王毅謙,陳君義,龍?jiān)气P,陸慧媛,方云濤,于 洋

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇南京 210000;2.徐州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇徐州 221006;3.揚(yáng)州伊綠鮮生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,江蘇揚(yáng)州 225000)

糧谷中嘔吐毒素管式化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究與應(yīng)用

王毅謙1,陳君義2,龍?jiān)气P1,陸慧媛1,方云濤1,于 洋3

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇南京 210000;2.徐州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇徐州 221006;3.揚(yáng)州伊綠鮮生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,江蘇揚(yáng)州 225000)

目的:建立一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性優(yōu)的快速檢測(cè)糧谷中嘔吐毒素(DON)的管式化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)。方法:本研究基于抗原抗體的特異性反應(yīng),選擇磁性微粒為固相載體,通過(guò)優(yōu)化磁微粒的稀釋度、反應(yīng)時(shí)間等工作條件,建立了高準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好的DON-CLIA。結(jié)果:本研究建立的DON-CLIA的檢測(cè)范圍為5～185 ng/mL;最低檢測(cè)限為3.82 ng/mL(樣本檢測(cè)限為0.076 μg/g);準(zhǔn)確度相對(duì)偏差為6.64%,重復(fù)性變異系數(shù)為2.32%,均小于10%;DON的添加回收率在90%～110%之間。結(jié)論:本研究建立的DON-CLIA的檢測(cè)范圍、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、回收率,均符合實(shí)際工作的要求,是一種快速、高效、準(zhǔn)確的化學(xué)發(fā)光免疫分析法,適用于大量樣本的DON含量的測(cè)定。

嘔吐毒素,化學(xué)發(fā)光,磁微粒

嘔吐毒素,又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是一種菌毒素,屬于單端孢霉烯族類化合物,伴隨著谷物的生長(zhǎng)過(guò)程而產(chǎn)生,不易預(yù)防[1-2]。DON具有細(xì)胞毒性、胚胎毒性、致畸性、致癌性,能夠?qū)Χ喾N動(dòng)物造成多系統(tǒng)的毒性損傷,當(dāng)動(dòng)物中毒時(shí)首先表現(xiàn)為嘔吐[3]。由于DON具有很高的細(xì)胞毒性及免疫抑制性,因此,對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅,特別是對(duì)免疫功能具有明顯的影響[4]。根據(jù)DON的劑量和暴露時(shí)間不同,可引起免疫抑制或免疫刺激。當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后,會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡[5]。由于中國(guó)傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例大大高于西方,使得嘔吐毒素的危害更為突出。美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)規(guī)定食物中嘔吐毒素的安全標(biāo)準(zhǔn)是1000 μg/kg,嘔吐毒素的含量超過(guò)l000 μg/kg就會(huì)對(duì)人及一些動(dòng)物健康產(chǎn)生損害。因此,對(duì)于食品及原料中DON的檢測(cè)和控制是極為重要的,建立高效、快速的DON檢測(cè)方法具有重要的意義。

目前使用較多的DON檢測(cè)方法包括薄層色譜法、液相檢測(cè)法、液質(zhì)聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫分析法。薄層色譜法雖然操作簡(jiǎn)便,曾被廣泛應(yīng)用,但在檢測(cè)過(guò)程中操作人員必須直接接觸標(biāo)準(zhǔn)品,危害到操作人員的身體健康,處理樣品時(shí)工作量大,且在提取過(guò)程中需要使用大量的有機(jī)溶劑,這會(huì)對(duì)周圍環(huán)境產(chǎn)生不利影響。液相檢測(cè)法、氣相檢測(cè)法、液質(zhì)檢測(cè)法[6-7]在實(shí)際應(yīng)用中檢測(cè)靈敏度高,但需要較高的專業(yè)性需要昂貴精密的儀器,樣本的前期處理較為繁瑣,操作時(shí)需要專門的技術(shù)人員,不便推廣使用,此外也不適合大批量樣本檢測(cè)。酶聯(lián)免疫分析法以及金標(biāo)法檢測(cè)方便、成本低,但靈敏度不高,反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求[8-9]。

