姜錦林，單正軍，卜元卿，韓志華，王娜

國(guó)家環(huán)境保護(hù)農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

獸藥也稱(chēng)獸用藥或動(dòng)物用藥，是指用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能的物質(zhì)(含藥物飼料添加劑)；根據(jù)使用目的,獸藥大致可歸納為4類(lèi)：1)一般疾病防治藥；2)傳染病防治藥；3)體內(nèi)、體外寄生蟲(chóng)病防治藥；4)飼料添加劑(包括促生長(zhǎng)藥)。其中除防治傳染病的生化免疫制品(菌苗、疫苗、血清、抗毒素和類(lèi)毒素等)，以及畜禽特殊寄生蟲(chóng)病藥和促生長(zhǎng)藥等專(zhuān)用獸藥外，其余均與人用醫(yī)藥相同，只是劑量、劑型和規(guī)格有所區(qū)別。

獸藥在保障動(dòng)物健康、提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量尤其在畜牧業(yè)集約化發(fā)展等方面起著至關(guān)重要的作用，然而獸藥和飼料添加劑的大量使用成為生態(tài)環(huán)境污染和人體健康損害的一個(gè)重要因素。一方面，大量外源性化學(xué)物進(jìn)入畜禽產(chǎn)品中，使動(dòng)物性食品中藥物殘留越來(lái)越嚴(yán)重，對(duì)人類(lèi)的健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅；另一方面，大部分獸藥和添加劑以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動(dòng)物的糞便和尿液進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中，對(duì)土壤、地表水、地下水等造成污染，影響植物、動(dòng)物和微生物的正常生命活動(dòng)，并通過(guò)食物鏈最終影響人類(lèi)的健康。研究表明，很多作為促生長(zhǎng)劑而廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)的人工合成雌激素類(lèi)獸藥是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。這類(lèi)物質(zhì)脂溶性強(qiáng)，在水源和土壤中很難降解，可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入生物體內(nèi)，對(duì)人類(lèi)的健康及生物的生存產(chǎn)生巨大影響[1-5]。

所謂內(nèi)分泌干擾物(endocrine disruptors)，一般是指環(huán)境中存在的能夠干擾生物體內(nèi)源激素的合成、釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、作用或清除，從而影響機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生殖、發(fā)育及行為的外源性物質(zhì)[6]；環(huán)境中存在的多種內(nèi)分泌干擾物與生物體內(nèi)天然激素受體選擇性結(jié)合而產(chǎn)生的如上所述的多種生物效應(yīng)，即內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。環(huán)境中的許多化合物具有內(nèi)分泌干擾作用，這些化學(xué)物質(zhì)性質(zhì)差異極大，包括難降解的持久性有機(jī)污染物(如多氯聯(lián)苯、二噁英、有機(jī)氯農(nóng)藥等)和易分解的極性殺蟲(chóng)劑、除草劑、洗滌劑降解產(chǎn)物、動(dòng)物及人類(lèi)排泄的激素、天然植物激素、微生物毒素以及某些重金屬等。值得注意的是，廣泛使用的口服避孕藥和一些用于家畜助長(zhǎng)或免疫的同化激素(獸藥)中含有大量的人工合成雌激素，如己烯雌酚、乙烷雌酚、炔雌醇等[2]。近年來(lái)，人們認(rèn)為許多健康受損現(xiàn)象的發(fā)生均與環(huán)境雌激素有關(guān)，包括：人類(lèi)隱睪癥與尿道下裂等疾病發(fā)病率提高，男性平均精子數(shù)量減少，女性不孕明顯上升，水生動(dòng)物出現(xiàn)雌性化現(xiàn)象等[7-9]。獸藥污染造成的內(nèi)分泌干擾風(fēng)險(xiǎn)因此引起國(guó)內(nèi)外政府機(jī)構(gòu)、專(zhuān)家學(xué)者的高度重視。正是在這樣的背景下，本文調(diào)研了典型獸藥的污染現(xiàn)狀及其內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究最新進(jìn)展，并以傳統(tǒng)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究方法為基礎(chǔ)，較全面地評(píng)述了可用于獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的快速篩選、檢測(cè)及評(píng)價(jià)方法，并對(duì)該領(lǐng)域未來(lái)研究提出了展望和建議，以期為環(huán)境和農(nóng)業(yè)等管理部門(mén)制定獸藥的使用、排放、管理政策提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

1 獸藥在環(huán)境中的殘留現(xiàn)狀(Veterinary drup residus in the environment)

隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，獸藥和飼料添加劑的使用量正日漸增加，動(dòng)物在使用藥物以后，藥物將以原形化合物或代謝產(chǎn)物的方式從糞、尿等排泄物進(jìn)入外界環(huán)境，造成環(huán)境土壤、表層水體、植物和動(dòng)物等的獸藥蓄積或殘留。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)的土壤、地表水及地下水中都有低濃度的獸藥檢出，抗生素及驅(qū)蟲(chóng)藥物對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在危害尤為突出。

抗生素和激素類(lèi)獸藥也可通過(guò)污染食品而進(jìn)入環(huán)境，如預(yù)防和治療畜禽疾病用藥和促進(jìn)生長(zhǎng)、泌乳、甚至肌肉脂肪分配而使用的藥物，這些藥物主要通過(guò)口服、注射、局部用藥等方法給藥，藥物由于殘留動(dòng)物體內(nèi)而污染食品；此外，殘留大量獸藥的動(dòng)物糞便和污水處理廠的污泥用于農(nóng)田施肥，也會(huì)污染土壤和水體；在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，藥物作為飼料添加劑或通過(guò)水中撒藥形式給藥而被直接投加到水中，據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%以上的藥物可通過(guò)這種途徑直接進(jìn)入到水環(huán)境。20世紀(jì)90年代末，歐洲的一些國(guó)家開(kāi)始比較系統(tǒng)地調(diào)查、研究環(huán)境中獸藥的殘留和污染問(wèn)題，我國(guó)起步較晚，直到近年來(lái)才開(kāi)始廣泛關(guān)注獸藥殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康的危害。表1顯示了常見(jiàn)抗生素和激素類(lèi)獸藥在環(huán)境中的殘留現(xiàn)狀[4,10-12]。此外，與其他環(huán)境介質(zhì)相比，一些抗生素和激素類(lèi)獸藥，如氟喹諾酮類(lèi)(FQs)抗生素，在污泥中的污染更加嚴(yán)重。對(duì)北京8個(gè)污水處理廠的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，污泥中氧氟沙星殘留濃度高達(dá)21 mg·L-1，而國(guó)外FQs在污泥中普遍檢出濃度在0.04～8.3 mg·kg-1范圍內(nèi)[13-14]。畜禽糞便中，抗生素和獸藥污染更是普遍嚴(yán)重，曾有學(xué)者檢測(cè)到我國(guó)豬糞中恩諾沙星濃度高達(dá)33.26 mg·kg-1[14]?？梢?jiàn)，我國(guó)抗生素和獸藥類(lèi)污染已相對(duì)嚴(yán)重。

由此可見(jiàn)，獸藥污染已成為一個(gè)全球性普遍存在的問(wèn)題，大多數(shù)獸藥具有較高的生物活性，其必然存在一定的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。尤其是抗生素和激素類(lèi)獸藥殘留對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的威脅日益暴露。

2 獸藥內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究現(xiàn)狀(Research status of veterinary endocrine disrupting effects)

2.1 內(nèi)分泌干擾物分子作用模式

內(nèi)分泌干擾物的分子作用模式主要是具有與生物體內(nèi)源激素相似結(jié)構(gòu)的外源化學(xué)物質(zhì)通過(guò)結(jié)合細(xì)胞外受體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)同啟動(dòng)子位置結(jié)合，從而啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，因而可模擬、阻止或干擾雄激素、雌激素、甲狀腺激素等內(nèi)分泌過(guò)程，此途徑稱(chēng)之為受體介導(dǎo)途徑[6, 15]。此外，環(huán)境中還存在大量化學(xué)物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物體內(nèi)源激素結(jié)構(gòu)并不相同，但也可表現(xiàn)出內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)。這可能是污染物直接影響了生物體內(nèi)的與激素合成相關(guān)酶的活力，以及通過(guò)破壞內(nèi)源激素及其受體的生成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，從而干擾生物體內(nèi)內(nèi)分泌，如許多化學(xué)物質(zhì)可通過(guò)干擾與類(lèi)固醇激素生物合成路徑中相關(guān)的基因表達(dá)和酶的活力影響性激素的含量，這些作用稱(chēng)之為非受體介導(dǎo)途徑[6, 15]。

