劉俊 王清清 曹浩強(qiáng) 張浩

長(zhǎng)期索拉菲尼暴露促進(jìn)Huh7 肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)變的實(shí)驗(yàn)研究

劉俊 王清清 曹浩強(qiáng) 張浩

目的探討索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)變(EMT)及侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的機(jī)制。方法通過(guò)藥物連續(xù)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株Huh7建立索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株Huh7R，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)Huh7R細(xì)胞增殖能力；熒光定量PCR檢測(cè)ABC家族耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2及EMT相關(guān)調(diào)控鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug基因表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)耐藥蛋白ABCG2，EMT標(biāo)記分子E-cadherin、Vimentin及N-cadherin，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug蛋白表達(dá)水平；Transwell小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)Huh7R細(xì)胞遷移、侵襲能力。結(jié)果Huh7R細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)形，伴纖維狀突起，形態(tài)學(xué)上符合EMT改變；CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示在索拉菲尼作用下，Huh7R細(xì)胞生存率高于Huh7細(xì)胞；熒光定量PCR結(jié)果顯示，Huh7R細(xì)胞ABCB1、ABCC1、ABCG2及Snail、Slug基因表達(dá)水平均高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05）；Western blot顯示，Huh7R細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)水平低于Huh7細(xì)胞（P＜0.05），而間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimenti、N-cadherin及Snail、Slug蛋白表達(dá)水平均高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05）；Transwell小室侵襲試驗(yàn)顯示Huh7R細(xì)胞遷移、侵襲能力均較Huh7細(xì)胞增強(qiáng)。結(jié)論長(zhǎng)期低劑量索拉菲尼暴露會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞Snail和Slug表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

肝癌 索拉菲尼 轉(zhuǎn)錄因子 上皮間質(zhì)變 耐藥

索拉菲尼是目前唯一有效且被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于中晚期肝癌治療的分子靶向藥物[1]。研究表明，長(zhǎng)期低劑量索拉菲尼暴露造成的繼發(fā)性耐藥會(huì)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力。ABC家族耐藥基因與肝癌繼發(fā)性耐藥相關(guān)，ABCG2、ABCB1和ABCC1基因?qū)倨浼易宄蓡T，編碼的蛋白可參與肝癌細(xì)胞內(nèi)靶向藥物的分布，改變藥物的作用靶點(diǎn)，促進(jìn)藥物外排。上皮間質(zhì)變（EMT）是指上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)、成纖維樣特征，細(xì)胞間的黏附能力降低，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性能增強(qiáng)。EMT被認(rèn)為是肝癌細(xì)胞發(fā)生索拉菲尼耐藥及遷移、侵襲能力增強(qiáng)的主要原因[2]。Snail、Slug基因?qū)儆阡\指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Snail基因家族成員，參與調(diào)控EMT。目前索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制尚不明確?；诖耍狙芯窟\(yùn)用實(shí)驗(yàn)室研究方法探討索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT及遷移、侵襲能力增強(qiáng)的機(jī)制，以期為肝癌的靶向治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料甲苯磺酸索拉菲尼片購(gòu)自德國(guó)Bayer公司；Huh7人肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；FBS、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；用于熒光定量PCR的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）購(gòu)自日本Takara公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（cell counting kit-8,CCK-8）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；用于Western blot試驗(yàn)抗體（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ABCG2及GAPDH）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 配制索拉菲尼藥液將甲苯磺酸索拉菲尼1片（200mg）溶于15.7ml無(wú)菌DMSO中，配制成濃度為2× 104mol/L的索拉菲尼貯藏液,分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將Huh7置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)，密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 建立索拉菲尼耐藥肝癌細(xì)胞株（sorafenib resistant Huh7 cells,Huh7R）采用索拉菲尼連續(xù)誘導(dǎo)、逐步增加藥物濃度的方法篩選耐藥細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，起始藥物濃度為2μmol/L，低濃度持續(xù)誘導(dǎo)1～2個(gè)月，繼續(xù)增加索拉菲尼藥物濃度至最大耐受濃度，總誘導(dǎo)周期為6個(gè)月，獲得Huh7R。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力調(diào)制8種不同濃度索拉菲尼藥液（0、1、2、4、6、8、10、12μmol/L），Huh7、Huh7R各設(shè)實(shí)驗(yàn)組（不同濃度索拉菲尼+細(xì)胞+DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）、對(duì)照組（細(xì)胞+DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）和空白組（DMEM培養(yǎng)液+CCK8試劑）。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔5×103個(gè)/100μl的細(xì)胞密度接種于96孔板培養(yǎng)，孵育過(guò)夜，除去舊培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度索拉菲尼含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液，孵育48h；按1∶10體積比例配制CCK-8試劑和DMEM培養(yǎng)液，每孔加入100μl，孵育1h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，記錄結(jié)果；計(jì)算在索拉菲尼作用后的細(xì)胞生存率[細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）/（對(duì)照組A值－空白組A值）]，并計(jì)算出其半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)ABC家族耐藥基因及Snail、Slug基因表達(dá)水平Huh7R細(xì)胞于提取前予以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，Huh7、Huh7R各加入Trizol抽提細(xì)胞總RNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和質(zhì)量；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明將1 000ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后將cDNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃變性5s，60℃退火3s，72℃延伸10s后進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析熔解曲線和擴(kuò)增曲線。用2-ΔΔCt方法對(duì)Huh7、Huh7R細(xì)胞基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 各基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)記蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）、轉(zhuǎn)錄因子蛋白（Snail和Slug蛋白）及耐藥蛋白（ABCG2蛋白）表達(dá)水平Huh7R于提取前予以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，配制蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的混合液，加入待檢測(cè)細(xì)胞并于冰上放置30min，12 000r/min 4℃條件下離心15min，取其上清液，蛋白定量；加入5× SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，-20℃保存?zhèn)溆?；每孔加?0～30μl目的蛋白樣品，將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）在60V電壓下電泳，然后在300 mA電流下濕轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST漂洗15min×3次，加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1h，PBST漂洗15min×3次，加入ECL發(fā)光劑后顯影拍照，以與GAPDH的灰度值代表蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 Transwell小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7、Huh7R細(xì)胞消化離心后加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液吹打均勻，取5×104個(gè)/100μl細(xì)胞加入小室上層，下層加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液；孵育48h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%結(jié)晶紫染色2h，用棉簽拭去上室細(xì)胞；100倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值。侵襲試驗(yàn)是將50mg/L的Matrigel膠4℃融化，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液將其1∶8稀釋混勻，取100 μl放于小室上層，其余步驟和遷移實(shí)驗(yàn)一樣。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Huh7、Huh7R細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較見(jiàn)圖1。