免疫檢測(cè)法靈敏、成本低、操作簡(jiǎn)單,更適合大規(guī)模的普遍檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)將化學(xué)發(fā)光和免疫技術(shù)相結(jié)合,具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性強(qiáng)特點(diǎn)。管式磁微粒CLIA是以磁性微粒為固相載體,基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫分析方法,其靈敏度較高,反應(yīng)時(shí)間短,適用于大量樣本的檢測(cè)[10-11]。本研究利用磁性微粒連接DON作為載體,在U型反應(yīng)管中進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng),通過(guò)對(duì)方法中磁微粒的稀釋度、反應(yīng)時(shí)間等體系變化,建立了建立一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性優(yōu)的快速檢測(cè)糧谷中DON的管式化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)(DON-CLIA),考察了DON-CLIA的檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、回收率等性能參數(shù),并在實(shí)際應(yīng)用中做了初步嘗試。DON-CLIA樣本處理簡(jiǎn)單,檢測(cè)的成本低廉,檢測(cè)所需時(shí)間短暫,尤其適用于樣本的大批量篩檢。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基磁微粒 上海阿拉丁;DON標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)sigma公司;DON-卵清蛋白交聯(lián)復(fù)合物 DON-OVA(實(shí)驗(yàn)室自制),吖啶酯-抗DON單克隆抗體 實(shí)驗(yàn)室自制。

磁微粒包被液:0.05 mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液,pH9.6;封閉液:1% OVA溶液;PBS溶液:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.4;PBST洗液:0.05%吐溫-20的PBS溶液,pH7.4;稀釋液:磷酸鹽緩沖液(PBS);CLIA發(fā)光啟動(dòng)液:H2O2稀堿溶液;磁微?；罨?50%戊二醛;磁微粒儲(chǔ)存液:甘氨酸-BSA溶液;樣本提取液:10%甲醇-PBS溶液。

NRM411化學(xué)發(fā)光儀 南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司;FM-2粉碎機(jī) 上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;TS100恒溫回旋震蕩器 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DON-CLIA分析法建立

1.2.1.1 磁微粒載體包被方法 取1 mg磁微粒置于離心管中,磁分離去上清,加入活化液作用30 min,磁分離去上清,PBST洗滌2次,加入5 μg/mL DON-OVA溶液37 ℃恒溫回旋震蕩器上包被2 h,磁分離去上清,加入OVA溶液于37 ℃恒溫回旋震蕩器上封閉2 h,磁分離去上清,PBS洗滌2次,加入儲(chǔ)存液4 ℃保存。

1.2.1.2 DON-CLIA的反應(yīng)過(guò)程 取預(yù)包被磁微粒2 μL,按照1∶200稀釋度PBS稀釋,磁分離去上清,加系列DON標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣本100 μL以及吖啶酯-抗DON單克隆抗體100 μL于37 ℃恒溫回旋震蕩器上反應(yīng)15 min,加入100 μL CLIA發(fā)光啟動(dòng)液,讀取發(fā)光值RLU。磁微粒包被和DON-CLIA反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。

圖1 DON-CLIA檢測(cè)法反應(yīng)過(guò)程圖Fig.1 The reaction process of DON-CLIA

1.2.2 DON-CLIA最佳工作條件的確立

1.2.2.1 磁微粒稀釋度 將已包被好的DON磁微粒按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶300比例稀釋后分別加入0、400 ng/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度RLU0、RLU400。

1.2.2.2 反應(yīng)時(shí)間 確定磁珠稀釋度,加入0、400 ng/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)10、15、20、30 min,測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度RLU0、RLU400。

1.2.3 DON-CLIA性能的測(cè)定 用PBS稀釋制備系列DON標(biāo)準(zhǔn)品0、50、100、200、400 ng/mL,按照本實(shí)驗(yàn)的DON-CLIA檢測(cè)方法,確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.1 檢測(cè)范圍 根據(jù)擬合曲線,按照公式(IC(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組發(fā)光值/對(duì)照組發(fā)光值值)×100)計(jì)算不同濃度DON對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值,以IC5～I(xiàn)C90范圍為該方法的檢測(cè)范圍。