對(duì)于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究，長(zhǎng)期以來(lái)集中在污染物對(duì)動(dòng)物生殖器官的作用。然而，生物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等受內(nèi)分泌系統(tǒng)和體內(nèi)復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)控，這種調(diào)控方式常以網(wǎng)絡(luò)的形式存在，互相影響并相互補(bǔ)償，以應(yīng)對(duì)環(huán)境因子的影響。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，下丘腦-垂體-性腺/甲狀腺/腎上腺軸在動(dòng)物的繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫等發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。大腦作為控制內(nèi)分泌系統(tǒng)的核心綜合部位，發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于內(nèi)分泌干擾物的作用非常敏感。因此，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可能對(duì)動(dòng)物完整內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生作用，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖等。另外，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)也是許多有機(jī)污染物作用的主要靶器官之一，這些物質(zhì)可以引起大腦永久性的結(jié)構(gòu)及功能的改變，直接影響內(nèi)分泌功能[6]。

表1 常見(jiàn)抗生素和激素類(lèi)獸藥在環(huán)境中的殘留Table 1 Veterinary antibiotics and hormone residues in the environment

2.2 典型獸藥的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究

2.2.1 己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)

DES是一種非甾體類(lèi)雌激素，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。DES曾作為促生長(zhǎng)劑而廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，Lorenz等[16]首次報(bào)道給小公雞皮下植入DES，8周后公雞的胸部和腿部肌肉脂肪含量增加了3倍；Rumsery等[17]試驗(yàn)結(jié)果證明肉牛通過(guò)每日口服10 mg DES，能增強(qiáng)體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積和增加日增重，可以很快產(chǎn)生顯著和直接的經(jīng)濟(jì)效益。除歐盟以外的許多國(guó)家：如美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭等都曾把人工合成雌激素(主要是DES)用作促生長(zhǎng)劑。

DES是親脂性物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，不易降解，易在人和動(dòng)物脂肪及組織中殘留，長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷。DES具有明顯的毒副作用，DES應(yīng)用早期就曾有人報(bào)道過(guò)DES對(duì)小鼠具有致癌性，但當(dāng)時(shí)沒(méi)有引起人們的重視。直到20世紀(jì)70年代，大量的動(dòng)物試驗(yàn)才證明在孕期服用DES會(huì)增加其后代患生殖道癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，如陰道和子宮頸透明細(xì)胞腺癌、陰道癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸異常等。研究表明，與DES致癌性關(guān)系最密切的是女性陰道和子宮頸透明細(xì)胞腺癌。此外，DES還會(huì)導(dǎo)致陰道癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等，現(xiàn)在大多數(shù)女孩月經(jīng)初潮明顯提前也與DES有關(guān)；孕期服用DES不僅對(duì)女性后代造成嚴(yán)重危害，對(duì)男性后代的危害更是不可忽視。婦女孕期服用DES易導(dǎo)致男性后代睪丸異常、發(fā)育不全、精子計(jì)數(shù)減少和精子活力下降等一系列生殖系統(tǒng)問(wèn)題；孕期服用DES會(huì)導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)，影響胎兒性別分化和生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)導(dǎo)致胎兒腦癱瘓、失明和其他神經(jīng)缺陷[18]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Mikkil?等[19]就新生小鼠睪丸組織對(duì)DES的敏感性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有接觸過(guò)DES的小鼠其血液中的睪丸激素均減少。長(zhǎng)期攝入DES會(huì)導(dǎo)致雄性雌性化，造成嚴(yán)重的“陰盛陽(yáng)衰”。Shukuwa等[20]發(fā)現(xiàn)，DES會(huì)導(dǎo)致雄鼠催乳素細(xì)胞密度明顯增加。當(dāng)水體中DES 濃度為1 ng·mL-1時(shí)，可導(dǎo)致雄性日本青鳉兩性化，5～10 ng·mL-1則完全雌性化[21]。對(duì)真鯛幼魚(yú)的雌激素效應(yīng)研究表明，暴露于一定濃度(0.08、0.8、8.0 μg·L-1)DES 42 d，真鯛幼魚(yú)的肥滿(mǎn)度均極顯著下降，血漿中卵黃蛋白原被誘導(dǎo)產(chǎn)生，肝胰臟指數(shù)和血漿蛋白總量顯著升高，顯示DES具有明顯的雌激素效應(yīng)[22]。新生期注射DES后在BALB/c小鼠中脾細(xì)胞黃體生成素的表達(dá)顯著減少，且雌性小鼠對(duì)DES的敏感性大于雄性小鼠，表明DES能影響小鼠的免疫器官[23]。用量為0.3和3 mg·kg-1的DES能促使幼年香豬睪丸生殖細(xì)胞數(shù)顯著增多，而使睪丸支持細(xì)胞數(shù)量顯著減少；不同劑量的DES都具有促進(jìn)幼年香豬睪丸和附睪中肥大細(xì)胞增多的作用，且具有劑量相關(guān)性[24-25]。此外，己烯雌酚還能誘導(dǎo)泥鰍紅細(xì)胞產(chǎn)生異形細(xì)胞、異常核和微核，說(shuō)明己烯雌酚對(duì)泥鰍紅細(xì)胞的形成有明顯的致突變作用[26]。

