李 佳，張 健，張家君，呂蒙蒙，林思祖，陳 宇

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

植物多酚（Polyphenols）又稱植物單寧，是一種普遍存在于植物體內(nèi)的化合物[1]。植物多酚因其與氧自由基結(jié)合能力較強(qiáng)，而在植物的防御體系中起到重要作用，是植物抵御外界不利因素，如機(jī)械損傷、病蟲害侵害、逆境脅迫等的關(guān)鍵次生代謝物質(zhì)[2-3]。近年來，多酚類物質(zhì)在植物的抗性生理[4-8]、生長(zhǎng)發(fā)育[9-10]以及衰老死亡[11]等方面的功能逐漸形成了一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。而植物多酚提取及其產(chǎn)業(yè)化也呈一定規(guī)模，先后有報(bào)道從藍(lán)莓[12]、茶葉[13-14]、蘋果[15]、葡萄籽皮[16]、柑橘[17]和石榴[18]等植物原料中提取的多酚類物質(zhì)被應(yīng)用于飼料加工、食品保鮮和生物制藥等領(lǐng)域。

杉木［Cunninghamia lanceolata(Lamb．)hook.］是我國南方的主要用材樹種，其在國內(nèi)的分布區(qū)遍布南方17個(gè)省區(qū)，人工用材林面積居用材樹種的首位[19]。目前杉木資源的利用主要以木材為主，其他方面的資源利用研究報(bào)道較為少見。近年來，隨著杉木優(yōu)良種子園營建規(guī)模的擴(kuò)大，每年產(chǎn)生大量采種后遺棄的杉木球果，對(duì)這部分資源加以利用，既能實(shí)現(xiàn)杉木資源綜合利用，減少資源浪費(fèi)；又能產(chǎn)生實(shí)際經(jīng)濟(jì)效益，提高生產(chǎn)部門效益。因此，開展有關(guān)杉木球果良種采收后剩余物再度利用的相關(guān)研究工作，是開發(fā)杉木種子園潛在價(jià)值、增加杉木非木質(zhì)利用效率的有效途徑。

為此，本研究擬以索氏提取法利用杉木種鱗開展多酚提取研究，并以響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為深度開發(fā)利用杉木球果種鱗資源提供一定的技術(shù)支持，同時(shí)也為杉木非木質(zhì)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料2017年11月收集于福建省三明市尤溪國有林場(chǎng)三代種子園。在種子園球果采收、晾曬、采種之后，收集廢棄的空球果帶回實(shí)驗(yàn)室。 空球果經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，粉末4℃冷藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確吸取 0、1、2、3、4、5mL 的 0.25mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于6個(gè)10mL棕色離心管中，用超純水補(bǔ)足至 5mL，搖勻，得濃度為 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。

分別吸取各濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0.2 mL于6個(gè)10mL棕色離心管中，加入0.4 mL福林酚試劑，充分搖勻，5min后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，再分別加入2.4 mL超純水定容至5mL，充分搖勻，50℃水浴1 h后在765 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)得其吸光值。得沒食子酸濃度（X，mg·mL-1）和吸光值（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=2.8026x+0.0633，R2=0.999。

1.2.2 杉木球果種鱗多酚提取量的計(jì)算

分別精確吸取0.2 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的種子提取液于10mL棕色離心管中，加入0.4mL福林酚試劑，充分搖勻，5min后加入2mL 10%Na2CO3溶液，超純水定容至5mL，充分搖勻，50℃水浴1 h后在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)得其吸光值。樣品中的多酚含量以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算，并按方程式計(jì)算多酚提取量。

式中：P 為多酚提取量，mg·g-1；N 為提取液稀釋倍數(shù)；A為原液稀釋后測(cè)得的吸光值；V為提取液的體積，m2；M 為原料的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

杉木球果種鱗粉末0.5 g，在不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、乙醇濃度（20% 、40% 、60% 、80% 、100% ）和液料比（15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1）來考察各單因素對(duì)多酚提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間，提取溫度，乙醇濃度，液料比為因子，以多酚提取量為響應(yīng)值，建立四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到二元多項(xiàng)式回歸方程，分析最佳提取工藝，每次試驗(yàn)重復(fù)三次。杉木球果種鱗的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 杉木球果種鱗Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平表Table1 Factors and levels of Box-Behnken test of the bracts of Chinese fir

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel 2016，Origin9.1和Design expert10處理、作圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)杉木球果種鱗多酚提取量影響

圖1 不同處理對(duì)多酚提取量的影響Figure 1 Effects of different treatments on yield of polyphenols

不同因素對(duì)杉木球果種鱗多酚提取影響的單因素分析結(jié)果見圖1。可見提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度和液料比這4個(gè)因素對(duì)杉木球果種鱗多酚提取量均有一定影響，4個(gè)因素各梯度水平下均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。各因素的最佳水平分別為：提取時(shí)間為3 h（多酚提取量27.14 mg·g-1，較最低水平提升了27.53%，圖1A）；提取溫度為50℃（多酚提取量27.28 mg·g-1，較最低水平提升了 32.59% ，圖1B）；乙醇濃度為60%（多酚提取量28.46 mg·g-1，較最低水平提升了50.86%，圖1C）；液料比為35:1（多酚提取量 11.72mg·g-1，較最低水平提升了 69.21% ，圖1D）。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 二次多項(xiàng)式回歸模型建立與分析

利用Design expert 10軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見表2。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)共計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為分析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，其中分析因點(diǎn)作為自變量，分別取值于提取時(shí)間（A），提取溫度（B），乙醇濃度（C）及液料比（D）中所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為A、B、C、D的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)重復(fù)5次，檢查中點(diǎn)試驗(yàn)的重復(fù)性是否良好，以觀察不可控因素對(duì)試驗(yàn)造成的影響。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of Box-Behnken

將表2的數(shù)據(jù)采用Design expert 10軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合，得到多酚提取量預(yù)測(cè)值（Y）、提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、液料比（D）的回歸模型方程：

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。該回歸模型方程具備極顯著性 （P＜0.000 1），決定系數(shù)R2=0.935 5，調(diào)整后決定系數(shù)Radj2=0.870 9，說明該模型擬合性良好，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)Rpred2=0.870 9，模型預(yù)測(cè)可信度高，失擬性P=0.836 8，差異不顯著，說明該回歸模型方程與實(shí)際情況吻合程度高，試驗(yàn)誤差小，變異系數(shù)C.V=1.04%，即模型置信度較高，具備可重復(fù)性。模型中，A、C、B2、C2、D2差異極顯著，B、A2差異顯著，D、AB、AC、AD、BC、BD、CD 差異不顯著，由顯著性和F值可知，杉木球果種鱗多酚提取量的影響因素為乙醇濃度C＞提取時(shí)間A＞提取溫度B＞液料比D。

2.2.2 兩因子間交互作用分析

圖2 任意兩變量對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)曲面圖Figure 2 Response surface plots for the effects of any two variables on extraction rate of polyphenols

圖2為響應(yīng)值和各影響因子構(gòu)成的立體曲面圖，顯示了分別為任意兩個(gè)水平變量為零時(shí)，其他兩個(gè)水平變量對(duì)響應(yīng)值的影響。提取時(shí)間與其他三個(gè)因素的交互作用對(duì)杉木球果種鱗多酚提取量的影響結(jié)果顯示（圖2A、B、C），提取時(shí)間在2-4 h之間，多酚提取量略上升后緩慢下降。提取溫度與其他三個(gè)因素的交互作用結(jié)果顯示（圖2A、D、E），提取溫度在40-60℃之間，多酚提取量先上升后下降，同時(shí)響應(yīng)曲面坡度較陡。乙醇濃度與其他三個(gè)因素的交互作用結(jié)果顯示（圖2C、D、F），乙醇濃度在 40%-80% 之間，多酚提取量為先上升后下降。液料比與其他三個(gè)因素的交互作用結(jié)果顯示（圖2C、E、F），液料比在 25-45 之間，多酚提取量為先上升后下降，響應(yīng)曲面坡度較緩。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Testof significance for regression equation coefficients

2.3 最佳條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過建立二次多項(xiàng)式回歸模型，對(duì)最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，得到最佳提取工藝為：提取時(shí)間2.43 h，提取溫度50.84℃，乙醇濃度64.37%，液料比33.78：1，此時(shí)多酚提取量理論值為35.45mg·g-1。在此條件下重復(fù)6次，實(shí)際測(cè)定的多酚平均得率為（35.86±1.45）mg·g-1，高于理論值1.16%，表明該模型準(zhǔn)確可靠，具備實(shí)際使用價(jià)值（表4）。為迎合實(shí)際生產(chǎn)需要，應(yīng)在保證提取量的前提下盡量縮短提取時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，使生產(chǎn)流程更為經(jīng)濟(jì)。因此將提取工藝改良為：提取時(shí)間2 h，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，液料比35:1。在此條件下重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得多酚平均得率為 （34.30±1.20）mg·g-1，低于最佳工藝值 4.35%，符合實(shí)際生產(chǎn)需要。

表4 驗(yàn)證性結(jié)果Table4 The verification result

3 討論

本研究利用Box-Behnken試驗(yàn)原理，探討索氏提取法從杉木種鱗提取植物多酚的工藝及其優(yōu)化方案。從單因素分析結(jié)果來看，提取時(shí)間、溫度、乙醇濃度和液料比等因素對(duì)多酚提取效果均有影響。通過加大提取時(shí)間、溫度、乙醇濃度和液料比，能夠加快提取液中的分子運(yùn)動(dòng)速度，增加溶液與溶質(zhì)的接觸表面積[20]，同時(shí)有機(jī)溶劑和水的復(fù)合體系（有機(jī)溶劑占50%-70%）能夠?qū)滏I產(chǎn)生破壞，削弱疏水鍵[21]，有助于杉木種鱗組織內(nèi)多酚物質(zhì)溶解，提升多酚提取量。當(dāng)提取時(shí)間、溫度、乙醇濃度和液料比超過一定限度，多酚提取量反而會(huì)降低，一方面可能是提取液中的酚類物質(zhì)由于光，熱，多酚氧化酶等其他因素的影響，發(fā)生氧化，聚合反應(yīng)[22]，降低多酚提取量，另一方面可能是乙醇水溶液（＞50%）的沸點(diǎn)在80℃左右[23]，過高的溫度使得乙醇大量逸出，同時(shí)雜質(zhì)，色素，脂溶性成分析出較多，這些成分與多酚類化合物形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使得多酚提取量下降[24]。

從響應(yīng)面分析結(jié)果來看，各個(gè)因素對(duì)杉木種鱗多酚提取效果的影響依次為：乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度＞液料比。理論最佳提取工藝為：提取時(shí)間2.43 h，提取溫度50.84℃，乙醇濃度64.37%，液料比33.78：1，此時(shí)多酚提取量理論值為（35.86±1.45）mg·g-1；改良工藝為提取時(shí)間2h，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，液料比35:1，在此條件下多酚平均得率為 （34.30±1.20）mg·g-1，可以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。

相較于李波等[25]報(bào)道的紅松松鱗的植物多酚提取效率（17.76±0.81）mg·g-1，杉木種鱗提取量較高，一方面可能是紅松松鱗多酚提取前處理步驟石油醚脫脂，可能損失了一部分多酚類物質(zhì)；另一方面可能杉木本身多酚類物質(zhì)含量要大于紅松松球鱗片中的含量。與杉木種子的多酚含量相比[澀籽（383.220±1.233）mg·g-1；健籽（18.360±0.069）mg·g-1][22]，種鱗的多酚含量比健籽高，但是遠(yuǎn)低于澀籽，這可能是由于組織特異性造成的，也可能是提取方法的差異。相對(duì)于其他種類植物，如獼猴桃果皮28.14 mg GAE/g[26]、石榴皮 （10.63±0.28）mg·g-1[27]、蘋果皮渣 4.53mg·g-1[28]等，杉木球果種鱗多酚類物質(zhì)含量豐富，具有較大的利用潛力。

本研究是對(duì)杉木種鱗提取植物多酚的初步嘗試，在某些方面還存在一些不足之處，在后續(xù)的研究中，可針對(duì)杉木球果種鱗開展不同提取方法的比較，進(jìn)一步篩選出適合工業(yè)生產(chǎn)的提取方法，為杉木資源綜合利用與產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

[1]宋立江,狄瑩,石碧.植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢(shì)[J].化學(xué)進(jìn)展,2000,12(2):161-170.

[2]楊澍，洪閣，劉天軍.植物多酚類物質(zhì)的生物學(xué)活性研究進(jìn)展[A].中藥與天然藥物現(xiàn)代研究學(xué)術(shù)研討會(huì)[C].貴陽：2013.

[3]SCALBERTA,WILLIAMSON G.Dietary intake and bioavailability of polyphenols[J].2000,130(8S):2073S.