圖1 Huh7、Huh7R細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（×100）

由圖1可見(jiàn)，Huh7細(xì)胞是分化較好的人源性上皮來(lái)源肝癌細(xì)胞，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈現(xiàn)多邊形簇集生長(zhǎng)；Huh7R細(xì)胞則呈細(xì)長(zhǎng)形，伴纖維狀突起，形態(tài)學(xué)上改變符合EMT改變。

2.2 索拉菲尼作用下Huh7、Huh7R細(xì)胞生存率比較見(jiàn)圖2。

圖2 Huh7與Huh7R細(xì)胞生存率比較

由圖2可見(jiàn)，隨著索拉菲尼藥物濃度的升高，Huh7、Huh7R細(xì)胞生存率均呈下降趨勢(shì)。除1μmol/L索拉菲尼作用濃度外，在2、4、6、8、10、12μmol/L作用濃度時(shí)，Huh7R細(xì)胞生存率均明顯高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05），同時(shí)可以觀察到Huh7R細(xì)胞的IC50（6.38μmol/L）明顯高于Huh7細(xì)胞（3.71μmol/L）。

2.3 Huh7、Huh7R細(xì)胞ABC家族耐藥基因表達(dá)水平及ABCG2蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)表2、圖3、表3。

表2 Huh7、Huh7R細(xì)胞ABC家族耐藥基因表達(dá)水平比較

圖3 Huh7、Huh7R細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)條帶圖比較

表3 Huh7、Huh7R細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)水平比較

由表2可見(jiàn)，Huh7R細(xì)胞ABCB1、ABCC1、ABCG2基因表達(dá)水平均高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05）。由圖3、表3可見(jiàn)，Huh7R細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)水平高于Huh7細(xì)胞（P＜0.05）。2.4Huh7、Huh7R細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白及Snail、Slug蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖4、表4。

圖4 Huh7、Huh7R細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白及Snail、Slug蛋白表達(dá)條帶圖比較

表4 Huh7、Huh7R細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白及Snail、Slug蛋白表達(dá)水平比較

由圖4、表4可見(jiàn)，Huh7R細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)水平低于Huh7細(xì)胞（P＜0.05），而間質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05）。同時(shí)，Huh7R細(xì)胞Snail、Slug蛋白表達(dá)水平均高于Huh7細(xì)胞（均P＜0.05）。

2.5 Huh7、Huh7R細(xì)胞遷移、侵襲能力比較見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，Huh7R細(xì)胞黏附于下室面的細(xì)胞數(shù)量明顯多于Huh7細(xì)胞，表現(xiàn)出更高的遷移、侵襲能力。