2.2.2 喹乙醇

喹乙醇屬于喹噁啉類(lèi)，是一種曾在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的抗菌促生長(zhǎng)劑，是我國(guó)養(yǎng)殖飼料中最常用的獸藥及飼料添加劑之一，其不僅對(duì)于魚(yú)類(lèi)和禽類(lèi)具有較強(qiáng)的急性毒性作用，而且作用于動(dòng)物后會(huì)嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物肝腎組織，引起機(jī)體生理生化指標(biāo)的變化等亞慢性毒性反應(yīng)。喹乙醇以原形或代謝物的方式從動(dòng)物糞、尿等排泄物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，或者以漁場(chǎng)水體直接用藥的方式，造成土壤環(huán)境、表層水體、水生和陸生生物的喹乙醇?xì)埩粜罘e，進(jìn)而引起生態(tài)毒性。在實(shí)際生產(chǎn)中，喹乙醇由于不當(dāng)用藥而引起養(yǎng)殖動(dòng)物中毒甚至死亡的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

據(jù)報(bào)道，喹乙醇對(duì)大型蚤(Daphnia magna)的急性毒性較強(qiáng)，作為漁場(chǎng)的飼料添加劑，喹乙醇對(duì)水環(huán)境有潛在的不良作用[27]。此外，喹乙醇還可顯著影響斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育過(guò)程，有明顯的致畸作用；可以引起鯉魚(yú)腎細(xì)胞DNA的明顯損傷，致染色體斷裂，具有潛在的遺傳毒性，應(yīng)該嚴(yán)格控制喹乙醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用，消除其對(duì)魚(yú)類(lèi)等水生生物、人體和環(huán)境的潛在危害[28]。近些年的研究表明，喹乙醇還對(duì)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用，通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)，高于0.3 μg·mL-1濃度的喹乙醇可顯著導(dǎo)致草魚(yú)肝細(xì)胞和胰腺外分泌部細(xì)胞的脂肪積累，抑制草魚(yú)胰腺外分泌部細(xì)胞胰蛋白酶原的合成；當(dāng)添加喹乙醇1.8 μg·mL-1時(shí)，可導(dǎo)致部分草魚(yú)胰腺外分泌部細(xì)胞形態(tài)發(fā)生病理變化[29]。給小鼠灌喂不同劑量喹乙醇，發(fā)現(xiàn)大劑量喹乙醇會(huì)抑制機(jī)體的紅細(xì)胞免疫功能；小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)隨著喹乙醇劑量的增大均不同程度降低，說(shuō)明大量使用喹乙醇可能會(huì)抑制胸腺的發(fā)育，對(duì)脾臟的重量也有一定影響，致使小鼠的免疫機(jī)能下降[30]。

2.2.3 大豆異黃酮

大豆異黃酮是植物雌激素，黃酮類(lèi)化合物中的一種，主要存在于豆科植物中，大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)中形成的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。由于是從植物中提取，與雌激素有相似結(jié)構(gòu)，可通過(guò)與雌激素受體(ER)結(jié)合表現(xiàn)出雌激素的生物學(xué)活性，緩解圍絕經(jīng)期婦女的臨床癥狀；可促進(jìn)和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與增殖，維持自身免疫穩(wěn)定性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加圍絕經(jīng)期婦女的免疫功能[31]。大豆異黃酮作為一種新型的飼料添加劑，具有良好的抗病和促生長(zhǎng)作用，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高產(chǎn)奶量，改善乳品品質(zhì)，且在一定程度上還有無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，但是就其是否會(huì)增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及對(duì)生育能力產(chǎn)生影響仍存在很大的爭(zhēng)議，還需進(jìn)一步研究。吳靜等[29]研究表明，大豆異黃酮可增加卵巢大鼠血清E2水平，作用稍弱于傳統(tǒng)雌激素，但可以明顯增加CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+細(xì)胞比例的值和胸腺的重量。近期研究表明，大豆異黃酮能影響雄性生殖激素分泌、睪丸和附睪組織的生長(zhǎng)發(fā)育、睪酮合成相關(guān)酶的活性以及大腦中生殖激素基因的表達(dá)，并與劑量有關(guān)，對(duì)雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)可能產(chǎn)生的不良作用不容忽視。

