王靜靜 姚婭婷 李 闊 鄭 永 張 田 王敏康

云南省生物質能與環(huán)境生物技術重點實驗室，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南師范大學生命科學學院（昆明，650500）

以往的研究發(fā)現(xiàn)蕓豆植物凝集素（KBL）具有凝集精子、抑制受精、抗著床和終止妊娠的作用［1－6］，同時具有良好的抗人類免疫缺陷病毒（HIV）的性能［7－8］，KBL有望成為一種新型的局部使用的殺微生物劑。從潤滑和預防的角度看，凝膠劑劑型是最適宜陰道及肛門使用的：一是潤滑作用，可有效減少摩擦的阻力和可能對黏膜造成的損傷；二是附著和覆蓋作用，即具有一定隔離和保護陰道或直腸黏膜上皮細胞的作用；三是凝集素可以和HIV外殼的GP120蛋白結合，發(fā)揮抑制劑的作用。在避孕方面，KBL可通過直接接觸精子發(fā)揮制動、殺精或凝集精子的作用而達到避孕的目的。但以往的實驗是直接使用不同濃度的植物凝集素溶液進行實驗研究，而未使用凝集素制劑。本實驗研究包含兩部分內(nèi)容：一是觀察不同濃度紅蕓豆植物凝集素（RKBL）的殺精和凝集精子的效果；二是觀察含不同濃度RKBL特別是低濃度的凝膠劑在模擬陰道穹隆結構的“V”型玻璃管中對精子穿透的阻礙作用。為凝膠劑配方篩選和藥效學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料的制備

1.1.1 RKBL凝膠劑RKBL由本實驗室從紅蕓豆中提取。采用雙縮脲法測定其蛋白質含量。主要輔料為0.8%的藥用級凝膠劑基質—黃原膠，用其配制成RKBL濃度為5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001mg／ml的凝膠劑。

1.1.2 精液采用人及犬精子進行實驗。人精子為健康人手淫法收集，懸浮于無電解質溶液（EF溶液）［9］，4℃保存，1h內(nèi)使用。犬精子為人工采精，同上述方法保存和使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 精子凝集實驗根據(jù) Sander－Cramer方法［9］，取100μl精液分別與500μl的含有5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001 mg／ml的RKBL溶液混合，迅速吹打均勻后，在20s內(nèi)各自取出5μl，在顯微鏡（100×）下觀察，5min后再次觀察。若5min后100%的活動精子被凝集，為最終結果，否則在此后每20min觀察1次，持續(xù)觀察3h。實驗重復15次。

1.2.2 “V”型管穿透試驗取外徑1.24mm，內(nèi)徑1.00mm，長30mm的玻璃管若干，用酒精燈加熱中部至微紅，彎曲玻璃管成90°，制成兩臂等長的V型管。取用13只V型管，分別在其底部加入10μl RKBL濃度分別為5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001mg／ml的 RKBL凝膠劑及不含RKBL的0.8%的黃原膠，然后在各V型管的兩側管內(nèi)加入在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中預平衡1～2h的人輸卵管培養(yǎng)液（HTF）各35μl，最后取5μl的精液分別加入到每支V型管一側的HTF底部。置于CO2培養(yǎng)箱中，15min后取出觀察，之后每隔30min取出觀察，持續(xù)至3h。實驗重復8次。

1.3 判定方法

1.3.1 制動、致死不同濃度RKBL使精子致死及凝集情況。

1.3.2 凝集顯微鏡（100×）下觀察精子凝集及其程度。即精子以頭對頭，尾對尾以及頭對尾的混合型彼此粘連在一起，凝集的精子有一定的活動能力，表現(xiàn)為尾部可以擺動，凝塊間未凝集的精子能緩慢向前游動。分為四級［10］：一級（＋）為輕度凝集，指每個凝塊中＜10條精子；二級（＋＋）為中度凝集，指每個凝塊有10～15條精子；三級（＋＋＋）為大片凝集，指每個凝塊有≥50條精子；四級為所有精子凝集，即所有精子彼此相互連接。

1.3.3 “V”型管穿透于顯微鏡下觀察精子穿透凝膠劑的情況，從V型管一側穿越凝膠劑到達V型管另一側為穿透成功。

2 結果

2.1 殺精和凝集實驗

濃度為5，2.5，1mg／ml的RKBL凝膠劑在20s內(nèi)均能使精子失活，即RKBL濃度≥1mg／ml時，會使精子在20s內(nèi)失去活動能力，產(chǎn)生制動和致死效應，但不產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。而濃度為0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01mg／ml的 RKBL凝膠劑均能使精子產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。持續(xù)且3h以上直到實驗結束時仍然保持凝集狀態(tài)。見表1。總之，實驗結果表明：RKBL濃度為0.025mg／ml時，精子凝集＞50%，但不致死，表現(xiàn)為尾部可以擺動，并能持續(xù)3～4h；濃度0.01mg／ml時，精子部分凝集，且凝集不足50%；0.005mg／ml及其以下濃度的RKBL均不能使精子凝集，表現(xiàn)為精子以較快的速度向前運動，但精子的活動分級受一定影響，其向前運動速度不及其在HTF中的運動速度快。