3 討論

圖5 Huh7、Huh7R細(xì)胞遷移、侵襲能力比較（結(jié)晶紫染色，×100）

肝癌是國(guó)人最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第6位，病死率居第3位[3]。手術(shù)雖然是肝癌治療的最有效方法，但由于肝癌惡性程度高，且大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，喪失了手術(shù)治療機(jī)會(huì)。索拉菲尼是目前唯一對(duì)于無(wú)法手術(shù)治療的中晚期肝癌有效的治療藥物。研究指出，對(duì)于肝功能Child A級(jí)患者，索拉菲尼治療組較安慰劑治療組平均延長(zhǎng)約3個(gè)月生存期[4-6]，這一治療效果給本已陷入無(wú)藥可用、無(wú)計(jì)可施的中晚期肝癌患者帶來(lái)重大希望。但也有研究顯示，長(zhǎng)期低劑量索拉菲尼暴露會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生索拉菲尼耐藥[7-8]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期低劑量索拉菲尼暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞Snail、Slug表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，耐藥性增加，侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)水平下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白N-cadherin表達(dá)水平升高，從而使具有極性的上皮表型細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞骨架重塑，上皮細(xì)胞失去它們的上皮特性，獲得更多的遷移間質(zhì)細(xì)胞樣特性。腫瘤侵襲性取決于上皮細(xì)胞的遷移能力，在EMT這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞樣特性并呈現(xiàn)細(xì)胞間黏附能力的下降及運(yùn)動(dòng)的增加，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力[9-10]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期索拉菲尼培養(yǎng)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的耐藥形成，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT，這與Chow等[10]研究結(jié)果一致。長(zhǎng)期索拉菲尼暴露誘導(dǎo)肝癌EMT形成機(jī)制尚不明確，可能與PI3K/AKT信號(hào)通路激活有關(guān)[11]。因此，進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞索拉菲尼耐藥過(guò)程中EMT分子調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，有望為索拉菲尼耐藥肝癌的治療提供新方向。

Snail通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域E-box連接基序，抑制E-cadherin表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞連接減少，促進(jìn)EMT形成[12-13]。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝癌切除標(biāo)本中，Snail陽(yáng)性表達(dá)率為56.9%，Slug陽(yáng)性表達(dá)率為51.4%，其中Snail陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后顯著差于陰性表達(dá)患者；在細(xì)胞水平，Huh7為低水平表達(dá)Snail肝癌細(xì)胞株，將其過(guò)表達(dá)Snail后，細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，而將高水平表達(dá)Snail的肝癌細(xì)胞株Mahlavu進(jìn)行Snail基因敲除后其侵襲及轉(zhuǎn)移能力顯著抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Snail通過(guò)調(diào)控EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)Slug高表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移及患者生存期密切相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Slug促進(jìn)sox2及nanog表達(dá)，增加腫瘤干性，從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果均支持本研究結(jié)論。

綜上所述，長(zhǎng)期低劑量索拉菲尼暴露通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞Snail、Slug表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，這一研究結(jié)果或在肝癌索拉菲尼耐藥相關(guān)預(yù)測(cè)指標(biāo)的確定和可能干預(yù)靶點(diǎn)篩選等方面有重要的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Epithelial-mesenchymal transition and migrant/invasion ability in human sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma Huh7 cells

LIU Jun,WANG Qingqing,CAO Haoqiang,et al.Bengbu Medical College,Bengbu 233000,China

ObjectiveTo investigate epithelial-mesenchymal transition(EMT)and migrant/invasion ability in sorafenibresistant human hepatocellular carcinoma cells(Huh7R).MethodsThe Huh7R was induced by long-term exposure to low dose sorafenib.The morphological changes of Huh7R was observed with phase contrast microscopy,the drug sensitivity was evaluated with cytotoxicity cell counting kit-8(CCK-8)assay;the expression of ABC family resistance genes ABCB1,ABCC1, ABCG2,and transcription factor genes Snail,Slug was detected with real-time PCR(RT-PCR),the resistance related protein ABCG2,EMT marker E-cadherin,Vimentin and N-cadherin,transcription factors Snail and Slug was detected with Western blot. Migration and invasion properties of Huh7R cells were assessed using Transwell assays.ResultsPhase contrast microscopy showed that the Huh7R cells were elongated with fibrous projections and the morphological changes were consistent with typical EMT changes.CCK-8 results showed that the Huh7R cells were less sensitive to sorafenib than parental Huh7 cells. Fluorescence quantitative PCR results showed that compared to the parental Huh7 cells,the expression of resistance gene ABCB1,ABCC1 and transcription factor Snail,Slug in Huh7R cells was up-regulated significantly,and Western blot results showed that the expression of ABCG2 protein was significantly increased,the expression of epithelial marker E-cadherin protein was decreased,and the expression of mesenchymal marker protein Vimentin and N-cadherin increased,the expression levels of snail and slug were up-regulated.Transwell invasion assay indicated that Huh7R migration and invasion ability was increased compared with parental cells.Conclusion The results indicate thatlong termexposure tolowdose sorafenib promotes the expression ofsnailand Slug inhumanheparocellularcarcinoma Huh7Rcells,whichmediates EMTand enhances the migrantand invasionabilityof Huh7Rcells.

Hepatocellular carcinomaSorafenibTranscriptionfactor Epithelial mesenchymal transitionDrug resistance

2016-06-24）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-953

浙江省“十二五”基層衛(wèi)生適宜技術(shù)成果轉(zhuǎn)化工程重大項(xiàng)目（2013T301-12、15）；嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013AY21042-5）；嘉興市重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（[2013]3號(hào)）

233000安徽，蚌埠醫(yī)學(xué)院（劉?。患闻d市第一醫(yī)院普外科（王清清、曹浩強(qiáng)、張浩）

張浩，E-mail：changgung1@163.com