1.2.3.2 最低檢測(cè)限 用0 ng/mL校準(zhǔn)品作為樣本進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)測(cè)定20次,得出20次測(cè)量結(jié)果的發(fā)光值(RLU值),計(jì)算其平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD),得出M+2SD所對(duì)應(yīng)的RLU值,根據(jù)試劑盒所用校準(zhǔn)品的定標(biāo)曲線方程,將M+2SD所對(duì)應(yīng)的RLU值帶入上述方程中,求出對(duì)應(yīng)的濃度值,即為檢測(cè)限。

1.2.3.3 準(zhǔn)確度 取定值濃度樣本重復(fù)測(cè)量3次后,計(jì)算其平均值(M),根據(jù)公式B(%)=(M-T)/T×100計(jì)算測(cè)量濃度的相對(duì)偏差(B)。

1.2.3.4 重復(fù)性 用兩個(gè)定值濃度樣本重復(fù)測(cè)量10次,計(jì)算每個(gè)樣本10次測(cè)量濃度結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD,根據(jù)公式CV(%)=SD/M×100得出變異系數(shù)CV。

1.2.3.5 回收率 添加法配制高中低三個(gè)定值濃度樣本重復(fù)測(cè)量3次,計(jì)算每個(gè)樣本的3次測(cè)量濃度結(jié)果的平均值M,均值與實(shí)際添加濃度比值即為回收率。

1.3 樣本提取方法以及檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)樣本為小麥、玉米、豬配合飼料。DON易溶于水及有機(jī)溶劑,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12]分析確立如下的樣本提取方法,取粉碎后的實(shí)驗(yàn)樣本粉末5 g,用50 mL提取液震蕩30 min,離心15 min后,過(guò)濾后,取濾液備用,使用時(shí)稀釋一倍作為實(shí)驗(yàn)樣本。本實(shí)驗(yàn)選用了隨機(jī)選擇的市場(chǎng)上的5份小麥、5份玉米、5份豬配合飼料,前處理后作為實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè),分別測(cè)定3次,在化學(xué)發(fā)光儀上獲得RLU值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)中建立的標(biāo)曲回算出樣本的濃度值,再根據(jù)樣本的處理方法計(jì)算出實(shí)際樣本的嘔吐毒素的含量的測(cè)定值,計(jì)算其變異系數(shù)CV。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理圖表均由GraphPad Prism 5軟件完成,圖中數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)做出誤差棒顯示。表格中數(shù)據(jù)計(jì)算獲得均值和變異系數(shù)(CV)。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖通過(guò)mELISA軟件獲得,其擬合方式為四參數(shù)擬合法。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON-CLIA最佳工作條件的確立

2.1.1 磁微粒稀釋度 如圖2所示,在1∶200磁微粒稀釋度下,RLU0值最高,RLU400/RLU0最小,其靈敏度更高,由此確定磁微粒的最佳稀釋度為1∶200。

圖2 DON-CLIA檢測(cè)法磁微粒稀釋度確定Fig.2 The determination of magnetic particles dilution in DON-CLIA

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間 如圖3所示,在反應(yīng)時(shí)間15 min后,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)RLU0數(shù)值變化趨于平緩,其靈敏度均符合要求,但考慮其檢測(cè)高效的原則下,選擇較短的反應(yīng)時(shí)間。在反應(yīng)15 min時(shí)RLU400/RLU0的比值較低,RLU0較高,都符合檢測(cè)要求,因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖3 DON-CLIA檢測(cè)法反應(yīng)時(shí)間確定Fig.3 The determination of reaction time in DON-CLIA

2.2 DON-CLIA性能

該DON-CLIA檢測(cè)方法確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,其擬合曲線的相似度大于0.99。根據(jù)擬合曲線,獲得該檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為5～185 ng/mL。

圖4 DON-CLIA檢測(cè)法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of DON detection by CLIA

測(cè)定獲得20份0 ng/mL校準(zhǔn)品的發(fā)光值,經(jīng)過(guò)計(jì)算得出本實(shí)驗(yàn)的最低檢測(cè)限為3.82 ng/mL,即樣本檢測(cè)限為0.076 μg/g。

