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        響應面優(yōu)化杉木種鱗多酚索氏提取工藝

        2017-03-14 01:46:10張家君呂蒙蒙林思祖
        武夷學院學報 2017年12期
        關鍵詞:球果液料杉木

        李 佳,張 健,張家君,呂蒙蒙,林思祖,陳 宇

        (1.福建農林大學林學院,福建 福州 350002;2.國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心,福建 福州 350002)

        植物多酚(Polyphenols)又稱植物單寧,是一種普遍存在于植物體內的化合物[1]。植物多酚因其與氧自由基結合能力較強,而在植物的防御體系中起到重要作用,是植物抵御外界不利因素,如機械損傷、病蟲害侵害、逆境脅迫等的關鍵次生代謝物質[2-3]。近年來,多酚類物質在植物的抗性生理[4-8]、生長發(fā)育[9-10]以及衰老死亡[11]等方面的功能逐漸形成了一項研究熱點。而植物多酚提取及其產業(yè)化也呈一定規(guī)模,先后有報道從藍莓[12]、茶葉[13-14]、蘋果[15]、葡萄籽皮[16]、柑橘[17]和石榴[18]等植物原料中提取的多酚類物質被應用于飼料加工、食品保鮮和生物制藥等領域。

        杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)hook.]是我國南方的主要用材樹種,其在國內的分布區(qū)遍布南方17個省區(qū),人工用材林面積居用材樹種的首位[19]。目前杉木資源的利用主要以木材為主,其他方面的資源利用研究報道較為少見。近年來,隨著杉木優(yōu)良種子園營建規(guī)模的擴大,每年產生大量采種后遺棄的杉木球果,對這部分資源加以利用,既能實現(xiàn)杉木資源綜合利用,減少資源浪費;又能產生實際經濟效益,提高生產部門效益。因此,開展有關杉木球果良種采收后剩余物再度利用的相關研究工作,是開發(fā)杉木種子園潛在價值、增加杉木非木質利用效率的有效途徑。

        為此,本研究擬以索氏提取法利用杉木種鱗開展多酚提取研究,并以響應面法優(yōu)化其提取工藝,為深度開發(fā)利用杉木球果種鱗資源提供一定的技術支持,同時也為杉木非木質利用提供研究基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本研究供試材料2017年11月收集于福建省三明市尤溪國有林場三代種子園。在種子園球果采收、晾曬、采種之后,收集廢棄的空球果帶回實驗室。 空球果經粉碎機粉碎后過60目篩,粉末4℃冷藏備用。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 沒食子酸標準曲線的建立

        精確吸取 0、1、2、3、4、5mL 的 0.25mg·mL-1的沒食子酸標準液于6個10mL棕色離心管中,用超純水補足至 5mL,搖勻,得濃度為 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·mL-1的標準液。

        分別吸取各濃度沒食子酸標準液0.2 mL于6個10mL棕色離心管中,加入0.4 mL福林酚試劑,充分搖勻,5min后加入2 mL 10% Na2CO3溶液,再分別加入2.4 mL超純水定容至5mL,充分搖勻,50℃水浴1 h后在765 nm波長處分別測得其吸光值。得沒食子酸濃度(X,mg·mL-1)和吸光值(Y)的標準曲線方程 y=2.8026x+0.0633,R2=0.999。

        1.2.2 杉木球果種鱗多酚提取量的計算

        分別精確吸取0.2 mL稀釋適當倍數(shù)的種子提取液于10mL棕色離心管中,加入0.4mL福林酚試劑,充分搖勻,5min后加入2mL 10%Na2CO3溶液,超純水定容至5mL,充分搖勻,50℃水浴1 h后在765 nm波長處測得其吸光值。樣品中的多酚含量以沒食子酸標準品計算,并按方程式計算多酚提取量。

        式中:P 為多酚提取量,mg·g-1;N 為提取液稀釋倍數(shù);A為原液稀釋后測得的吸光值;V為提取液的體積,m2;M 為原料的質量,g。

        1.2.3 單因素試驗

        杉木球果種鱗粉末0.5 g,在不同提取時間(1、2、3、4、5 h)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、乙醇濃度(20% 、40% 、60% 、80% 、100% )和液料比(15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1)來考察各單因素對多酚提取量的影響。