2.2 “V”型管穿透試驗

在 V型管中，RKBL濃度為5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025和 0.001mg／ml的RKBL凝膠劑及不含RKBL的0.8%的黃原膠均能阻止精子穿透。當凝膠劑中RKBL濃度≥1mg／ml時，精子不僅不能穿透凝膠劑，而且會在凝膠劑附近完全失去活動能力；當RKBL濃度＜1mg／ml時，精子具有一定的活動能力，表現(xiàn)為能擺動但不能穿透凝膠劑。見圖1。

表1 不同濃度RKBL凝膠各時間點精子凝集程度

圖1 精子在有RKBL凝膠的“V”型管中的穿透實驗

3 討論

本實驗證明：RKBL 濃度 為 5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025 及0.001mg／ml的RKBL凝膠劑不僅能有效阻止精子穿透凝膠劑、改變精子運動狀態(tài)和促使精子凝集，且RKBL濃度≥1mg／ml的凝膠劑能在20s內(nèi)制動并殺死全部精子，即體外殺精的最低濃度為1mg／ml。此外，關于精子凝集與受精能力方面，WHO的《人類精液檢查與實驗室處理》（第五版）指出，當50%或更多的活動精子被粘附時，精子宮頸黏液穿透能力和體外受精率受影響，該手冊以50%活動精子被粘附（凝集）作為閾值，即當有50%或更多的活動精子被粘附時即可診斷為免疫性不育［10］。筆者認為，RKBL處理精子后的凝集情況與此類似，因此凝集精子的比例也可以作為受精率的判斷標準。本實驗結果顯示，即使 RKBL的濃度降至0.025mg／ml時，精子凝集仍超過50%。這樣使得RKBL凝膠劑有較高的避孕有效系數(shù)。狹義的殺精子劑應該包括用Sander－Cramer方法試驗可有效殺滅精子的制劑，除此之外，還應該包括可促進精子凝集而使之失去受精作用的制劑，即廣義的殺精子劑。另外，本實驗結果表明，配制RKBL凝膠劑的凝膠劑基質本身也可阻止精子穿透，因此可與RKBL形成良好的協(xié)同作用。也就是高濃度的RKBL凝膠液具有殺精作用，中低濃度具有凝集精子的作用，以及凝膠基質本身具有物理屏障、緩釋和覆蓋作用。

外用殺精劑是在陰道局部發(fā)揮其殺精作用的非激素類避孕藥物，使用方便，對機體的干擾較小，為人們所樂于接受［11］。多年來，國內(nèi)外使用最多的外用避孕藥為壬苯醇醚（N－9），是目前使用最普遍的一種外用殺精子藥［12］。人們曾寄希望N－9用于預防性傳播疾病包括預防HIV的傳播。但2001年，相關研究已明確，N－9非但不能預防HIV經(jīng)陰道傳播，反而增加了 HIV的感染率［1－2］。2007年12月，美國FDA要求生產(chǎn)商在說明書上添加警告，指明該產(chǎn)品無法預防性傳播疾?。òò滩。?，并且有可能增加感染艾滋病的危險［13］。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署（UNAIDS）和WHO提出，迫切需要研發(fā)新的多功能預防技術來保護女性生殖健康。研制兼具避孕和預防AIDS／STDs雙功能的外用避孕藥物已成為發(fā)展趨勢和研究熱點［14］。在性傳播已成為HIV感染和傳播的主要途徑的今天，研究用于預防包括HIV感染和性傳播疾病的陰道和直腸用殺微生物劑具有迫切的需要。相關的研究結果也不斷證明KBL在防治HIV及其它病毒性疾病方面的有效性［15－17］。

前期研究證明長期使用2.5mg／ml濃度的RKBL凝膠劑對小鼠陰道上皮細胞無刺激，不會引起陰道細胞破損等不良反應［18］。涂喜慶等［19］實驗證明5mg／ml濃度的RKBL制劑對婦女陰道無刺激，不會產(chǎn)生任何不適感。本研究結果看，RKBL凝膠劑中的RKBL濃度在0.025mg／ml時，精子凝集超過50%，也就是說，RKBL凝膠劑在稀釋200倍時仍然可以起到有效的避孕作用。眾所周知，在實際使用中，凝膠劑進入人體后，由于性行為和體液稀釋等因素，濃度可能會發(fā)生很大的變化，而RKBL凝膠劑在稀釋200倍時仍然有效，表明RKBL凝膠劑具有很高的安全系數(shù)和避孕的可靠性。同時，RKBL還可以促進女性陰道內(nèi)的乳酸桿菌增值，從而恢復和保持女性正常陰道菌群生態(tài)。乳酸菌可以防止病原體的入侵，包括導致性傳播疾病的艾滋病毒在內(nèi)［20］。RKBL的濃度為1mg／ml時，能明顯促進乳酸桿菌的生長，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應依賴性的關系［21］。雖然精子凝集不能完全被證明為不孕的免疫性原因，但是精子凝集能夠影響精子的活力程度，而精子活力程度與妊娠有著密切關系［10］。所以含RKBL的凝膠劑作為一種殺精子劑是可行的，具有較好應用前景。

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