準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中,測(cè)定獲得3份200 ng/mL的定值樣本的發(fā)光值,經(jīng)過(guò)計(jì)算其相對(duì)偏差為6.64%,小于10%。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中,測(cè)定獲得10份200 ng/mL和10份100 ng/mL的定值樣本的發(fā)光值,經(jīng)過(guò)計(jì)算其變異系數(shù)分別為2.94%和2.32%,均小于10%。

回收實(shí)驗(yàn)中,分別測(cè)定獲得3份11、33、100、300 ng/mL的定值樣本的發(fā)光值,經(jīng)過(guò)計(jì)算,其回收率均在90%～110%之間,如表1所示。

表1 DON-CLIA的回收率Table 1 The recovery rate of DON in DON-CLIA

DON-CLIA檢測(cè)法檢測(cè)范圍、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、回收率均符合了實(shí)際工作的要求。

2.3 DON-CLIA進(jìn)行樣本檢測(cè)

表2 DON-CLIA檢測(cè)十幾樣本的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery of DON in samples by DON-CLIA detection

如表2所示,為小麥、玉米和豬配合飼料的實(shí)際樣本的測(cè)定值,經(jīng)過(guò)計(jì)算三者變異系數(shù)CV分別為均小于10%,該方法實(shí)際應(yīng)用中可有較好的樣本檢測(cè)重復(fù)性;對(duì)于隨隨機(jī)獲得的5份小麥、5份玉米、5份豬配合飼料的均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有超出安全標(biāo)準(zhǔn)(1000 ng/g),該方法能較好的用于實(shí)際樣本中的DON含量的定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化磁微粒的稀釋度和反應(yīng)時(shí)間,建立了高準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好的DON-CLIA。該方法特異性強(qiáng),靈敏度高,檢測(cè)范圍為5～185 ng/mL;最低檢測(cè)限為3.82 ng/mL(樣本檢測(cè)限為0.076 μg/g);準(zhǔn)確度相對(duì)偏差為6.64%,重復(fù)性變異系數(shù)為2.32%,均小于10%;DON的添加回收率在90%～110%之間。隨機(jī)選擇的市場(chǎng)上的15份樣本前處理后進(jìn)行檢測(cè),在實(shí)際樣本的分析中均能達(dá)到檢測(cè)要求。綜上所述,DON-CLIA樣本處理簡(jiǎn)單,檢測(cè)的成本低廉,檢測(cè)所需時(shí)間短暫,尤其適用于樣本的大批量篩檢。

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Investigation and application of a tubular Chemiluminiscence immunoassay on detection of Deoxynivalenol

WANG Yi-qian1,CHEN Jun-yi2,LONG Yun-feng1,LU Hui-yuan1,FANG Yun-tao1,YU Yang3

(1.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210000,China;2.Xuzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xuzhou 221006,China;3.Efresh Eco-Agriculture Co.LTD,Yangzhou 225000,China)

Objective:To establish a high accurate and excellently repeatable tubular Chemiluminiscence immunoassay(CLIA)for rapid detection of Deoxynivalenol(DON)in cereals.Method:Based on the specific antigen-antibody reaction,magnetic particles were used as the solid phase carrier. The operating conditions,such as the concentration of magnetic particles and reaction time,were optimized. A high accurate tubular CLIA for quantifying of DON(DON-CLIA)in cereals was established. Result:This DON-CLIA showed an excellent performance in linear with range of 5～185 ng/mL. The limit of detection(LOD)was 3.82 ng/mL. Both relative deviation of accuracy(6.64%)and coefficient of variation of repeatability(2.32%)were less than 10%. The percent recovery of DON was 90%～110%. Conclusion:All performance parameters of DON-CLIA,such as detection range,LOD,accuracy,repeatability and recovery,areaccorded with requirement of DON detection. This DON-CLIA,with high sensitivity and specificity,is suitable for quantitative determination of DON in cereals.

Deoxynivalenol;Chemiluminiscence;magnetic particles

2016-08-04

王毅謙(1980-),女,碩士,高級(jí)工程師,主要從事糧油食品檢測(cè)工作,E-mail:w1000319@163.com。

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(2015KJ25)。

TS210.7

A

:1002-0306(2017)03-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.048