劉俊 王清清 曹浩強 張浩

長期索拉菲尼暴露促進Huh7 肝癌細胞上皮間質變的實驗研究

劉俊 王清清 曹浩強 張浩

目的探討索拉菲尼耐藥肝癌細胞發(fā)生上皮間質變(EMT)及侵襲、轉移能力增強的機制。方法通過藥物連續(xù)誘導人肝癌細胞株Huh7建立索拉菲尼耐藥肝癌細胞株Huh7R，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化；CCK-8細胞增殖試驗檢測Huh7R細胞增殖能力；熒光定量PCR檢測ABC家族耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2及EMT相關調控鋅指蛋白轉錄因子Snail、Slug基因表達水平；Western blot檢測耐藥蛋白ABCG2，EMT標記分子E-cadherin、Vimentin及N-cadherin，轉錄因子Snail、Slug蛋白表達水平；Transwell小室侵襲試驗檢測Huh7R細胞遷移、侵襲能力。結果Huh7R細胞呈細長形，伴纖維狀突起，形態(tài)學上符合EMT改變；CCK-8細胞增殖試驗顯示在索拉菲尼作用下，Huh7R細胞生存率高于Huh7細胞；熒光定量PCR結果顯示，Huh7R細胞ABCB1、ABCC1、ABCG2及Snail、Slug基因表達水平均高于Huh7細胞（均P＜0.05）；Western blot顯示，Huh7R細胞上皮標記蛋白E-cadherin表達水平低于Huh7細胞（P＜0.05），而間質標記蛋白Vimenti、N-cadherin及Snail、Slug蛋白表達水平均高于Huh7細胞（均P＜0.05）；Transwell小室侵襲試驗顯示Huh7R細胞遷移、侵襲能力均較Huh7細胞增強。結論長期低劑量索拉菲尼暴露會促進肝癌細胞Snail和Slug表達，誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲、轉移能力。

肝癌 索拉菲尼 轉錄因子 上皮間質變 耐藥

索拉菲尼是目前唯一有效且被美國FDA批準用于中晚期肝癌治療的分子靶向藥物[1]。研究表明，長期低劑量索拉菲尼暴露造成的繼發(fā)性耐藥會增強肝癌細胞遷移、侵襲能力。ABC家族耐藥基因與肝癌繼發(fā)性耐藥相關，ABCG2、ABCB1和ABCC1基因屬其家族成員，編碼的蛋白可參與肝癌細胞內靶向藥物的分布，改變藥物的作用靶點，促進藥物外排。上皮間質變（EMT）是指上皮細胞獲得間充質、成纖維樣特征，細胞間的黏附能力降低，細胞的運動性能增強。EMT被認為是肝癌細胞發(fā)生索拉菲尼耐藥及遷移、侵襲能力增強的主要原因[2]。Snail、Slug基因屬于鋅指蛋白轉錄因子Snail基因家族成員，參與調控EMT。目前索拉菲尼耐藥肝癌細胞發(fā)生EMT的機制尚不明確?；诖?，本研究運用實驗室研究方法探討索拉菲尼耐藥肝癌細胞發(fā)生EMT及遷移、侵襲能力增強的機制，以期為肝癌的靶向治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料甲苯磺酸索拉菲尼片購自德國Bayer公司；Huh7人肝癌細胞株購自中國科學院細胞庫；FBS、胰酶購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；DMSO購自美國Sigma公司；用于熒光定量PCR的逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）購自日本Takara公司；細胞增殖檢測試劑（cell counting kit-8,CCK-8）購自日本同仁化學研究所；用于Western blot試驗抗體（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ABCG2及GAPDH）均購自美國Cell Signaling Technology公司；用于Transwell侵襲實驗的小室購自美國Corning公司；PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 配制索拉菲尼藥液將甲苯磺酸索拉菲尼1片（200mg）溶于15.7ml無菌DMSO中，配制成濃度為2× 104mol/L的索拉菲尼貯藏液,分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)將Huh7置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞生長，密度達到70%～80%時進行胰酶消化傳代，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 建立索拉菲尼耐藥肝癌細胞株（sorafenib resistant Huh7 cells,Huh7R）采用索拉菲尼連續(xù)誘導、逐步增加藥物濃度的方法篩選耐藥細胞株。取對數生長期細胞接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，起始藥物濃度為2μmol/L，低濃度持續(xù)誘導1～2個月，繼續(xù)增加索拉菲尼藥物濃度至最大耐受濃度，總誘導周期為6個月，獲得Huh7R。

1.2.4 CCK-8細胞增殖試驗檢測細胞增殖能力調制8種不同濃度索拉菲尼藥液（0、1、2、4、6、8、10、12μmol/L），Huh7、Huh7R各設實驗組（不同濃度索拉菲尼+細胞+DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）、對照組（細胞+DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）和空白組（DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）。取生長良好的對數生長期細胞按每孔5×103個/100μl的細胞密度接種于96孔板培養(yǎng)，孵育過夜，除去舊培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度索拉菲尼含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液，孵育48h；按1∶10體積比例配制CCK-8試劑和DMEM培養(yǎng)液，每孔加入100μl，孵育1h，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（A）值，記錄結果；計算在索拉菲尼作用后的細胞生存率[細胞生存率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）]，并計算出其半數抑制濃度IC50值。

1.2.5 熒光定量PCR檢測ABC家族耐藥基因及Snail、Slug基因表達水平Huh7R細胞于提取前予以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，Huh7、Huh7R各加入Trizol抽提細胞總RNA；紫外分光光度計檢測RNA純度和質量；根據逆轉錄試劑盒的操作說明將1 000ng RNA逆轉錄成cDNA。然后將cDNA模板經PCR擴增儀進行擴增，引物序列見表1，PCR擴增條件：94℃預變性3min；接著進行40個循環(huán)，包括95℃變性5s，60℃退火3s，72℃延伸10s后進行熒光檢測，分析熔解曲線和擴增曲線。用2-ΔΔCt方法對Huh7、Huh7R細胞基因表達差異進行分析。實驗重復3次，取平均值。

表1 各基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測EMT標記蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）、轉錄因子蛋白（Snail和Slug蛋白）及耐藥蛋白（ABCG2蛋白）表達水平Huh7R于提取前予以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，配制蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的混合液，加入待檢測細胞并于冰上放置30min，12 000r/min 4℃條件下離心15min，取其上清液，蛋白定量；加入5× SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，-20℃保存?zhèn)溆?；每孔加?0～30μl目的蛋白樣品，將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）在60V電壓下電泳，然后在300 mA電流下濕轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗15min×3次，加入對應的二抗室溫孵育1h，PBST漂洗15min×3次，加入ECL發(fā)光劑后顯影拍照，以與GAPDH的灰度值代表蛋白表達水平。實驗重復3次，取平均值。

1.2.7 Transwell小室侵襲試驗檢測細胞遷移、侵襲能力取對數生長期的Huh7、Huh7R細胞消化離心后加入無血清DMEM培養(yǎng)液吹打均勻，取5×104個/100μl細胞加入小室上層，下層加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液；孵育48h，4%多聚甲醛固定細胞15min，0.1%結晶紫染色2h，用棉簽拭去上室細胞；100倍顯微鏡下隨機計數5個視野取平均值。侵襲試驗是將50mg/L的Matrigel膠4℃融化，用無血清DMEM培養(yǎng)液將其1∶8稀釋混勻，取100 μl放于小室上層，其余步驟和遷移實驗一樣。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 Huh7、Huh7R細胞形態(tài)學比較見圖1。

圖1 Huh7、Huh7R細胞形態(tài)學比較（×100）

由圖1可見，Huh7細胞是分化較好的人源性上皮來源肝癌細胞，表現(xiàn)為上皮細胞樣形態(tài)，呈現(xiàn)多邊形簇集生長；Huh7R細胞則呈細長形，伴纖維狀突起，形態(tài)學上改變符合EMT改變。

2.2 索拉菲尼作用下Huh7、Huh7R細胞生存率比較見圖2。

圖2 Huh7與Huh7R細胞生存率比較

由圖2可見，隨著索拉菲尼藥物濃度的升高，Huh7、Huh7R細胞生存率均呈下降趨勢。除1μmol/L索拉菲尼作用濃度外，在2、4、6、8、10、12μmol/L作用濃度時，Huh7R細胞生存率均明顯高于Huh7細胞（均P＜0.05），同時可以觀察到Huh7R細胞的IC50（6.38μmol/L）明顯高于Huh7細胞（3.71μmol/L）。

2.3 Huh7、Huh7R細胞ABC家族耐藥基因表達水平及ABCG2蛋白表達水平比較見表2、圖3、表3。

表2 Huh7、Huh7R細胞ABC家族耐藥基因表達水平比較

圖3 Huh7、Huh7R細胞ABCG2蛋白表達條帶圖比較

表3 Huh7、Huh7R細胞ABCG2蛋白表達水平比較

由表2可見，Huh7R細胞ABCB1、ABCC1、ABCG2基因表達水平均高于Huh7細胞（均P＜0.05）。由圖3、表3可見，Huh7R細胞ABCG2蛋白表達水平高于Huh7細胞（P＜0.05）。2.4Huh7、Huh7R細胞EMT標記蛋白及Snail、Slug蛋白表達水平比較見圖4、表4。

