何 浩 陳幸鶯 孫映球 趙 娟

(湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411100)

頂空—?dú)庀嗌V法測(cè)定食品中亞硝酸鹽

何 浩 陳幸鶯 孫映球 趙 娟

(湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411100)

對(duì)頂空—?dú)庀嗌V測(cè)定飲用水、煙筍、外婆菜和烤耳尖中亞硝酸含量進(jìn)行研究，建立亞硝酸鹽的快速、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)方法，對(duì)該方法的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行推斷，并用頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。煙筍、外婆菜和烤耳尖經(jīng)粉碎、沸水提取、沉淀劑沉淀和過濾后，取樣品溶液分析，飲用水直接取樣分析。樣品處理液中先后加入環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液和硫酸溶液，在頂空瓶中50℃條件下發(fā)生重氮化反應(yīng)，以衍生產(chǎn)物環(huán)己烯作為目標(biāo)產(chǎn)物，定量分析。結(jié)果表明，低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線r2為0.999 0，取樣量為5 mL時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.001～0.200 mg/L；高濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線r2為0.999 5，取樣量為3 g時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.67～167.00 mg/kg。該方法檢出限低，線性范圍寬，重復(fù)性和回收率好，是快速檢測(cè)食品中亞硝酸鹽較好的方法。

亞硝酸鹽；頂空；氣相色譜；氣質(zhì)聯(lián)用；反應(yīng)機(jī)理；環(huán)己烯

亞硝酸鹽廣泛存在于環(huán)境中，是食品工業(yè)中最常用的護(hù)色劑和防腐劑之一，可與肉品中的肌紅蛋白反應(yīng)生成玫瑰色亞硝基肌紅蛋白，增進(jìn)肉的色澤，還具有改善肉的風(fēng)味和防腐的作用，防止肉毒梭菌的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)肉制品的貨架期[1]267。但過量的亞硝酸鈉會(huì)致癌。亞硝酸鈉在烹調(diào)和消化過程中會(huì)和食物中的胺反應(yīng)，產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝胺類化合物[1]268。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，普通肉制品類亞硝酸鹽殘留量(以NaNO2計(jì))≤30 mg/kg，肉罐頭類≤50 mg/kg，西式火腿≤70 mg/kg，其他食品中不得添加。泡菜及變質(zhì)的蔬菜中化學(xué)物質(zhì)也可轉(zhuǎn)化成為亞硝酸鹽。食品和飲用水中亞硝酸鹽并不一定是人工添加的，因?yàn)槭称吩诩庸ず痛娣胚^程中也會(huì)生成亞硝酸鹽[1]267-268。目前，檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的方法主要有分光光度法[2]、離子色譜法[3-4]、氣相色譜法(ECD檢測(cè)器)[5]、頂空—?dú)庀嗌V法(FID檢測(cè)器)[6-9]、頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用法[10]等。本試驗(yàn)擬探討頂空—?dú)庀嗌V(FID檢測(cè)器)檢測(cè)食品和包裝飲用水中亞硝酸鹽，在前人研究的基礎(chǔ)上[6-9]改進(jìn)樣品前處理步驟，并對(duì)試驗(yàn)過程進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，建立飲用水和其它復(fù)雜基質(zhì)食品中亞硝酸鹽的測(cè)定都適用的方法。本試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行預(yù)測(cè)，并用頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，為檢測(cè)各種食品基質(zhì)中亞硝酸鹽提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

亞硝酸鈉：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

四硼酸鈉(硼砂)：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

亞鐵氰化鉀：分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

二水乙酸鋅：分析純，西隴化工股份有限公司；

環(huán)己基氨基磺酸鈉：化學(xué)純，≥98.0%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

濃硫酸：分析純，湖南省株洲市化學(xué)工業(yè)研究所；

DB-1石英毛細(xì)管柱：15.0 m×0.53 mm，0.50 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

HP-5MS石英毛細(xì)管柱：30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

高純氮?dú)猓杭兌取?9.999%，湖南湘鋼梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司金陽(yáng)分公司；

