張叢堯,任盟,左然濤,孫丕海,楊志平,喬雁冰,馬悅欣

(1.大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連116023;2.大連海洋大學海珍品苗種培育基地,遼寧 大連116023;3.大連匯新鈦設備開發(fā)有限公司,遼寧大連116039)

益生菌對生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中刺參幼參生長、消化酶和免疫反應的影響

張叢堯1,任盟1,左然濤1,孫丕海2,楊志平3,喬雁冰1,馬悅欣1

(1.大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連116023;2.大連海洋大學海珍品苗種培育基地,遼寧 大連116023;3.大連匯新鈦設備開發(fā)有限公司,遼寧大連116039)

為了解益生菌對生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中刺參Apostichopus japonicus幼參生長、消化酶和免疫反應的影響,選擇體質量為 (10.77±0.07)g的健康幼參,隨機分配到6個盛有20 L沙濾海水的聚乙烯養(yǎng)殖箱中,每箱放30頭幼參,試驗設對照組和益生菌組 (枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis+硝化菌),每組設3個平行,對照組每天投喂1次基礎餌料 (約為幼參體質量的4%)并添加蔗糖 (基礎餌料的70%),益生菌組在對照組基礎上,每3 d向水體中添加枯草芽孢桿菌和硝化菌制劑各1.8 g,養(yǎng)殖試驗共進行60 d。結果表明:與對照組相比,養(yǎng)殖30、60 d時,益生菌組幼參的特定生長率均顯著提高 (P＜0.05);益生菌組幼參腸道淀粉酶和脂肪酶活力均顯著增強 (P＜0.05),但胰蛋白酶活力與對照組無顯著性差異 (P＞0.05);益生菌組幼參的體腔細胞吞噬活力、體腔液和體腔細胞裂解液溶菌酶活力均顯著增強 (P＜0.05)。研究表明,生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加益生菌可促進幼參生長,提高消化酶活力和增強免疫反應。

刺參;益生菌;生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng);消化酶;免疫反應

刺參Apostichopus japonicus是中國北方地區(qū)重要的海珍品養(yǎng)殖種類,具有較高的營養(yǎng)價值和經濟價值[1]。目前,刺參養(yǎng)殖主要分布于山東、遼寧、河北、江蘇、浙江、福建和廣東省[2],2013年,全國刺參增養(yǎng)殖面積達20多萬hm2,年產量近20 萬t,產值約200億元[3]。刺參養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展更加需要改進生產系統(tǒng)、加強生物安全和減少對環(huán)境影響的措施[4-5]。研究表明,將益生菌 (單一菌株或多株混合菌)加入到養(yǎng)殖水體或作為飼料添加劑,可促進刺參生長[6-12]、提高消化酶活性[6,11-15]和增強免疫功能[7-12,14,16-17]。 近年來, 生物絮團在刺參養(yǎng)殖中的應用受到國內學者越來越多的關注[18-21],生物絮團可促進幼參的生長,提高其消化道淀粉酶活性[20-21]。但是,在生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加益生菌對刺參生長、消化酶活力和免疫反應的影響研究極少[20]。本試驗中,以蔗糖為碳源建立生物絮團系統(tǒng),研究了水體中添加商品益生菌對幼參生長、消化酶和免疫反應的影響,旨在為益生菌在刺參生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康幼參購自遼寧省大連市某刺參養(yǎng)殖場?；A餌料配方 (干質量):海帶粉14%、小麥粉24%、魚粉5%、豆粕4%、多維1%、多礦1%、啤酒酵母1%、玉米秸稈粉50%。餌料中粗蛋白質含量為14.6%。

固體菌劑超級硝化菌和富硒-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 5×1010cells/g)分別購自臺灣雷爾公司和鹽城市神微微生物菌種科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將幼參在水溫15℃下暫養(yǎng)7 d后開始試驗。選擇體質量為 (10.77±0.07)g的幼參,隨機分配到6個盛有20 L沙濾海水的聚乙烯養(yǎng)殖箱 (50 cm×40 cm×38 cm)中,每箱放30頭幼參,以鵝卵石和網片為附著基,試驗設對照組,每天投喂1次基礎餌料并添加蔗糖 (基礎餌料的70%),投喂量約為幼參體質量的4%,益生菌組在對照組基礎上,每3 d向水體中添加硝化菌+枯草芽孢桿菌制劑各1.8 g。每組設3個平行,每10 d換水1/3,用氣石充氣。試驗期間,水溫為(15.5±0.34)℃,溶解氧為 (5.2±0.48)mg/L,鹽度為32.1±0.31,pH為7.86±0.14,養(yǎng)殖試驗共進行60 d。

1.2.2 幼參生長指標的測定 分別于養(yǎng)殖0、30、60 d時測定幼參體質量,并計算幼參的特定生長率(SGR):