大多種內(nèi)分泌干擾藥物的長(zhǎng)期毒害效應(yīng)體現(xiàn)在它們具有傳代效應(yīng)，這其中牽涉到表觀遺傳狀態(tài)的改變。激素類(lèi)獸藥引起傳代效應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制就是引起DNA甲基化圖式的改變。烯菌酮是一種殺菌劑，也是環(huán)境激素的一種，暴露于烯菌酮或其他幾種物質(zhì)中的水蚤的DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生穩(wěn)定持續(xù)地降低，且這種變化可在其后代沒(méi)有受過(guò)其影響的世代中出現(xiàn)[33]。烯菌酮處理F0代鼠后，在F3代鼠的精子中也會(huì)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)的改變，證明潛在的間接遺傳異?，F(xiàn)象和表觀遺傳傳代繼承的存在[34]。暴露于17α-炔雌醇一段時(shí)間后，成年斑馬魚(yú)肝臟中卵黃蛋白原I基因的5'側(cè)翼的甲基化水平下降，表明由雌激素誘導(dǎo)的卵黃蛋白原表達(dá)涉及到DNA甲基化水平的改變[35]。

從目前的研究報(bào)道來(lái)看，大多數(shù)試驗(yàn)得到的獸藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的毒性效應(yīng)經(jīng)常是在大大高于實(shí)際環(huán)境濃度的情況下得到的，觀察到的多數(shù)是藥物的急性毒性結(jié)果，而實(shí)際環(huán)境濃度條件下獸藥的生態(tài)毒性較小，但是應(yīng)該考慮到，部分獸藥持續(xù)地進(jìn)入環(huán)境且難以降解，加之環(huán)境污染物常以低劑量復(fù)合形式存在，其對(duì)生物的潛在影響常常是難以通過(guò)短期的試驗(yàn)觀察到的，因此需建立可靠的低劑量復(fù)合長(zhǎng)期暴露的方法學(xué)，關(guān)注激素獸藥的低濃度復(fù)合作用下的內(nèi)分泌干擾作用研究。為降低獸藥應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該研究減少、避免和消除獸藥在生態(tài)環(huán)境中殘留的方法和措施。通過(guò)完善獸藥監(jiān)控體系，加大行政執(zhí)法力度，優(yōu)化畜禽的給藥方案，研制和推廣使用天然藥物等方法，減少或避免獸藥殘留。

3 可應(yīng)用于獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物篩選的方法建議(Proposal of screening method for veterinary drug class of endocrine disruptors)

就目前已建立的較成熟的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的快速篩選和檢測(cè)方法，可以歸為4大類(lèi)研究方法：模型動(dòng)物篩選法、組織器官篩選法、細(xì)胞篩選法和分子篩選法[36]。具體篩選和檢測(cè)方法可應(yīng)用于獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的研究，下面就其中可用于評(píng)價(jià)獸藥內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的指標(biāo)，分別闡述如下：

3.1 模型動(dòng)物篩選法

主要包括大鼠子宮增重法和水生生物形態(tài)學(xué)變化觀察法。大鼠子宮增重法步驟固定且篩選程序簡(jiǎn)單，是最為成熟的篩選檢測(cè)環(huán)境雌激素的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法之一，選用未成熟的雌幼鼠或摘除卵巢的雌成鼠為研究對(duì)象，以口服或皮下注射的方式，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)3～4 d暴露于待測(cè)化學(xué)物質(zhì)，然后剝離受試對(duì)象的子宮并測(cè)定對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組子宮的脂肪、干重或濕重與體重的比值，進(jìn)而評(píng)價(jià)待測(cè)化學(xué)物質(zhì)是否具有促進(jìn)子宮生長(zhǎng)的作用，判斷其是否具有雌激素效應(yīng)[37,38]。而水生生物形態(tài)學(xué)變化觀察法則是選用魚(yú)類(lèi)或甲殼類(lèi)動(dòng)物等水生生物作為模型生物，根據(jù)其形態(tài)特征的改變用于篩選具有雌激素活性及雄激素活性的化學(xué)物質(zhì)，但這種形態(tài)學(xué)指標(biāo)不如細(xì)胞或分子水平上的指標(biāo)精確度高。

3.2 組織器官篩選法

主要是競(jìng)爭(zhēng)性雌激素受體結(jié)合法(Competitive Estrogen Receptor Binding Assays)：具有雌激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物可以在特定器官內(nèi)(如肝臟)與雌激素受體結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答，并最終表現(xiàn)為卵黃原蛋白(vitellogenin，VTG)等終端產(chǎn)物的生成，既可以通過(guò)測(cè)量受體結(jié)合力，又可以通過(guò)監(jiān)測(cè)終端產(chǎn)物的產(chǎn)量，較為靈敏地監(jiān)測(cè)出待測(cè)物對(duì)生物體造成的內(nèi)分泌干擾影響。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(EPA)已將雌激素受體結(jié)合法廣泛應(yīng)用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的前期快速篩選步驟中。

3.3 細(xì)胞篩選法

包括細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)法和酵母雌激素篩選測(cè)試法。前者除了能夠通過(guò)特定器官內(nèi)的細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)生成生物標(biāo)志物以外，具有雌激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物還可以對(duì)含有雌激素受體的人乳腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答[39]，這其中應(yīng)用最廣泛的即為MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MCF-7 cell proliferation bioassay)[40]；酵母雌激素篩選測(cè)試法則是利用特定生物標(biāo)志物，如卵黃原蛋白等建立重組酵母篩選系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)基因酵母作為生物模型，利用受體-配體之間的相互作用進(jìn)行內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、靈敏度極高，一般比MCF-7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和子宮增重方法高出2～5個(gè)數(shù)量級(jí)。

3.4 分子篩選法

主要是免疫檢測(cè)法，其基本原理是生物分子(受體)與相應(yīng)的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，然后利用同位素、酶、熒光或化學(xué)發(fā)光底物等標(biāo)記技術(shù)加以顯示，根據(jù)生物分子被誘導(dǎo)產(chǎn)生的水平判斷化學(xué)物質(zhì)是否具有內(nèi)分泌干擾特性[41]。免疫檢測(cè)方法主要包括放射免疫分析法、酶免疫測(cè)定法、熒光免疫分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法，其中以酶聯(lián)免疫法(EIA)和放射免疫法(RIA)最為常用。選取方便高效的生物標(biāo)志物是各種免疫檢測(cè)法中的關(guān)鍵所在，卵黃原蛋白是應(yīng)用最早也是最為廣泛的篩選類(lèi)雌激素化合物的生物標(biāo)志物，其中卵黃原蛋白的酶聯(lián)免疫吸附方法最為方便，檢出限可達(dá)2～6 ng·mL-1。此外，卵殼前體蛋白(choriogenin，CHG)也是魚(yú)類(lèi)中研究得較多的一種生物標(biāo)志物。隨著內(nèi)分泌干擾分子機(jī)制研究的進(jìn)展，芳香化酶mRNA、ERβ mRNA等越來(lái)越多的分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)可用于內(nèi)分泌干擾物質(zhì)篩選[36]。

這4種研究水平的檢測(cè)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)：動(dòng)物模型整體水平的檢測(cè)法可以較為真實(shí)可靠地反映出獸藥是否能夠作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)生物體造成危害，但耗時(shí)耗材、精確度低；組織與器官水平的檢測(cè)法較動(dòng)物活體檢測(cè)要方便，并能在一定程度上檢測(cè)出某些需要經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝活化才會(huì)發(fā)揮性激素作用的化學(xué)物質(zhì)；細(xì)胞檢測(cè)法同樣采用宏觀指標(biāo)，但更為快速、便捷，應(yīng)用較廣泛；分子檢測(cè)法敏感度最高、耗時(shí)最短，可大大提高檢測(cè)效率，并越來(lái)越多地向?qū)嵺`應(yīng)用方向發(fā)展[36]。