高純氦氣：純度≥99.999%，廣州市恒源氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

頂空進(jìn)樣器：HSS86.50 plus型，意大利DANI公司；

氣相色譜儀：GC2010plus型，配FID檢測(cè)器，日本島津公司；

全自動(dòng)空氣源：SPB-3型，北京中惠普分析技術(shù)研究所；

空氣發(fā)生器：SPH-300型，北京中惠普分析技術(shù)研究所；

頂空—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7697A-7890A-5975C型，配NIST 11譜庫(kù)，美國(guó)安捷倫公司；

電子天平：ATY224型，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和主要溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.062 5 g于110℃干燥至恒重的亞硝酸鈉，加水溶解后移入250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，配成濃度為250.0 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A。將亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別逐級(jí)稀釋到5.0，0.5，0.05 μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)使用液B、C、D。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于4℃的冰箱中可保存2個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)使用液B、C、D現(xiàn)配現(xiàn)用。乙酸鋅溶液：220 g/L，每1 000 mL中加入30 mL 冰乙酸；亞鐵氰化鉀溶液：106 g/L；飽和硼砂溶液。

1.3.2 樣品前處理 將固體樣品用勻漿機(jī)打碎，稱取3 g(精確至0.000 1 g)樣品至100 mL試管中，加入5.0 mL飽和硼砂溶液，搖勻，加入60 mL 70℃的熱水，在沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。在提取液中加入2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻后加入2.0 mL乙酸鋅溶液，搖勻，定容至刻度后搖勻，靜置30 min，備用。上清液用濾紙過濾，棄去10.0 mL初始濾液，濾液備用。

液體樣品(包括含酒精或二氧化碳的飲料和飲用水)可直接取樣5.0 mL至頂空瓶中分析。

1.3.3 頂空方法 加熱箱溫度50℃，定量環(huán)溫度55℃，傳輸線溫度60℃，GC循環(huán)時(shí)間11.0 min，樣品瓶平衡時(shí)間30.0 min，定量閥體積1.0 mL。

1.3.4 氣相色譜參數(shù)

(1) 柱箱升溫程序：80℃(保持1 min)，40℃/min升溫到100℃(保持2 min)，40℃/min升溫到200℃(保持2 min)，共8 min。

(2) 其他色譜參數(shù)：氣化室溫度150.0℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度300.0℃，載氣為高純氮?dú)?，氫氣流?0.0 mL/min，空氣流量400.0 mL/min，色譜柱流量1.99 mL/min，尾吹氣流量30.0 mL/min，分流比20∶1。

1.3.5 氣質(zhì)聯(lián)用儀參數(shù)

(1) 柱箱升溫程序：80℃(保持1 min)，25℃/min升溫到155℃(保持6 min)，共10 min。

(2) 其他色譜和質(zhì)譜參數(shù)：氣化室溫度150.0℃，載氣為高純氦氣，色譜柱流量1.0 mL/min，分流比100∶1，氣質(zhì)接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，EI能量70 eV，溶劑延遲時(shí)間0.0 min，掃描方式為全掃描，掃描質(zhì)量數(shù)30～250 amu。

1.3.6 亞硝酸鹽的測(cè)定 向8個(gè)頂空瓶中分別加入0.0，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液D和1.0，2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液C(相當(dāng)于0.000，0.005，0.010，0.025，0.050，0.25，0.500，1.000 μg亞硝酸鈉)，補(bǔ)齊水至5 mL，加入1.0 mL 10 mg/mL 環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液，搖勻放置2 min，加入1.0 mL 100 g/L硫酸溶液，迅速壓緊瓶蓋，搖勻，上機(jī)。以亞硝酸鈉與環(huán)己基氨基磺酸鈉的衍生產(chǎn)物環(huán)己烯作為目標(biāo)物質(zhì)，繪制低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線適應(yīng)于純凈水和礦泉水中亞硝酸鹽的檢測(cè)。

向6個(gè)頂空瓶中分別加入0.0，0.1，0.2，1.0，2.0，3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液B(相當(dāng)于0.0，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0 μg亞硝酸鈉)，其他步驟同低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制成高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線適應(yīng)于其他食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)。

向頂空瓶中加入5.0 mL 1.3.2樣品處理濾液或液體樣品，其他步驟同低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空—?dú)庀嗌V試驗(yàn)結(jié)果

0.5 μg亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、飲用水、烤耳尖氣相色譜圖分別見圖1～3。以亞硝酸鈉進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4～5，低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線中峰面積為扣除去離子水作為空白的峰面積值。亞硝酸鹽衍生產(chǎn)物保留時(shí)間為1.750 min。低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線適合于純凈水和礦泉水中亞硝酸鹽的檢測(cè)，線性方程為：y=11 149x+377.8，r2為0.999 0，取樣量為5.0 mL時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.001～0.200 mg/L。高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線適合于其他食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)，線性方程為：y=11 417x+3 623.7，r2為0.999 5，稱樣量為3 g時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.67～167.00 mg/kg。

圖1 0.5 μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)氣相色譜圖Figure 1 Gas chromatogram of 0.5 μg nitrite standard substance

圖2 飲用水中亞硝酸鹽氣相色譜圖Figure 2 Gas chromatogram of nitrite in drinking water

圖3 烤耳尖中亞硝酸鹽氣相色譜圖Figure 3 Gas chromatogram of nitrite in roasted ear tip

圖4 低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以NaNO2計(jì))Figure 4 Standard curve of low concentration (evaluated by NaNO2)

圖5 高濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以NaNO2計(jì))Figure 5 Standard curve of high concentration (evaluated by NaNO2)

2.2 頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用儀驗(yàn)證結(jié)果

用頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用儀對(duì)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物進(jìn)行分析，總離子流圖見圖6，主要衍生產(chǎn)物的出峰時(shí)間為1.642 min，用Nist 11譜庫(kù)對(duì)其進(jìn)行檢索，證實(shí)了該反應(yīng)產(chǎn)物為環(huán)己烯，其特征離子為m/z=54，67，82，質(zhì)譜圖見圖7。環(huán)己基亞硝酸酯的特征離子為m/z=57，82，98，對(duì)亞硝酸鹽衍生物提取這3個(gè)特征離子未發(fā)現(xiàn)特征峰。證實(shí)了頂空氣相反應(yīng)的原理為亞硝酸鈉和環(huán)己基氨基磺酸鈉在酸性條件、常溫狀態(tài)下重氮化反應(yīng)生成環(huán)己烯，在50℃頂空瓶中，環(huán)己烯揮發(fā)到頂空瓶上方氣體相部分。GB 5009.97—2003《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中表明，亞硝酸鈉和環(huán)己基氨基磺酸鈉在酸性、冰浴條件下生成環(huán)己基亞硝酸酯，有學(xué)者[7]便因此認(rèn)為頂空條件下反應(yīng)產(chǎn)物也為環(huán)己基亞硝酸酯，未考慮反應(yīng)溫度的不同會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)機(jī)理和反應(yīng)產(chǎn)物不同。

圖6 亞硝酸鹽總離子流圖Figure 6 Total ion current of nitrite

圖7 亞硝酸鹽衍生物提取離子質(zhì)譜圖Figure 7 Extraction ion mass spectrometry of nitrite derivative

2.3 回收率、精密度、準(zhǔn)確度與檢出限

回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。以國(guó)標(biāo)方法測(cè)量值作為真值，則本方法測(cè)量值與真值的偏差見表2，分別為9.4%，8.7%與5.6%。本方法的回收率、精密度與準(zhǔn)確度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》附錄F要求。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍性噪比計(jì)算定量限，純凈水、礦泉水的檢出限為0.000 3 mg/L，定量限為0.001 6 mg/L；其他食品的檢出限為0.1 mg/kg，定量限為0.33 mg/kg，均優(yōu)于GB 5009.33—2010檢測(cè)方法。

表1 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率Table 1 Relative standard deviation and recovery rate (n=6)

表2 不同方法計(jì)算得到的樣品中亞硝酸鹽含量Table 2 The content of nitrite in the samples obtained by different methods (n=6)

