倪文麗 王寶俊 田 甜 張 繼 馬 樂 王琳琳＊ 任愛國

1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京大學(xué)生育健康研究所，衛(wèi)生部生育健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（100191）；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院

已婚夫婦中不孕不育癥患病率約為15%［1］。在不孕不育癥病因中，至少50%與男性因素有關(guān)［2］。男性不育的病因和機(jī)制十分復(fù)雜，個(gè)體差異較大，臨床上絕大多數(shù)男性不育的病因尚不清楚。長期以來，精液常規(guī)分析是評價(jià)男性生育力的主要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷造成的精子結(jié)構(gòu)和功能的改變可對精子質(zhì)量產(chǎn)生影響［3］。以往研究多探討精子DNA氧化損傷與精液參數(shù)關(guān)聯(lián)性，提示DNA氧化損傷可降低精液質(zhì)量［4－6］，但目前國內(nèi)尚未見蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自于2014年12月－2015年8月期間因不育就診北京婦產(chǎn)醫(yī)院的男性。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦婚后同居1年以上未用避孕措施而未能使妻子受孕或生育，年齡21～49歲的成年男性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①性功能障礙（如勃起功能障礙、射精功能障礙）；②有泌尿生殖系統(tǒng)疾病史（雙側(cè)隱睪、輸精管切除）；③現(xiàn)有急性泌尿生殖系統(tǒng)感染；④有生育能力異常家族遺傳??；⑤曾經(jīng)或正在接受激素治療；⑥已明確診斷不孕不育原因?yàn)榕揭蛩厮?。篩查119例，由于部分樣本采集不全，共納入96名研究對象。由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員采用結(jié)構(gòu)式調(diào)查表，對研究對象進(jìn)行面對面詢問調(diào)查。問卷調(diào)查信息包括年齡、文化程度、身高、體重、吸煙情況、飲酒情況等。本研究已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象已全部簽署知情同意書。

1.2 精液樣本的采集

受試者按照要求禁欲2～7d后，在醫(yī)院通過手淫法留取全部精液。采集后的精液樣本置于37℃水浴箱中，觀察其液化情況，待精液液化后，記錄液化時(shí)間，充分混勻后隨即對精液進(jìn)行常規(guī)分析。將剩余精液進(jìn)行4℃3000g離心15min后，取上清（精漿），－20℃冷凍保存。

1.3 精液常規(guī)分析

嚴(yán)格執(zhí)行WHO《人類精液和精子－宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》（第五版）操作要求，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（北京偉力公司W(wǎng)LJY9000）進(jìn)行精液常規(guī)分析。各指標(biāo)正常參考范圍為：精子濃度≥15×106／ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率≥32%，畸形精子率＜4%。分別根據(jù)各精液指標(biāo)是否在正常范圍內(nèi)，將研究對象分為正常組和異常組，再對氧化損傷指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.4 蛋白質(zhì)及脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)的檢測

蛋白質(zhì)氧化損傷程度以羰基衍生物（PC）水平表示，脂質(zhì)氧化損傷程度以8－異前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）水平表示。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測精漿中 PC水平、8－iso－PGF2α水平。ELISA試劑盒來自于Cell Biolabs公司，試劑盒貨號分別為STA－310、STA－337。所有檢測方法均嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行各組PC水平、8－iso－PGF2α水平比較。計(jì)數(shù)資料以%表示，使用χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行各組一般人口學(xué)特征比較。使用Pearson檢驗(yàn)分析PC、8－iso－PGF2α與各精液參數(shù)的相關(guān)性。使用多重線性回歸控制年齡、文化程度、BMI、吸煙、飲酒等混雜因素后，分析8－iso－PGF2α對精子濃度影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般特征

96名研究對象年齡為（31.2±5.1）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（26.4±5.0）kg／m2。各精液指標(biāo)正常組和異常組的人口學(xué)特征無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.2 各組蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)比較

異常組8－iso－PGF2α水平高于正常組（P＜0.05），其它各指標(biāo)比較兩組無差異（P＞0.05）。見表2。

表1 各精液指標(biāo)正常組和異常組人口學(xué)特征比較［例（%）］

表2 兩組氧化損傷指標(biāo)檢測比較（珚x±s）

2.3 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化指標(biāo)與精液參數(shù)相關(guān)性分析

使用Pearson相關(guān)分析，在控制了年齡、BMI、文化程度、吸煙、飲酒等因素后，8－iso－PGF2α水平與精子濃度負(fù)相關(guān)（r＝－0.254，P＝0.018），與前向運(yùn)動(dòng)精子率及畸形精子率無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)；PC水平與各精液參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。見表3。

2.4 8－iso－PGF2α水平和精子濃度多重線性回歸分析

對以上相關(guān)分析中P＜0.05的變量進(jìn)一步行多重線性回歸分析。以精子濃度為因變量，以8－iso－PGF2α水平、年齡、文化程度、BMI、吸煙及飲酒為自變量，進(jìn)行多重線性回歸分析。變量篩選方法為Enter法。在調(diào)整了年齡、BMI、文化程度、吸煙、飲酒后結(jié)果顯示，8－iso－PGF2α水平每增加1ng／ml，精子濃度平均減少7×104個(gè)／ml（P＜0.05）。

表3 精液參數(shù)與氧化損傷指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

本研究在96例研究對象中探討了蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)精子濃度的降低可能與脂質(zhì)氧化損傷有關(guān)。提示對少精子癥及無精子癥患者進(jìn)行脂質(zhì)氧化損傷檢測可能有助于發(fā)現(xiàn)其致病原因。

本研究發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α在精子濃度異常組的水平高于正常組，隨著8－iso－PGF2α水平的增加，精子濃度降低，結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道類似，Khosrow－beygi等［7］在來自伊朗的46例精液參數(shù)異常者和16例健康者中，發(fā)現(xiàn)精液參數(shù)異常者8－iso－PGF2α水平高于健康者，8－iso－PGF2α水平與精子濃度、總運(yùn)動(dòng)精子率負(fù)相關(guān)。本研究與上述研究結(jié)果類似，相關(guān)系數(shù)都不高，可能由于樣本量少或一些混雜因素的影響。本研究在96例研究對象中未發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α與前向運(yùn)動(dòng)精子率及畸形精子率有相關(guān)性，文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)此類研究報(bào)道，而多以丙二醛作為脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)的研究，如Singh等［8］研究來自印度的48例精液參數(shù)正常不育者和100例精液參數(shù)異常不育者中，發(fā)現(xiàn)精液參數(shù)異常組丙二醛水平高于正常組，精漿中丙二醛水平與精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子率、精子正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)。Ni等［9］研究來自中國的88例精索靜脈曲張不育者和25例健康者中，發(fā)現(xiàn)丙二醛與精子濃度、總運(yùn)動(dòng)精子率、前向運(yùn)動(dòng)精子率負(fù)相關(guān)，但與畸形精子率無相關(guān)性。8－iso－PGF2α是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的特異性產(chǎn)物，不受飲食中脂質(zhì)含量影響，具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，目前被認(rèn)為是反映脂質(zhì)過氧化損傷的最好指標(biāo)［10］。

本研究未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化損傷與精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子率、畸形精子率的相關(guān)性。目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中相關(guān)報(bào)道。后續(xù)研究中需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性。

PC、8－iso－PGF2α目前是評價(jià)蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷使用最多的指標(biāo)［10－11］。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)硫醇基過氧化，會使精子的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使精子更容易受到損傷。蛋白質(zhì)氧化損傷還影響蛋白的磷酸化、糖基化及ATP的生成，從而關(guān)聯(lián)到精子的授精能力［3，12］。精子膜中含有大量的不飽和脂肪酸，極易發(fā)生脂質(zhì)氧化損傷，造成精子膜的流動(dòng)性、通透性和液態(tài)性發(fā)生改變，引起精子的完整性、運(yùn)動(dòng)性和功能等發(fā)生不可逆的損傷［3，12］，進(jìn)而可能導(dǎo)致精子濃度的降低。

現(xiàn)階段評估男性生育能力的手段主要是傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析。但常規(guī)精液參數(shù)分析只是從形態(tài)和數(shù)量方面進(jìn)行分析，而對精子功能和受精能力方面提供的信息有限，不能對男性不育的原因提供精確的診斷［4］。Agarwal等［13］研究建議對于不明原因的不育癥患者可進(jìn)行活性氧的檢測，對男性生育力進(jìn)行一定程度的評價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α在精子濃度異常組的水平高于正常組，提示對于少精子癥及無精子癥患者，進(jìn)行脂質(zhì)氧化損傷檢測可能有助于發(fā)現(xiàn)其致病因素，為臨床診斷和開展新的治療策略提供幫助。

本研究初步探討了脂質(zhì)氧化損傷、蛋白質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的關(guān)系，提示脂質(zhì)氧化損傷可能與精子濃度降低有關(guān)。后續(xù)研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證生物大分子氧化損傷對男性生育力的影響，并進(jìn)行機(jī)制的深入探討。

［1］ Esteves SC，Hamada A，Kondray V，et al.What every gynecologist should know about male infertility：an update［J］.Ar chives of Gynecology and Obstetrics，2012，286（1）：217－229.

［2］ Jarow JP，Sharlip IRAD，Belker AM，et al.Best practice policies for maleinfertility［J］.The Journal of Urology，2002，167（5）：2138－2144

［3］ 孫忠凱，郭凱敏，田潤輝.精子氧化損傷機(jī)制和防護(hù)研究的新進(jìn)展［J］.中國男科學(xué)雜志，2014，28（9）：65－67.

［4］ 曾蘭，葉飛，李運(yùn)星，等.精子DNA完整性與精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析［J］.中國計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科，2014，6（4）：47－50.

［5］ 劉太秀，崔志鴻，曹佳.重慶市大學(xué)生精液常規(guī)參數(shù)與精子DNA損傷的關(guān)聯(lián)性分析［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（11）：1325－1330.

［6］ Hosen MB，Islam MR，Begum F，et al.Oxidative stress induced sperm DNA damage，apossible reason for male infertility［J］.Iran J Reprod Med，2015，13（9）：525－532.

［7］ Khosrowbeygi Ali，ZarghamiNosratollah.Levels of oxidative stress biomarkers in seminal plasma and their relationship with seminal parameters［J］.BMC Clinical Pathology，2007，7（1）：1－6.

［8］ Singh R，Choudhari AR，Dhawan A，et al.Role of ascorbicacid in human seminal plasma against the oxidative damage to the sperms［J］.Indian J ClinBiochem，2009，24（3）：312－315.

［9］ Ni K，Steger K，Yang H，et al.A comprehensive investigation of sperm DNA damage and oxidative stress injury in infertile patients with subclinical，normozoospermic，and astheno／oligozoospermic clinical varicocoele［J］.Andrology，2016，4（5）：816－824.

［10］ Fam SS，Morrow JD.The isoprostanes：unique products of arachidonic acid oxidation－a review［J］.Curr Med Chem，2003，10（17）：1723－1740.

［11］ Dalle Donne I，Aldini G，Carini M，et al.Protein carbonylation，cellular dysfunction，and disease progression［J］.J Cell Mol Med，2006，10（2）：389－406.

［12］ 郭穎，辛玲，于和鳴.精子氧化損傷及抗氧化劑的研究［J］.國際生殖健康／計(jì)劃生育雜志，2012，31（16）：475－478.

［13］ Agarwal A，Sharma R，Nallella K，et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility［J］.Fertility and Sterility，2006，86（4）：878－885.