3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇原則

在干擾物篩選方法的應(yīng)用中，選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)不但包括嚙齒類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)，還涉及到魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)等。模式生物的選取應(yīng)遵循一定的原則：1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易于獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；2)生長(zhǎng)迅速，生活周期短；3)基礎(chǔ)生物學(xué)研究比較深入，前期研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較豐富。不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靶標(biāo)有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)，如現(xiàn)有的一些脊椎動(dòng)物靶標(biāo)，其中大鼠就有個(gè)體太大和飼養(yǎng)周期太長(zhǎng)的缺點(diǎn)。就目前的研究現(xiàn)狀和水平，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室較易開(kāi)展的獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物篩選研究的模型生物有小型魚(yú)類(lèi)模型和兩棲類(lèi)模型，前者包括黑頭軟口鰷魚(yú)(fathead minnow，Pimephales promelas)、日本青鳉(Japanese medaka，Oryzias latipes)和斑馬魚(yú)(zebrafish，Brachydanio rerio)。根據(jù)不同水平的評(píng)價(jià)體系，魚(yú)類(lèi)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的評(píng)價(jià)終點(diǎn)可見(jiàn)表2。兩棲動(dòng)物生活周期比較復(fù)雜，幼體生長(zhǎng)速度快，食物鏈中具有水陸兩棲的獨(dú)特地位，卵、鰓和皮膚具有滲透性，能對(duì)污染物富積和放大，從而成為環(huán)境污染的前哨物種。目前適用于獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物篩選的兩棲模型動(dòng)物種類(lèi)有非洲爪蟾(Xenopus laevis)和熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，也有學(xué)者推薦家蠶可作為內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的動(dòng)物靶標(biāo)[42]，可通過(guò)調(diào)查家蠶的性腺指數(shù)、性腺的組織病理學(xué)變化，產(chǎn)卵能力、子代孵化率、以及生殖發(fā)育關(guān)鍵基因的變化等指標(biāo)，篩選可用于生殖毒性評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。但是，昆蟲(chóng)與哺乳動(dòng)物在進(jìn)化程度上有較大差異，將其內(nèi)分泌干擾效應(yīng)借鑒到哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)，還有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于獸藥內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究才剛剛起步，有關(guān)內(nèi)分泌干擾物的篩選方法很多，并且日趨豐富，在今后的研究上應(yīng)重點(diǎn)加深對(duì)干擾作用機(jī)制的研究。針對(duì)不同類(lèi)型的獸藥種類(lèi)，根據(jù)其可能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的不同途徑，選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及合適的篩選方式，并結(jié)合使用其他方法來(lái)輔助研究其潛在的內(nèi)分泌干擾作用。

4 內(nèi)分泌干擾物評(píng)價(jià)方法進(jìn)展(Advances in the evaluation method of the endocrine disruptors)

發(fā)達(dá)國(guó)家從20世紀(jì)90年代以來(lái)，開(kāi)始對(duì)內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行研究，并相繼發(fā)表了專(zhuān)題報(bào)告。OECD、美國(guó)、歐盟、日本等均建立了內(nèi)分泌干擾物篩選檢測(cè)的基本框架，并不斷完善。目前，OECD內(nèi)分泌分級(jí)篩選和檢測(cè)框架草案已提出，美國(guó)一級(jí)篩選各試驗(yàn)的指導(dǎo)原則已完善，歐盟在建立優(yōu)先名錄上取得了不錯(cuò)的進(jìn)展[43]。我國(guó)包括獸藥在內(nèi)的潛在內(nèi)分泌干擾物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法和篩選體系可參考美國(guó)EPA和OECD等發(fā)達(dá)國(guó)家和組織的經(jīng)驗(yàn)建立。US EPA提出的內(nèi)分泌干擾物篩選和檢測(cè)的基本框架包括初級(jí)分類(lèi)(Initial Sorting)、優(yōu)先選擇(Priority Setting)、一級(jí)篩選(Tier 1 Screening，T1S)、二級(jí)檢測(cè)(Tier 2 Testing，T2T)[44]。歐盟對(duì)內(nèi)分泌干擾物篩選的研究主要側(cè)重于優(yōu)先名錄的確定[42]和內(nèi)分泌干擾物對(duì)水生生物的研究[46]。歐盟于1999年制定了內(nèi)分泌干擾物的策略包括短期、中期和長(zhǎng)期措施。短期和中期的重點(diǎn)是為優(yōu)先名錄收集相關(guān)資料，以指導(dǎo)研究和監(jiān)測(cè)，確定消費(fèi)使用的具體情況和生態(tài)暴露情況。

OECD于2002年制定了內(nèi)分泌干擾物檢測(cè)與評(píng)價(jià)基本框架，并于2012年對(duì)其進(jìn)行了修訂[47]，包括5個(gè)層次評(píng)價(jià)，其中第一層次為利用化合物現(xiàn)有數(shù)據(jù)和非試驗(yàn)信息進(jìn)行初篩，包括化合物的物理化學(xué)特性，從標(biāo)準(zhǔn)和非標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試得到的所有可用(生態(tài))毒理學(xué)數(shù)據(jù)；交叉參照、化學(xué)分類(lèi)、定量-活性關(guān)系(QSARs)和其他電腦模擬預(yù)測(cè)，以及藥物代謝性質(zhì)(ADME)模型預(yù)測(cè)等。第二層次為體外測(cè)試，要求對(duì)提供特定內(nèi)分泌作用機(jī)理/途徑數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，包括雌激素或雄激素受體結(jié)合試驗(yàn)、雌激素受體轉(zhuǎn)錄激活、雄激素或甲狀腺激素轉(zhuǎn)錄激活、體外類(lèi)固醇生成和MCF-7細(xì)胞增殖測(cè)試(ER拮抗劑/興奮劑)等。

表2 魚(yú)類(lèi)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)評(píng)價(jià)終點(diǎn)Table 2 Assessment endpoints of endocrine disruption effects on fish

第三層次為體內(nèi)測(cè)試(哺乳類(lèi)和非哺乳類(lèi)方法)，對(duì)提供特定內(nèi)分泌作用機(jī)理/途徑數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，其中哺乳類(lèi)測(cè)試包括子宮增重法和赫什伯格法；非哺乳類(lèi)測(cè)試包括爪蟾胚胎甲狀腺激素信號(hào)通路測(cè)試、兩棲動(dòng)物變態(tài)測(cè)試、魚(yú)類(lèi)繁殖篩選測(cè)試等。第四層次也是利用更多體內(nèi)測(cè)試(哺乳類(lèi)和非哺乳類(lèi)方法)，提供更加豐富的內(nèi)分泌相關(guān)終點(diǎn)的有害效應(yīng)數(shù)據(jù)。第五層次為體內(nèi)測(cè)試(哺乳類(lèi)和非哺乳類(lèi)方法)，對(duì)提供大量生物體生命周期更多內(nèi)分泌相關(guān)重點(diǎn)的有害效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，其中哺乳類(lèi)測(cè)試包括一代延伸繁殖毒性測(cè)試和兩代繁殖毒性測(cè)試；非哺乳類(lèi)測(cè)試包括魚(yú)類(lèi)生命周期毒性測(cè)試(FLCTT)；青鳉多代測(cè)試(MMGT)；鳥(niǎo)類(lèi)兩代繁殖毒性測(cè)試和大型溞多代測(cè)試等。

我國(guó)尚未建立相關(guān)內(nèi)分泌干擾物篩選和檢測(cè)體系指導(dǎo)原則，因此包括獸藥在內(nèi)的潛在內(nèi)分泌干擾物均無(wú)成熟的評(píng)價(jià)體系。截至目前為止，一般針對(duì)獸藥的毒理學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)方法也只主要包括急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、致畸性和致癌性毒理學(xué)試驗(yàn)等，許多獸藥具有內(nèi)分泌干擾作用，用現(xiàn)有的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法標(biāo)準(zhǔn)有可能檢測(cè)不到其潛在的毒性作用。國(guó)內(nèi)開(kāi)展獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的研究相對(duì)較晚，未來(lái)需要借鑒國(guó)際上已有的先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，在國(guó)外研究評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，對(duì)國(guó)內(nèi)可能有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的獸藥進(jìn)行全面研究，做出科學(xué)評(píng)價(jià)，并制定出符合我國(guó)國(guó)情的內(nèi)分泌干擾物篩選和評(píng)價(jià)體系，進(jìn)而應(yīng)用在獸藥類(lèi)潛在內(nèi)分泌干擾物的管理當(dāng)中。

5 展望及建議(Prospects and suggestions)

1)雖然我國(guó)獸藥污染現(xiàn)狀及其潛在內(nèi)分泌干擾風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起相關(guān)管理部門(mén)和研究人員的重視，但必須注意的是，目前針對(duì)包括激素類(lèi)獸藥在內(nèi)的具有潛在內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的污染物的篩選研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且對(duì)不同種類(lèi)動(dòng)物的內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制的研究并不透徹，在今后的研究上應(yīng)重點(diǎn)加深對(duì)干擾的作用機(jī)制的探討；

2)需要借鑒國(guó)際上已有的先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，建立起符合我國(guó)特點(diǎn)的獸藥分泌干擾作用的評(píng)價(jià)體系，這需要開(kāi)發(fā)靈敏高效的離體評(píng)價(jià)體系，并需要分別以不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及哺乳動(dòng)物的活體評(píng)價(jià)模型，為潛在獸藥類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的危險(xiǎn)控制提供可靠的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)；

3)包括獸藥在內(nèi)的環(huán)境污染物常以低劑量復(fù)合形式存在，因此建立可靠的低劑量復(fù)合長(zhǎng)期暴露的方法學(xué)，以便開(kāi)展污染物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低劑量復(fù)合暴露下的內(nèi)分泌干擾作用的研究。

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