2.4 試驗(yàn)分析

2.4.1 GB/T 5009.33—2010和本方法回收率均偏低的原因分析 食品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定(分光光度法)是一個(gè)比較成熟的方法，但本研究發(fā)現(xiàn)，回收率在86.9%～89.2%，當(dāng)試驗(yàn)過程控制不好時(shí)，甚至更低。本方法回收率也不高，為90.7%～91.9%，主要原因是樣品前處理過程的損失：① 樣品在煮沸提取和沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，將導(dǎo)致一定的損失；② 研究發(fā)現(xiàn)濾紙的使用會(huì)干擾硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定，導(dǎo)致結(jié)果嚴(yán)重偏離[11]；③ 各個(gè)試劑的添加順序和添加后的平衡時(shí)間不固定造成的影響。

2.4.2 試驗(yàn)用水的選擇和峰面積處理 對(duì)自來(lái)水、實(shí)驗(yàn)室自制去離子水和市場(chǎng)上3個(gè)大品牌純凈水進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣相色譜中均有較大的環(huán)己烯色譜峰，說明這些水中均存在著亞硝酸鹽，本試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)室自制去離子水作為試驗(yàn)用水。繪制低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積均為扣掉空白水峰面積后的值。而肉制品、蔬菜制品等前處理過程中均用到實(shí)驗(yàn)室用去離子水，因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積未扣除空白水的峰面積值。

2.4.3 其他注意事項(xiàng) 應(yīng)注意頂空和氣相色譜儀的維護(hù)，防止水對(duì)頂空進(jìn)樣系統(tǒng)和石英毛細(xì)管色譜柱的損壞。試驗(yàn)表明，當(dāng)頂空進(jìn)樣器和氣相色譜連續(xù)進(jìn)樣50次以上未維護(hù)時(shí)，環(huán)己烯的峰形和重復(fù)性變差。應(yīng)在連續(xù)進(jìn)樣20次后，將頂空進(jìn)樣器的爐溫、定量環(huán)和傳輸線在130℃老化2 h以上，將色譜柱在最高耐受溫度下老化0.5～1.0 h。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了頂空—?dú)庀嗌V(FID檢測(cè)器)測(cè)定飲用水、煙筍、外婆菜和烤耳尖中亞硝酸鹽的方法。本試驗(yàn)優(yōu)化了樣品前處理步驟，對(duì)試驗(yàn)過程中影響加標(biāo)回收率的因素進(jìn)行分析。包裝飲用水和其他復(fù)雜基質(zhì)食品分別采用不同的線性方程進(jìn)行分析。與GB/T 5009.33—2010相比，本方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，分析不受樣品溶液顏色的影響，且回收率、精密度、準(zhǔn)確度均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范(GB/T 27404—2008)要求，檢出限明顯優(yōu)于GB/T 5009.33—2010。用頂空—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)主產(chǎn)物為環(huán)己烯，而不是一些研究人員[7]推斷的環(huán)己基亞硝酸酯。

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Determination of nitrite in food by using headspace-gas chromatography

HE HaoCHENXing-yingSUNYing-qiuZHAOJuan

(XiangtanInstituteforFoodandDrugControl,Xiangtan,Hunan411100,China)

The determination of nitrite content in drinking water, smoked bamboo shoot, grandmother food and roasted ear tip was studied by using headspace-gas chromatography, and a fast, accurate and quantitative detection method of nitrite was established. The reaction mechanism of this method was deduced, and the relative products were validated by the headspace gas chromatography-mass spectrometry. The sample solution of smoked bamboo shoot, grandmother food and roasted ear tip were analyzed after crushing, boiling water extraction, precipitation and filtration, and then sodium cyclamate and sulfuric acid solution were added to pretreated sample. Diazo reaction was reacted in headspace bottle at 50℃, using the derivatives of cyclohexene as the target product and quantitative analysis. In this paper, the low concentration standard material standard curver2was 0.999 0. Moreover, the corresponding detection range was 0.001 ～ 0.200 mg/L when 5 mL sample was used. However, the high concentration standard material standard curver2was 0.999 5, and the corresponding detection range was 0.67～167.00 mg/kg while was 3 g sample was used. It was verified to be a good method for the detection of nitrite in food, with low detection limit, wide linear range, and good repeatability and recovery rate.

nitrite; headspace; gas chromatography; gas chromatography-mass spectrometer; reaction mechanism; cyclohexene

何浩(1986—)，男，湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所工程師，碩士。E-mail: 710754686@qq.com

2017—01—05

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.012