SGR=(ln Wt-ln W0)/t×100%。

其中:Wt為t時的幼參體質量 (g);W0為初始幼參體質量;t為試驗時間 (d)。

1.2.3 腸道消化酶活力的測定 將幼參分別養(yǎng)殖30 d和60 d時,從每箱中隨機取5頭幼參,饑餓48 h,將腸道內容物排空,解剖取其腸道,用濾紙吸干,稱重后加入9倍體積 (1 g∶9 mL)預冷的生理鹽水,勻漿,于4℃下以6000 r/min離心10 min,取上清液用于消化酶活力的測定。使用南京建成生物工程公司生產的試劑盒測定腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活力。

1.2.4 幼參免疫指標的測定 體腔液的采集與處理以及體腔液上清液和體腔細胞裂解上清液的制備方法同文獻[22]。體腔細胞吞噬活力測定方法見文獻[14]。體腔液上清液和腔細胞裂解上清液溶菌酶活力測定方法依據(jù)文獻[22]。

1.2.5 蛋白含量的測定 腸道上清液、體腔液和體腔細胞裂解上清液中總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法,以小牛血清白蛋白作為標準蛋白[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析和 T檢驗,結果以平均值±標準差 (mean± S.D.)表示,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 各組幼參的生長情況

幼參特定生長率如圖1所示,養(yǎng)殖30、60 d時益生菌組幼參的特定生長率均顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖1 益生菌對幼參特定生長率的影響Fig.1 Effect of probiotics on specific growth rate of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 各組幼參腸道消化酶活力的變化

幼參腸道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活力如表1所示。從表1可知,養(yǎng)殖30、60 d時益生菌組幼參腸道淀粉酶和脂肪酶活力均顯著高于對照組(P＜0.05),但胰蛋白酶活力與對照組無顯著性差異 (P＞0.05)。

2.3 各組幼參免疫指標的變化

幼參體腔細胞吞噬活力、體腔液和體腔細胞裂解液溶菌酶活力如表2所示。從表2可知,養(yǎng)殖30、60 d時益生菌組幼參體腔細胞吞噬活力、體腔液和體腔細胞裂解液溶菌酶活力均顯著高于對照組 (P＜0.05)。

3 討論

3.1 益生菌對幼參生長的影響

本試驗中,在生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中添加枯草芽孢桿菌+硝化菌可顯著促進幼參生長,與李斌等[20]報道的結果類似,即與以蔗糖為碳源產生的生物絮團相比,定期添加復合芽孢桿菌 (枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis+地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis)形成的生物絮團可顯著提高幼參生長。這一結果可能與益生菌或其形成的生物絮團 (益生菌組生物絮團生成量顯著高于對照組)能改善水質 (降低水體中的氨氮和亞硝氮濃度)和增加消化酶活性有關。在對蝦生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中也有類似的研究結果,Souza等[24]報道,在桃紅對蝦Farfantepenaeus brasiliensis零交換好氧異養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng) (以糖蜜為碳源)中,添加商業(yè)益生菌Sanolife Pro-W(枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis+短小芽孢桿 Bacillus pumilus)、Biomin Start-grow(一種芽孢桿菌Bacillus spp.+一種腸球菌Enterococcus spp.+若干種乳酸桿菌Lactobacillus spp.)和Bacillus cereus var.toyoi,可顯著提高對蝦的體質量和特定生長率。在感染副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng) (以糖蜜為碳源)中,水體中添加商業(yè)益生菌AquaStar?Pond(若干種芽孢桿菌+若干種腸球菌+若干種硫桿菌Thiobacillus spp.+若干種副球菌 Paracoccus spp.)和餌料中添加AquaStar?Growout(若干種芽孢桿菌+若干種腸球菌+若干種硫桿菌),可顯著提高仔蝦的生長和存活率[25]。在養(yǎng)殖水體中添加巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium+美麗鹽單胞菌Halomonas venusta+赤砂糖,與只添加赤砂糖的對照組比較,凡納濱對蝦體長和體質量均顯著增加[26]。

表1 益生菌對幼參腸道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活力的影響Tab.1 Effect of probiotics on the intestinal amylase,lipase and trypsin activities in sea cucumber juvenile Apostichopus japonicus

表2 益生菌對幼參體腔細胞吞噬活力、體腔液和體腔細胞裂解液溶菌酶活力的影響Tab.2 Effect of probiotics on the phagocytic activity of coelomocytes and lysozyme activities in coelomic fluid and in coelomocyte lysate supernatant in sea cucumber juvenile Apostichopus japonicas