圖4 Huh7、Huh7R細胞EMT標記蛋白及Snail、Slug蛋白表達條帶圖比較

表4 Huh7、Huh7R細胞EMT標記蛋白及Snail、Slug蛋白表達水平比較

由圖4、表4可見，Huh7R細胞上皮標記蛋白E-cadherin表達水平低于Huh7細胞（P＜0.05），而間質標記蛋白N-cadherin、Vimentin表達水平均高于Huh7細胞（均P＜0.05）。同時，Huh7R細胞Snail、Slug蛋白表達水平均高于Huh7細胞（均P＜0.05）。

2.5 Huh7、Huh7R細胞遷移、侵襲能力比較見圖5。

由圖5可見，Huh7R細胞黏附于下室面的細胞數量明顯多于Huh7細胞，表現(xiàn)出更高的遷移、侵襲能力。

3 討論

圖5 Huh7、Huh7R細胞遷移、侵襲能力比較（結晶紫染色，×100）

肝癌是國人最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第6位，病死率居第3位[3]。手術雖然是肝癌治療的最有效方法，但由于肝癌惡性程度高，且大多患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，喪失了手術治療機會。索拉菲尼是目前唯一對于無法手術治療的中晚期肝癌有效的治療藥物。研究指出，對于肝功能Child A級患者，索拉菲尼治療組較安慰劑治療組平均延長約3個月生存期[4-6]，這一治療效果給本已陷入無藥可用、無計可施的中晚期肝癌患者帶來重大希望。但也有研究顯示，長期低劑量索拉菲尼暴露會促進肝癌細胞發(fā)生索拉菲尼耐藥[7-8]。本研究結果顯示，長期低劑量索拉菲尼暴露促進肝癌細胞Snail、Slug表達，從而誘導肝癌細胞發(fā)生EMT，耐藥性增加，侵襲、轉移能力增強。

EMT是指上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向成纖維細胞或間充質細胞表型的轉變并獲得遷移的能力。在EMT過程中，上皮細胞標記蛋白E-cadherin表達水平下降，間質細胞標記蛋白N-cadherin表達水平升高，從而使具有極性的上皮表型細胞發(fā)生細胞骨架重塑，上皮細胞失去它們的上皮特性，獲得更多的遷移間質細胞樣特性。腫瘤侵襲性取決于上皮細胞的遷移能力，在EMT這一過程中，上皮細胞獲得成纖維細胞樣特性并呈現(xiàn)細胞間黏附能力的下降及運動的增加，從而增強了腫瘤細胞的遷移、侵襲能力[9-10]。本研究結果顯示，長期索拉菲尼培養(yǎng)促進了肝癌細胞的耐藥形成，誘導耐藥細胞發(fā)生EMT，這與Chow等[10]研究結果一致。長期索拉菲尼暴露誘導肝癌EMT形成機制尚不明確，可能與PI3K/AKT信號通路激活有關[11]。因此，進一步了解肝癌細胞索拉菲尼耐藥過程中EMT分子調控機制，并進行針對性干預，有望為索拉菲尼耐藥肝癌的治療提供新方向。

Snail通過競爭性結合E-cadherin啟動子區(qū)域E-box連接基序，抑制E-cadherin表達，上調間質標記蛋白N-cadherin表達，從而導致細胞連接減少，促進EMT形成[12-13]。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝癌切除標本中，Snail陽性表達率為56.9%，Slug陽性表達率為51.4%，其中Snail陽性表達患者預后顯著差于陰性表達患者；在細胞水平，Huh7為低水平表達Snail肝癌細胞株，將其過表達Snail后，細胞侵襲及轉移能力顯著增強，而將高水平表達Snail的肝癌細胞株Mahlavu進行Snail基因敲除后其侵襲及轉移能力顯著抑制，進一步研究發(fā)現(xiàn)Snail通過調控EMT標記蛋白表達促進肝癌細胞侵襲及轉移能力。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)Slug高表達與肝癌轉移及患者生存期密切相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)Slug促進sox2及nanog表達，增加腫瘤干性，從而促進肝癌轉移。這些研究結果均支持本研究結論。

綜上所述，長期低劑量索拉菲尼暴露通過促進肝癌細胞Snail、Slug表達，誘導肝癌發(fā)生EMT，進而增強腫瘤細胞侵襲、轉移能力，這一研究結果或在肝癌索拉菲尼耐藥相關預測指標的確定和可能干預靶點篩選等方面有重要的臨床價值和應用前景。

[1]Pascual S,Herrera I,Irurzun J.New advances in hepatocellular carcinoma[J].World J Hepatol,2016,8(9):421-438.

[2]Nishida N,Kitano M,Sakurai T,et al.Molecular Mechanism and Prediction of Sorafenib Chemoresistance in Human Hepatocellular Carcinoma[J].Dig Dis,2015,33(6):771-779.