[4]PAYRA D,NAITO M,FUJII Y,et al.Hydrophobized plant polyphenols:self-assembly and promising antibacterial,adhesive,and anticorrosion coatings[J].Chemical Communications,2015,52(2):312-315.

[5]ZHANG L,SHAMALADEVIN,PATIL B S,et al.Polyphenol-rich extract of Pimenta dioica berries (Allspice)kills breast cancer cells by autophagy and delays growth of triple negative breast cancer in athymicmice[J].Oncotarget,2015,6(18):16379-16395.

[6]TYAGIT,TREAS JN,MAHALINGAIAH P K,et al.Poten-tiation of growth inhibition and epigenetic modulation by combination of green tea polyphenol and 5-aza-2'-deoxycytidine in human breast cancer cells[J].Breast Cancer Research&Treatment,2015,149(3):655-68.

[7]TSAIh C,LIY C,YOUNGTh,etal.Citruspolyphenol fororal wound healing in oralulcersand periodontaldiseases.[J].Journalof the Formosan MedicalAssociation,2016,115(2):100-107.

[8]SUN Q,WEDICK NM,TWOROGER SS,et al.Urinary Excretion of Select Dietary Polyphenol Metabolites Is Associated with a Lower Risk of Type 2 Diabetes in Proximate but Not Remote Follow-Up in a Prospective Investigation in 2 Cohorts of USWomen[J].Journal of Nutrition,2015,145(6):1280-8.

[9]高智慧,朱治平.杉木種子發(fā)育生理,澀籽成因及降低敗育措施的研究[J].林業(yè)科研究,2000,13(6):659-666.

[10]成小飛.杉木胚胎選擇過程中幾種酶的組織化學(xué)定位[J].植物學(xué)報(bào),1994(s1):65-66.

[11]成小飛.杉木胚胎選擇期的淀粉動(dòng)態(tài)及其種子敗育[J].林業(yè)科學(xué),1995,31(6):481-484.

[12]雷良波，楊浩，陳軍李,等.藍(lán)莓果渣開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].中國釀造,2017(10):17-22

[13]沈新南,陸瑞芳,何更生,等.茶多酚對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的影響[C]//中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議.1996.

[14]王當(dāng)豐,李婷婷,國競(jìng)文,等.茶多酚-溶菌酶復(fù)合保鮮劑對(duì)白鰱魚丸保鮮效果[J].食品科學(xué),2017,38(7):224-229.

[15]LU Y R,FOO L Y.Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace.[J].Food Chemistry,2000,68(1):81-85.

[16]趙競(jìng),景浩.不同品種葡萄皮、籽提取物多酚念量及抗氧化能力的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2009(10):154-158.

[17]KANG H J,Chawla SP,JO C,et al.Studies on the development of functional powder from citrus peel.[J].Bioresource Technology,2006,97(4):614-620.

[18]王周.石榴皮總多酚提取及減脂作用研究[D].成都：西華大學(xué),2016.

[19]楊世先.杉木的栽培技術(shù)[J].中國林業(yè)，2009（17）:50.

[20]曾獻(xiàn),YUAN Y Z，曹清明,等.油茶籽多酚的提取研究[J].食品與機(jī)械,2008,24(4):69-72.

[21]石壁，狄瑩．植物多酚［M］．北京：科學(xué)出版社，2000:30.

[22]林小琴,馬志慧,何宗明,等.杉木種子多酚提取工藝優(yōu)化[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào),2017,37(1):47-53.

[23]冉曉敏,李忠海,付湘晉,等.樟樹多酚提取工藝的研究[J].食品與機(jī)械,2011,27(2):51-54.

[24]耿中華,秦衛(wèi)東,馬利華,等.梨皮多酚的提取工藝優(yōu)化的研究[J].食品工業(yè)科技,2009(12):233-234.

[25]李波,包怡紅,王振宇.紅松松球鱗片多酚提取工藝的優(yōu)化[J].食品與機(jī)械,2012,28(5):111-115.

[26]郭彩霞,任曉婷,張生萬,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取獼猴桃果皮多酚工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2017,38(11).

[27]張艷霞,朱彩平,鄧紅,等.超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(12):150-156.

[28]李珍,哈益明,李安,等.響應(yīng)面優(yōu)化蘋果皮渣多酚超聲提取工藝研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(21):4569-4577.