        1.2.4 響應面優(yōu)化試驗設計

        在單因素試驗的基礎上,選擇提取時間,提取溫度,乙醇濃度,液料比為因子,以多酚提取量為響應值,建立四因素三水平的響應面設計試驗,得到二元多項式回歸方程,分析最佳提取工藝,每次試驗重復三次。杉木球果種鱗的Box-Behnken試驗設計因素及水平見表1。

        表1 杉木球果種鱗Box-Behnken試驗因素及水平表Table1 Factors and levels of Box-Behnken test of the bracts of Chinese fir

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析

        所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel 2016,Origin9.1和Design expert10處理、作圖和分析。

        2 結果與分析

        2.1 單因素對杉木球果種鱗多酚提取量影響

        圖1 不同處理對多酚提取量的影響Figure 1 Effects of different treatments on yield of polyphenols

        不同因素對杉木球果種鱗多酚提取影響的單因素分析結果見圖1??梢娞崛r間、提取溫度、乙醇濃度和液料比這4個因素對杉木球果種鱗多酚提取量均有一定影響,4個因素各梯度水平下均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。各因素的最佳水平分別為:提取時間為3 h(多酚提取量27.14 mg·g-1,較最低水平提升了27.53%,圖1A);提取溫度為50℃(多酚提取量27.28 mg·g-1,較最低水平提升了 32.59% ,圖1B);乙醇濃度為60%(多酚提取量28.46 mg·g-1,較最低水平提升了50.86%,圖1C);液料比為35:1(多酚提取量 11.72mg·g-1,較最低水平提升了 69.21% ,圖1D)。

        2.2 Box-Behnken試驗結果與分析

        2.2.1 二次多項式回歸模型建立與分析

        利用Design expert 10軟件進行Box-Behnken試驗,結果見表2。Box-Behnken試驗設計共計29個試驗點,其中24個為分析因點,5個為零點,其中分析因點作為自變量,分別取值于提取時間(A),提取溫度(B),乙醇濃度(C)及液料比(D)中所構成的三維頂點,零點為A、B、C、D的中心點,其中零點重復5次,檢查中點試驗的重復性是否良好,以觀察不可控因素對試驗造成的影響。

        表2 Box-Behnken試驗結果Table 2 Experimental results of Box-Behnken

        將表2的數(shù)據(jù)采用Design expert 10軟件進行二次多項式回歸模型方程擬合,得到多酚提取量預測值(Y)、提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇濃度(C)、液料比(D)的回歸模型方程:

        對該回歸模型進行方差分析,結果見表3。該回歸模型方程具備極顯著性 (P<0.000 1),決定系數(shù)R2=0.935 5,調整后決定系數(shù)Radj2=0.870 9,說明該模型擬合性良好,預測相關系數(shù)Rpred2=0.870 9,模型預測可信度高,失擬性P=0.836 8,差異不顯著,說明該回歸模型方程與實際情況吻合程度高,試驗誤差小,變異系數(shù)C.V=1.04%,即模型置信度較高,具備可重復性。模型中,A、C、B2、C2、D2差異極顯著,B、A2差異顯著,D、AB、AC、AD、BC、BD、CD 差異不顯著,由顯著性和F值可知,杉木球果種鱗多酚提取量的影響因素為乙醇濃度C>提取時間A>提取溫度B>液料比D。

        2.2.2 兩因子間交互作用分析

        圖2 任意兩變量對多酚提取量影響的響應曲面圖Figure 2 Response surface plots for the effects of any two variables on extraction rate of polyphenols

        圖2為響應值和各影響因子構成的立體曲面圖,顯示了分別為任意兩個水平變量為零時,其他兩個水平變量對響應值的影響。提取時間與其他三個因素的交互作用對杉木球果種鱗多酚提取量的影響結果顯示(圖2A、B、C),提取時間在2-4 h之間,多酚提取量略上升后緩慢下降。提取溫度與其他三個因素的交互作用結果顯示(圖2A、D、E),提取溫度在40-60℃之間,多酚提取量先上升后下降,同時響應曲面坡度較陡。乙醇濃度與其他三個因素的交互作用結果顯示(圖2C、D、F),乙醇濃度在 40%-80% 之間,多酚提取量為先上升后下降。液料比與其他三個因素的交互作用結果顯示(圖2C、E、F),液料比在 25-45 之間,多酚提取量為先上升后下降,響應曲面坡度較緩。

        表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 3 Testof significance for regression equation coefficients

        2.3 最佳條件預測及驗證性試驗

        通過建立二次多項式回歸模型,對最佳試驗條件進行了預測,得到最佳提取工藝為:提取時間2.43 h,提取溫度50.84℃,乙醇濃度64.37%,液料比33.78:1,此時多酚提取量理論值為35.45mg·g-1。在此條件下重復6次,實際測定的多酚平均得率為(35.86±1.45)mg·g-1,高于理論值1.16%,表明該模型準確可靠,具備實際使用價值(表4)。為迎合實際生產需要,應在保證提取量的前提下盡量縮短提取時間,降低生產成本,使生產流程更為經濟。因此將提取工藝改良為:提取時間2 h,提取溫度50℃,乙醇濃度60%,液料比35:1。在此條件下重復測定6次,測得多酚平均得率為 (34.30±1.20)mg·g-1,低于最佳工藝值 4.35%,符合實際生產需要。

        表4 驗證性結果Table4 The verification result

        3 討論

        本研究利用Box-Behnken試驗原理,探討索氏提取法從杉木種鱗提取植物多酚的工藝及其優(yōu)化方案。從單因素分析結果來看,提取時間、溫度、乙醇濃度和液料比等因素對多酚提取效果均有影響。通過加大提取時間、溫度、乙醇濃度和液料比,能夠加快提取液中的分子運動速度,增加溶液與溶質的接觸表面積[20],同時有機溶劑和水的復合體系(有機溶劑占50%-70%)能夠對氫鍵產生破壞,削弱疏水鍵[21],有助于杉木種鱗組織內多酚物質溶解,提升多酚提取量。當提取時間、溫度、乙醇濃度和液料比超過一定限度,多酚提取量反而會降低,一方面可能是提取液中的酚類物質由于光,熱,多酚氧化酶等其他因素的影響,發(fā)生氧化,聚合反應[22],降低多酚提取量,另一方面可能是乙醇水溶液(>50%)的沸點在80℃左右[23],過高的溫度使得乙醇大量逸出,同時雜質,色素,脂溶性成分析出較多,這些成分與多酚類化合物形成了競爭關系,使得多酚提取量下降[24]。

        從響應面分析結果來看,各個因素對杉木種鱗多酚提取效果的影響依次為:乙醇濃度>提取時間>提取溫度>液料比。理論最佳提取工藝為:提取時間2.43 h,提取溫度50.84℃,乙醇濃度64.37%,液料比33.78:1,此時多酚提取量理論值為(35.86±1.45)mg·g-1;改良工藝為提取時間2h,提取溫度50℃,乙醇濃度60%,液料比35:1,在此條件下多酚平均得率為 (34.30±1.20)mg·g-1,可以滿足實際生產需求。

        相較于李波等[25]報道的紅松松鱗的植物多酚提取效率(17.76±0.81)mg·g-1,杉木種鱗提取量較高,一方面可能是紅松松鱗多酚提取前處理步驟石油醚脫脂,可能損失了一部分多酚類物質;另一方面可能杉木本身多酚類物質含量要大于紅松松球鱗片中的含量。與杉木種子的多酚含量相比[澀籽(383.220±1.233)mg·g-1;健籽(18.360±0.069)mg·g-1][22],種鱗的多酚含量比健籽高,但是遠低于澀籽,這可能是由于組織特異性造成的,也可能是提取方法的差異。相對于其他種類植物,如獼猴桃果皮28.14 mg GAE/g[26]、石榴皮 (10.63±0.28)mg·g-1[27]、蘋果皮渣 4.53mg·g-1[28]等,杉木球果種鱗多酚類物質含量豐富,具有較大的利用潛力。

        本研究是對杉木種鱗提取植物多酚的初步嘗試,在某些方面還存在一些不足之處,在后續(xù)的研究中,可針對杉木球果種鱗開展不同提取方法的比較,進一步篩選出適合工業(yè)生產的提取方法,為杉木資源綜合利用與產業(yè)化提供理論依據(jù)。

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