[3]Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China, 2015[J].CACancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[4]Forner A,Llovet J M,Bruix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet, 2012,379(9822):1245-1255.

[5]Cheng A L,Kang Y K,Chen Z,et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma:a phase III randomised,double-blind, placebo-controlled trial[J].Lancet Oncol,2009,10(1):25-34.

[6]Rimassa L,Santoro A.Sorafenib therapy in advanced hepatocellular carcinoma:the SHARP trial[J].Expert Rev Anticancer Ther, 2009,9(6):739-745.

[7]Chen J,Jin R,Zhao J,et al.Potential molecular,cellular and microenvironmental mechanism of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2015,367(1):1-11.

[8]Ombrato L,MalanchiI.The EMT universe:space between cancer cell dissemination and metastasis initiation[J].Crit Rev Oncog, 2014,19(5):349-361.

[9]Thiery J P,Acloque H,Huang R Y,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.

[10]Chow A K,Ng L,Lam C S,et al.The Enhanced metastatic potential of hepatocellular carcinoma(HCC)cells with sorafenib resistance[J].PLoS One,2013,8(11):e78675.

[11]Thillai K,Ross P,Sarker D.Molecularly targeted therapy for advanced hepatocellular carcinoma-a drug development crisis? [J].World J Gastrointest Oncol,2016,8(2):173-185.

[12]Kaufhold S,Bonavida B.Centralrole of Snail1 in the regulation of EMT and resistance in cancer:a target for therapeutic intervention[J].J Exp Clin Cancer Res,2014,33(1):62.

[13]Lin Y,Dong C,Zhou B P.Epigenetic regulation of EMT:the Snail story[J].Curr Pharm Des,2014,20(11):1698-1705.

[14]Yang M H,Chen C L,Chau G Y,et al.Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009,50(5): 1464-1474.

[15]Zhao X,Sun B,Sun D,et al.Slug promotes hepatocellular cancer cell progression by increasing sox2 and nanog expression [J].OncolRep,2015,33(1):149-156.

Epithelial-mesenchymal transition and migrant/invasion ability in human sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma Huh7 cells

LIU Jun,WANG Qingqing,CAO Haoqiang,et al.Bengbu Medical College,Bengbu 233000,China

ObjectiveTo investigate epithelial-mesenchymal transition(EMT)and migrant/invasion ability in sorafenibresistant human hepatocellular carcinoma cells(Huh7R).MethodsThe Huh7R was induced by long-term exposure to low dose sorafenib.The morphological changes of Huh7R was observed with phase contrast microscopy,the drug sensitivity was evaluated with cytotoxicity cell counting kit-8(CCK-8)assay;the expression of ABC family resistance genes ABCB1,ABCC1, ABCG2,and transcription factor genes Snail,Slug was detected with real-time PCR(RT-PCR),the resistance related protein ABCG2,EMT marker E-cadherin,Vimentin and N-cadherin,transcription factors Snail and Slug was detected with Western blot. Migration and invasion properties of Huh7R cells were assessed using Transwell assays.ResultsPhase contrast microscopy showed that the Huh7R cells were elongated with fibrous projections and the morphological changes were consistent with typical EMT changes.CCK-8 results showed that the Huh7R cells were less sensitive to sorafenib than parental Huh7 cells. Fluorescence quantitative PCR results showed that compared to the parental Huh7 cells,the expression of resistance gene ABCB1,ABCC1 and transcription factor Snail,Slug in Huh7R cells was up-regulated significantly,and Western blot results showed that the expression of ABCG2 protein was significantly increased,the expression of epithelial marker E-cadherin protein was decreased,and the expression of mesenchymal marker protein Vimentin and N-cadherin increased,the expression levels of snail and slug were up-regulated.Transwell invasion assay indicated that Huh7R migration and invasion ability was increased compared with parental cells.Conclusion The results indicate thatlong termexposure tolowdose sorafenib promotes the expression ofsnailand Slug inhumanheparocellularcarcinoma Huh7Rcells,whichmediates EMTand enhances the migrantand invasionabilityof Huh7Rcells.

Hepatocellular carcinomaSorafenibTranscriptionfactor Epithelial mesenchymal transitionDrug resistance

2016-06-24）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-953

浙江省“十二五”基層衛(wèi)生適宜技術成果轉化工程重大項目（2013T301-12、15）；嘉興市科技計劃項目（2013AY21042-5）；嘉興市重點科技創(chuàng)新團隊項目（[2013]3號）

233000安徽，蚌埠醫(yī)學院（劉?。?；嘉興市第一醫(yī)院普外科（王清清、曹浩強、張浩）

張浩，E-mail：changgung1@163.com