3.2 益生菌對幼參消化酶活力的影響

適宜濃度的益生菌/生物絮團在水生動物的消化過程中起著有益的作用[11-15,21,27]。 董春光等[12]將不同劑量的枯草芽孢桿菌菌粉添加到幼參養(yǎng)殖水體中,結果顯示,刺參腸道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活力顯著增加。幼參培育水體中添加蔗糖和生物絮團發(fā)酵液 (含芽孢桿菌)可提高其消化道淀粉酶活性[21]。餌料中添加4%生物絮團可顯著提高斑節(jié)對蝦Penaeus monodon幼體肝胰腺消化酶 (淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶)活力[27]。本試驗中,在幼參生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng) (以蔗糖為碳源)水體中添加枯草芽孢桿菌+硝化菌,可使幼參腸道淀粉酶和脂肪酶活力顯著提高,可能是生物絮團中微生物群落影響幼參腸道細菌群落結構所致[28]。

3.3 益生菌對幼參非特異免疫反應的影響

已有研究表明,益生菌/生物絮團可刺激水生動物的非特異性免疫反應[7-12,14,16-17,29-30]。 體腔細胞起著吞噬、誘捕和包裹入侵微生物的作用,構成棘皮動物抵御感染和損傷的第一道防線[31]。Zhang 等[7]和Zhao等[8]報道,在餌料中分別添加內源枯草芽孢桿菌T13和外源枯草芽孢桿菌,可顯著提高幼參體腔細胞的吞噬活力。在凡納濱對蝦水交換系統(tǒng)中,通過添加蔗糖形成的生物絮團能顯著增強其血細胞的吞噬活力[29]。本試驗中,在生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中添加益生菌,可顯著增強幼參體腔細胞吞噬活力。溶菌酶抵抗革蘭氏陽性細菌病原侵入的作用機制,主要是催化其細胞壁中肽聚糖組分N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間β-1,4糖苷鍵的水解[32]。向水體潑灑和拌餌投喂蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus BC-01,可使幼參體腔液溶菌酶活力增加[11]。在餌料中添加濃度為2.5%的生物絮團,凡納濱對蝦血清中溶菌活力顯著增強[30]。本研究中,益生菌可顯著增強幼參體腔液和體腔細胞裂解液中溶菌酶活力。溶菌酶除了可有效抵抗革蘭氏陽性細菌外,還可直接促進吞噬作用,這可能與益生菌增強吞噬作用有關[33]。幼參非特異免疫反應的激活可能是由于生物絮團中大量細菌細胞壁組分的作用[34]。此外,由于所用枯草芽孢桿菌富含硒和多種活性微量元素,所以也不排除這些元素對幼參免疫反應的影響[35]。

在刺參養(yǎng)殖水體中添加商業(yè)用益生菌不易形成優(yōu)勢菌,因此,應進一步研究土著益生菌結合生物絮團技術在刺參苗種培育中的應用。

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Effects of probiotics on growth,digestive enzyme activity,and immune response of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus in a biofloc culture system

ZHANG Cong-yao1,REN Meng1,ZUO Ran-tao1,SUN Pi-hai2, YANG Zhi-ping3,QIAO Yan-bing1,MA Yue-xin1
(1.Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Seafood Seedling Breeding Base,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;3 Dalian Huixin Titanium Equipment Development Company Limited,Dalian 116039,China)

Sea cucumber Apostichopus japonicus with body weight of(10.77 g±0.07 g)were randomly divided into six 20 L sand filtered sea water tanks at a density of 30 individuals per tank,and fed the basal diet(70%basal diet)containing sucrose(control).In the probiotics treatment,however,the sea cucumber was fed the same diet as in the control in the water which was added into a mixture of Bacillus subtilis(1.8 g)plus nitrifiers(1.8 g)in a 3 day interval at feeding rate of about 4%for 60 days to evaluate the effects of commercial probiotics on growth,digestion,and immune response of juvenile sea cucumber in biofloc culture system.Results showed that there was significantly higher specific growth rate in the sea cucumber fed the diet containing probiotics than that in the control during 30 d and 60 d rearing(P＜0.05).The sea cucumber in the probiotics had significantly higher intestinal amylase and lipase activities than those in control did(P＜0.05),without significant differences in trypsin activity between probiotics treatment and the control(P＞0.05).The phagocytic activity of coelomocytes and the lysozyme activity in coelomic fluid and in coelomocyte lysate supernatant were shown to be significantly enhanced in probiotics treatment compared with the control(P＜0.05).The findings revealed that probiotics supplementation improved the growth,digestion and immune response of juvenile sea cucumber in a biofloc culture system.

Apostichopus japonicus;probiotics;biofloc culture system;digestive enzyme;immune response

Q939.9;S968.9

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.012

2095-1388(2017)01-0068-05

2016-10-11

遼寧省教育廳科研項目 (L2014288)

張叢堯 (1960—),男,講師。E-mail:zhangcongyao@dlou.edu.cn

馬悅欣 (1963—),女,教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn