 1 The binding constants and binding sites of BDE-47 and BDE-209 with AChE at different temperatures

表2 不同溫度下 BDE-47和BDE-209與AChE相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of the interaction of BDE-47 and BDE-209 with AChE at different temperatures

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